胡 平，關(guān)文怡，雷莉輝，蔡澤川

北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442

抗生素的使用在養(yǎng)殖業(yè)中不可避免，研究表明，真正參與動(dòng)物新陳代謝而被利用的抗生素僅占用藥總量很少的比例，而大部分抗生素則隨著動(dòng)物糞便和尿液直接排出體外，隨糞尿排出體外的還包括在動(dòng)物腸道內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的帶有抗性基因的菌株[1-4]。動(dòng)物糞便中含有抗性基因的菌株成為了土壤和地下水中重要的抗性基因污染源[5]。研究表明，抗性基因除了可以在動(dòng)物的腸道菌群之間傳播，還會(huì)在進(jìn)入土壤后與土壤中的微生物之間發(fā)生傳播[6]。通過(guò)基因的橫向轉(zhuǎn)移，抗性基因在土壤、水源、空氣等環(huán)境介質(zhì)中遷移轉(zhuǎn)化，并在生存選擇中逐漸增加豐度，當(dāng)這些抗性基因隨著食物鏈進(jìn)入人體時(shí)，就增加了人體的抗生素耐藥性[7]。為了減少奶牛蹄病發(fā)生，奶牛運(yùn)動(dòng)場(chǎng)地面通常使用三合土或部分鋪設(shè)透水磚，隨著沖洗用水和降雨等沖刷作用，糞便與尿液中殘留的抗生素與微生物逐漸滲透進(jìn)入土壤并向周?chē)饾u擴(kuò)散，造成養(yǎng)殖場(chǎng)糞便中抗生素抗性基因在環(huán)境中的富集與傳播。因此，研究土壤中抗性基因分布情況對(duì)減少抗生素的濫用和耐藥菌株的產(chǎn)生具有重要意義。本試驗(yàn)通過(guò)采集北京市某區(qū)規(guī)?；膛＿\(yùn)動(dòng)場(chǎng)土壤對(duì)抗性基因進(jìn)行宏基因組分析，旨在找出奶牛場(chǎng)抗性基因分布情況，并指導(dǎo)抗生素使用。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理

試驗(yàn)樣本采集自北京市某規(guī)?；膛＿\(yùn)動(dòng)場(chǎng)內(nèi)，共計(jì)12 份土壤樣本。按照采樣部位不同分為3組，CTN（1-4）為運(yùn)動(dòng)場(chǎng)中心位置土壤樣本，CBH（1-4）為運(yùn)動(dòng)場(chǎng)圍欄外0.5 m 土壤樣本，CB2M（1-4）為運(yùn)動(dòng)場(chǎng)外2 m 土壤樣本。所有土壤樣本均采集自距地表0～20 cm 深度的松軟土壤，采用滅菌鏟子取樣，封裝于滅菌樣本管中。所有樣本均置于干冰盒中迅速轉(zhuǎn)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中保存待檢。

1.2 總基因組DNA 提取與建庫(kù)測(cè)序

將土壤樣本按照PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio Laboratories，Carlsbad，CA）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行微生物組DNA 提取。然后用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法檢測(cè)DNA 質(zhì)量和濃度。質(zhì)檢合格的DNA 樣品用Covaris 超聲波破碎儀將基因組DNA 隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度約300 bp 的小片段，經(jīng)純化、PCR 擴(kuò)增等步驟完成文庫(kù)制備。使用Qubit 初步定量構(gòu)建完成的文庫(kù)，然后使用Agilent 2100 檢測(cè)文庫(kù)的插入片段，符合預(yù)期后使用Q-PCR 法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫(kù)有效濃度＞3 nmol/L）。最后把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求進(jìn)行pooling，在Illumina HiSeq4000 平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

原始數(shù)據(jù)使用Trimmomatic 軟件進(jìn)行系列質(zhì)控，將質(zhì)控后得到的高質(zhì)量序列clean reads 使用DIAMOND BLASTX 算法進(jìn)行比對(duì)和物種注釋。用組裝軟件MEGAHIT（v1.0.6）對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，過(guò)濾組裝結(jié)果中500 bp 以下的片段。采用Prodigal 軟件對(duì)組裝得到的contig 序列進(jìn)行ORF（open reading frame）預(yù)測(cè)，使用CD-HIT 軟件對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)果去冗余，從而得到非冗余基因集。采用Bowtie 軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)與構(gòu)建的非冗余基因集進(jìn)行比對(duì)，并統(tǒng)計(jì)單個(gè)基因在不同樣本的豐度信息。將預(yù)測(cè)得到的非冗余基因集與功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù)nr、Swiss-Prot、Kegg、Cog/Kog、eggNOG、GO、Pfam、ARDB/CARD、CAZyme 進(jìn)行比對(duì)和注釋。

