杜 青， 陳 林*， 賀 煒， 勞 嘉， 蔡 媛， 黃建華

(1.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，湖南 長沙 410013；2.綠之韻生物工程集團有限公司，湖南 長沙 410329)

黃精Polygonatumsibiricum是多年生黃精屬百合科的一種藥食同源草本植物，主要以根莖入藥，具有補中益氣、滋潤心肺、強壯筋骨等功效[1]。黃精中含有多種化學成分，包括多糖、黃酮、皂苷、生物堿、氨基酸、木質(zhì)素、揮發(fā)油等，其中，黃精多糖是其主要活性成分之一，含量約占14%[2]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃精多糖具有降血糖、抗氧化、肝保護、抗腫瘤、提升免疫等多種作用[3]。無論是藥物還是保健食品研究領域，多糖的免疫調(diào)節(jié)作用一直是研究的熱點之一，常被用作免疫調(diào)節(jié)劑。目前，關于黃精多糖對機體的免疫提升作用及機制至今尚未明確。巨噬細胞是機體重要的固有免疫細胞，具有抗原呈遞性，無論是在先天免疫應答還是在適用性免疫中都起著非常重要的作用，是機體抵御外界抗原入侵的第一道防線[4]。巨噬細胞表面存在多種受體，可與植物多糖結(jié)合后活化，并分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和一氧化氮(NO)等細胞因子，以抵御外來刺激，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[5]。本研究主要針對黃精多糖對小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7的免疫活性調(diào)節(jié)作用及機制，為黃精資源的高效利用及黃精多糖的產(chǎn)品開發(fā)和利用提供一定理論基礎。

1 材料

1.1 細胞 RAW264.7細胞株，購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物 黃精購自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，準確稱取黃精樣品粉末(過3號篩)，先用石油醚除去色素等雜質(zhì)后烘干，按料液比1∶15加入純水，于90 ℃水浴鍋中加熱回流1 h，提取2次，離心得到提取液，合并2次提取液，加入無水乙醇至終體積分數(shù)80%，搖勻后靜置12 h，離心收集沉淀，經(jīng)冷凍干燥得到黃精粗多糖，進一步采用sevage法去除蛋白，得到純化的多糖。經(jīng)過分析測定，總糖含量為82.3%。

1.3 試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、FBS(美國Gibco公司，批號8119002、42F0266K)；LPS(美國Sigma公司，批號C59M4173V)，CCK8、TNF-α一抗、IL-6一抗、iNOS一抗(北京博奧森生物技術有限公司，批號A10801411T、A101286265、A107319225、A101177400)；NO、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號20190816)；FITC標記二抗(武漢三鷹生物技術有限公司，批號SA00003-2)。

1.4 儀器 XDS-3型倒置顯微鏡(廣州粵顯光學儀器有限責任公司)；HERACe型CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Enspire型多功能酶標儀、OPERETTA型高內(nèi)涵細胞成像分析系統(tǒng)(美國Perkinelmer公司)；LSM800型激光共聚焦顯微鏡(德國蔡司公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) RAW 264.7細胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基(其中含10%FBS和1%雙抗)于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d換液1次，并以1∶3比例傳代培養(yǎng)。

2.2 CCK8法檢測細胞活力 待RAW 264.7細胞生長至70%～80%融合程度時，用0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細胞密度至5×103/mL，接種于96孔板中，培養(yǎng)18 h，設置31.25、62.5、125、250、500 μg/mL 5個質(zhì)量濃度黃精多糖組，另設正常組，每組4個復孔。待細胞充分貼壁后，棄掉孔內(nèi)液體，正常組加入200 μL培養(yǎng)液，給藥組加入200 μL含相應質(zhì)量濃度藥物的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄掉孔內(nèi)液體，每孔加入完全培養(yǎng)基180 μL和CCK8溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔光密度(OD)值，以正常組為對照，計算各組細胞的相對存活率。

2.3 細胞分組、給藥及形態(tài)學觀察 取對數(shù)期生長的RAW 264.7細胞，以5×103/mL密度接種于96孔板中，培養(yǎng)18 h，隨機分成正常組，LPS(1.0 μg/mL)組，黃精多糖250、62.5 μg/mL組，每組設置3個復孔，正常組加入200 μL培養(yǎng)液，其余各組加入200 μL含相應質(zhì)量濃度藥物的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察各組細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

2.4 ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-6、NO水平 收集各組細胞上清液，3 000 r/min離心15 min，取上清液，參照TNF-α、IL-6、NO ELISA試劑盒說明書，檢測各組細胞上清液中TNF-α、IL-6、NO水平。

2.5 HAC法檢測TNF-α、IL-6、iNOS蛋白表達 各組細胞培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定45 min，0.25% Triton-100處理15 min，5% BSA封閉15 min，分別加入兔抗小鼠iNOS、TNF-α、IL-6一抗稀釋液(1∶100～1∶200)，4 ℃避光孵育過夜，加入FITC標記的山羊抗兔稀釋液(1∶400)，37 ℃避光孵育30 min，加入DAPI稀釋液，室溫避光孵育15 min，最后使用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)進行熒光檢測并拍照，并以細胞平均熒光強度值反映各蛋白相對表達。