1.4 前期研究基礎(chǔ)

本試驗(yàn)前期通過(guò)宏基因組測(cè)序?qū)υ撃膛＿\(yùn)動(dòng)場(chǎng)土壤和糞便微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，測(cè)序結(jié)果表明變形菌門(mén)和放線菌門(mén)在土壤中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)為土壤中的優(yōu)勢(shì)真菌，奇古菌門(mén)和廣古菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)古菌群落。在新鮮糞便中厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌；優(yōu)勢(shì)真菌群落為擔(dān)子菌門(mén)、毛霉門(mén)和壺菌門(mén)。土壤中微生物豐度見(jiàn)表1。

表1 宏基因組測(cè)序分析土壤中微生物豐度排名

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)組裝與分析

通過(guò)宏基因組測(cè)序，3 個(gè)組12 個(gè)樣本中，總計(jì)獲得343 850 519 條clean reads，每個(gè)樣本的reads數(shù)范圍在16 632 548～25 716 812 條，組裝后的總contigs 長(zhǎng)度超過(guò)1 000 bp 的為778 998，N50 為893 bp，L50 為989 937 bp，表明組裝的結(jié)果較好，序列長(zhǎng)度可用。

2.2 運(yùn)動(dòng)場(chǎng)土壤樣本中ARGs 多樣性

通過(guò)宏基因組檢測(cè)及CARD 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋?zhuān)?個(gè)分組的12 個(gè)樣本中，占比前10 的抗性基因?yàn)锳RO:3000501、ARO:3004480、ARO:3000804、ARO:3000444、ARO:3002983、ARO:3003318、ARO:3004144、ARO:3003031、ARO:3003923、ARO:003010。其 中，ARO:3000501 在CB2M 組中占比為29.67%，在CBH組占比為28.29%，在CTN 組占比為32.67%；ARO:3004480 在CB2M 組占比為16.49%，在CBH 組占比為28.96%，在CTN 組占比為19.87%；ARO:3000804 在CB2M 中占比為9.69%，在CBH 中占比為4.84，在CTN 中占比為13.46%；ARO:3000444 在CB2M 組占比為5.67%，在CBH 組占比為4.61%，在CTN 占比為6.80%；ARO:3002983 在CB2M 占比為5.08%，在CBH 占比為7.22%，在CTN 占比為2.13%；ARO:3004144 在CB2M 占比為4.78%，在CBH 占比為3.81%，在CTN 占比為7.24%；其余抗性基因在各組占比都低于5%（圖1、圖2）。

2.3 CRAD 注釋的前13 位抗性基因

通過(guò)分析抗生素抗性基因檢出率發(fā)現(xiàn)，土壤中抗性基因檢出率最高的是rpoB2 和rpoB，在CRAD注釋為利福霉素抗性基因，耐藥菌為諾卡氏菌屬和雙歧桿菌屬。其次是MexF和MexW，注釋為苯丙醇類(lèi)、二氨基嘧啶、氟喹諾酮、四環(huán)素類(lèi)、吖啶染料、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，顯示了多重耐藥特點(diǎn)，耐藥菌株主要為銅綠假單胞菌。此外值得注意的是抗性基因mexQ、oqxB、MuxC和MexK都顯示為多重耐藥性，主要耐藥菌株為肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和伯克氏菌等。此外rphA和oleB分別顯示了多重耐藥性，但是在CARD 注釋中未有報(bào)告，顯示了上述2個(gè)抗性基因可能是少見(jiàn)但容易被忽略的多重耐藥基因，其中攜帶oleB的耐藥菌株可能導(dǎo)致大部分G+球菌發(fā)生廣泛耐藥（表2）。

表2 運(yùn)動(dòng)場(chǎng)土壤抗性基因與抗生素類(lèi)別

續(xù)表2

2.4 Lefse 分析組間差異抗性基因

通過(guò)LDA 閾值3 篩選3 組樣本之間的差異基因，結(jié)果顯示，在CB2M 組中顯著高于其他組的抗性基因主要有以下12 個(gè)：parY、oqxB、MexW、MexI（ARO:3000808）、MexK、aadA11（ARO:3002611）、cmlR（ARO:3002690）、mexQ、mexX（ARO:3003034）、smeR（ARO:3003066）、aadA6（ARO:3002606）、CpxR（ARO:3004054）。

在CBH 組中顯著高于其他組的抗性基因主要有以下10 個(gè)：利福霉素耐藥雙歧桿菌rpoB突變株（ARO:3004480）、amrB、oleB、vanRO（ARO:3002930）、MexB（ARO:3000378）、ceoB、NovA（ARO:3002522）、MuxC（ARO:3004075）、tlrC（ARO:3002827）、muxB（ARO:3004074）。

在CTN 組中顯著高于其他組的抗性基因主要有 以 下5 個(gè)：MexF（ARO:3000804）、rphA、AxyY、MexD（ARO:3000801）、oleC（ARO:3003748）（圖3）。

2.5 抗性基因circlize 分析

基因抗性基因的注釋結(jié)果，選取Top10 的抗性基因進(jìn)行circlize 分析（圖4）：圖4 上半圓顯示的是樣本名稱，下半圓為各個(gè)樣本對(duì)應(yīng)的抗性基因，從圖4 可以看出不同抗性基因在每個(gè)樣本中的豐度情況。

3 討 論

3.1 運(yùn)動(dòng)場(chǎng)不同位置土壤中抗性基因分布情況

通過(guò)對(duì)奶牛運(yùn)動(dòng)場(chǎng)3 個(gè)不同位置CB2M、CBH和CTN 的土壤宏基因組分析可見(jiàn)，從運(yùn)動(dòng)場(chǎng)中心向運(yùn)動(dòng)場(chǎng)外的土壤中，隨著與運(yùn)動(dòng)場(chǎng)中心點(diǎn)半徑增大，其相應(yīng)的土壤中抗性基因數(shù)量也顯著增多。其中，CB2M 組檢出率最高的抗性基因是parY，CBH組檢出率最高的抗性基因是rpoB，CTN 組檢出率最高的抗性基因是MexF。分析該結(jié)果可能的原因是，奶牛場(chǎng)排泄物中攜帶的抗生素殘留物以及奶牛消化道中攜帶抗性基因的耐藥菌隨著糞便和尿液逐漸滲透進(jìn)入運(yùn)動(dòng)場(chǎng)的土壤中，并隨著滲透與沖刷向外擴(kuò)散。因?yàn)橥寥篮统练e物是固體物質(zhì)，密度較大、流動(dòng)較慢，容易發(fā)生富集作用，造成抗生素更易在土壤中富集和持久傳播，從而脅迫土壤中原有的土著微生物產(chǎn)生耐藥性[8]。

有報(bào)道稱施用過(guò)奶牛和豬糞的土壤中，以低G+C 革蘭氏陽(yáng)性硬壁菌和高G+C 革蘭氏陽(yáng)性放線菌占主導(dǎo)地位，尤其是鏈霉菌屬占主導(dǎo)地位[9]。這與本次試驗(yàn)中統(tǒng)計(jì)的CB2M 檢出率最高的parY抗性基因相一致。不同的國(guó)家和地區(qū)施用過(guò)奶牛糞便的土壤中優(yōu)勢(shì)菌種也有區(qū)別[10-12]，但從各項(xiàng)研究均可看出糞便污染的土壤中都含有大量抗生素抗性細(xì)菌和抗性基因，對(duì)環(huán)境中的耐藥菌株產(chǎn)生都有重要的意義。

3.2 奶牛運(yùn)動(dòng)場(chǎng)土壤中抗性基因菌群分析

由圖4 觀察可見(jiàn)，3 組土壤樣本中排名前10 位的 抗 性 基 因 為rpoB2、rpoB、MexF、rphA、amrB、AxyY、streptomyces、mexW、oqxB、ceoB，對(duì)應(yīng)的耐藥菌株分別為諾卡氏菌屬、雙歧桿菌屬、銅綠假單胞菌、不溶性無(wú)色桿菌、鏈霉菌屬、肺炎克雷伯菌等。

rpoB是來(lái)源于雙歧桿菌的抗性基因。雙歧桿菌是耐抗生素的益生菌，是腸道的有益菌群，然而腸道微生物之間的水平基因轉(zhuǎn)移可能產(chǎn)生有害的耐藥菌株，如結(jié)核分枝桿菌。Dhanashree 等[13]分析了雙歧桿菌抗結(jié)核藥物耐藥和rpoB突變，研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和青少年雙歧桿菌對(duì)吡嗪酰胺、異煙肼和鏈霉素表現(xiàn)出相當(dāng)大的耐藥性，而青少年雙歧桿菌在利福霉素袋和袋外區(qū)域都有突變，并且對(duì)利福霉素也表現(xiàn)出相當(dāng)大的耐藥性。由于基因重復(fù)，諾卡氏菌的基因組包括對(duì)利福平敏感的RNA 聚合酶β 亞單位（rpoB）和對(duì)利福平耐藥的RNA 聚合酶β 亞單位（rpoB）基因，2 種基因產(chǎn)物之間約有88%的相似性。rpoB變體的表達(dá)導(dǎo)致利福平敏感性被利福平耐藥性取代[14]。

MexF 是MexEF-OprN 復(fù)合物的多藥內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體。mexF對(duì)應(yīng)于銅綠假單胞菌PAO1 中的2 個(gè)位點(diǎn)（基因名稱：mexF/mexB）和銅綠假單胞菌LESB58 中的4 個(gè)位點(diǎn)（基因名稱：mexD/mexB）。MexW 是外排復(fù)合物MexEF-OprN 的RND 型膜蛋白，具有廣泛的耐藥性。攜帶該突變基因的銅綠假單胞菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生多重耐藥，如苯丙醇類(lèi)、二氨基嘧啶、氟喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、吖啶染料、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)[15]。

amrB 是AmrAB-OprM 多藥外排復(fù)合物的膜融合蛋白，具有該抗性基因的類(lèi)鼻疽伯克氏菌，銅綠假單胞菌具有抗生素外排泵，從而對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素發(fā)生耐藥。

AxyY 是無(wú)色桿菌AxyXY-OprZ 外排泵系統(tǒng)的周質(zhì)銜接蛋白，具有該抗性基因的不溶色桿菌、木糖氧化酶無(wú)色桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、阪崎克龍桿菌、肺炎克雷伯菌通過(guò)抗生素外排泵，對(duì)多種抗生素如大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、頭孢菌素、氨基糖苷類(lèi)和氟喹諾酮產(chǎn)生多重耐藥性。

oqxB是對(duì)氟喹諾酮耐藥的RND 外排泵，具有該抗性基因的弗氏檸檬酸桿菌、霍瑪腸桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、腸沙門(mén)氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌等菌株對(duì)多種抗生素如四環(huán)素類(lèi)、甘氨酰環(huán)素、硝基呋喃類(lèi)、二氨基嘧啶類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)產(chǎn)生多重耐藥性[16]。

3.3 奶牛場(chǎng)耐藥情況分析

通過(guò)本試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，該奶牛運(yùn)動(dòng)場(chǎng)土壤中存在大量抗性基因分布，耐藥菌包括諾卡式菌屬、鏈霉菌屬、銅綠假單胞菌、雙歧桿菌屬、肺炎克雷伯菌等。其中，諾卡氏菌屬、銅綠假單胞菌感染常與嚴(yán)重的奶牛乳房炎有關(guān)[17-19]。銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌，是引起奶牛乳房炎的重要致病菌之一。在本試驗(yàn)的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)奶牛場(chǎng)綠膿桿菌多個(gè)抗性基因，具有多重耐藥菌株出現(xiàn)。此外，本奶牛場(chǎng)出現(xiàn)對(duì)利福霉素顯著耐藥的抗性基因，利福霉素是治療奶牛子宮內(nèi)膜炎常用的抗生素種類(lèi)，隨著利福霉素類(lèi)抗生素使用量的增加，該奶牛場(chǎng)土壤中抗利福霉素的抗性基因逐漸富集[20]。

4 結(jié) 論

通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，該奶牛場(chǎng)土壤中利福霉素、苯丙醇類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)抗生素抗性基因數(shù)量多，說(shuō)明該牛場(chǎng)對(duì)這幾類(lèi)抗菌藥物已經(jīng)產(chǎn)生了較明顯的耐藥性，建議減少上述抗菌藥物的使用，并應(yīng)根據(jù)抗性基因情況選擇其他有效替代藥物，從而減少抗生素濫用，降低對(duì)環(huán)境中微生物的脅迫，減少超級(jí)耐藥菌株的產(chǎn)生幾率。