2.6 RT-qPCR法檢測TNF-α、IL-6、iNOSmRNA表達 將RAW 264.7細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，靜置培養(yǎng)18～24 h，按“2.3”項下方法進行分組、給藥，培養(yǎng)24 h，棄掉孔內(nèi)液體，PBS洗2次，加入TRIzol試劑4 ℃處理60 min，然后轉(zhuǎn)移至EP管中進行總RNA的抽提，并以總mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行real-time PCR檢測，實驗結(jié)果采用2-ΔΔCT法，以β-actin為內(nèi)參，計算目的基因(iNOS、TNF-α、IL-6)相對表達。引物序列見表1[6]。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 黃精多糖對RAW 264.7細胞活力的影響 與正常組比較，隨著黃精多糖質(zhì)量濃度的增加，細胞活性先升高后降低，在62.5 μg/mL時最高(P<0.01)，而500 μg/mL黃精多糖則抑制細胞生長(P<0.01)。因此，本實驗選擇質(zhì)量濃度31.25～200 μg/mL范圍內(nèi)的劑量進行后續(xù)研究，見圖1。

注：與正常組比較，**P<0.01。

3.2 黃精多糖對RAW 264.7細胞形態(tài)的影響 與正常組比較，黃精多糖62.5、250 μg/mL組和LPS組巨噬細胞由類圓形變成激活態(tài)的不規(guī)則梭形或多角形，見圖2。

圖2 RAW 264.7細胞形態(tài)的變化(×100)

3.3 黃精多糖對RAW 264.7細胞TNF-α、IL-6、NO分泌的影響 與正常組比較，黃精多糖62.5、250 μg/mL組和LPS組細胞上清液中NO、TNF-α、IL-6水平均升高(P<0.05，P<0.01)，其中尤以250 μg/mL黃精多糖及LPS組作用最為顯著，提示黃精多糖能不同程度刺激免疫炎癥因子釋放，見圖3。

3.4 黃精多糖對RAW 264.7細胞TNF-α、IL-6、iNOS蛋白表達的影響 與正常組比較，黃精多糖62.5、250 μg/mL組和LPS組細胞內(nèi)TNF-α、IL-6、iNOS蛋白熒光強度增強(P<0.05，P<0.01)，其中尤以黃精多糖250 μg/mL組增加最為明顯，提示黃精多糖能刺激炎癥因子相關蛋白TNF-α、IL-6、iNOS表達增加，見圖4。

3.5 黃精多糖對RAW 264.7細胞TNF-α、IL-6、iNOSmRNA表達的影響 與正常組比較，黃精多糖上調(diào)了細胞中TNF-α、IL-6、iNOSmRNA表達(P<0.05)，與LPS作用相當，且呈劑量依賴性，在黃精多糖質(zhì)量濃度為250 μg/mL時表達較高，提示黃精多糖刺激在轉(zhuǎn)錄水平上增強了促炎細胞因子TNF-α、IL-6、iNOS的表達，見圖5。

注：TNF-α和IL-6水平單位為ng/L，NO水平單位為μmol/L。與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

免疫調(diào)節(jié)對于維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著關鍵作用，RAW264.7細胞是小鼠腹腔巨噬細胞系，是常用的研究免疫功能的細胞模型之一?；罨木奘杉毎粌H能夠吞噬病原體，還能分泌調(diào)節(jié)免疫反應的細胞信使。多糖因其分子量、單糖組成和糖苷鍵等結(jié)構(gòu)可與巨噬細胞上的甘露醇受體結(jié)合并導致免疫活化，釋放細胞因子等免疫活性物質(zhì)，從而提高機體的免疫功能[7]。具有免疫調(diào)節(jié)活性的多糖可促使RAW264.7細胞形態(tài)改變，主要表現(xiàn)為體積增大、偽足生長等[8]。細胞的形態(tài)可以直接反應出細胞的活力，本研究通過CCK8法篩選得黃精多糖促進RAW264.7細胞活力增強的最佳劑量，并采用顯微鏡觀察細胞表現(xiàn)為活化狀態(tài)，表明黃精多糖具有潛在的免疫調(diào)節(jié)活性。

細胞因子主要由免疫細胞等分泌的一類小分子可溶性多肽蛋白，并通過與相應受體結(jié)合調(diào)節(jié)細胞生長分化，調(diào)控免疫應答。有研究發(fā)現(xiàn)，黃精多糖處理可以增強小鼠的免疫功能，提高RAW264.7巨噬細胞的吞噬作用，并增加IL-2、TNF-α、IL-8和IL-10等細胞因子水平[9]。TNF-α是巨噬細胞活化時釋放的重要細胞因子，能發(fā)揮促進T細胞增殖和激活樹突狀細胞成熟的作用，在宿主防御系統(tǒng)中起著關鍵作用，并可以誘導許多其他免疫調(diào)節(jié)[10]，還可以促進感染部位的趨化因子及白細胞介素的分泌[11]，誘導白細胞在感染部位的聚集并起到對被感染部位病原微生物進行清除的作用。IL-6是白細胞介素家族中的一員，可促進細胞的吞噬和粘附作用，是巨噬細胞發(fā)揮免疫功能的重要生物活性細胞因子，TNF-α的大量分泌可刺激IL-6的產(chǎn)生，調(diào)控T細胞的活化、B細胞的分化及淋巴細胞的分型，發(fā)揮非特異性免疫調(diào)節(jié)作用[12-13]。TNF-α還可與iNOS基因上游啟動子反應元件結(jié)合，引發(fā)iNOS基因的轉(zhuǎn)錄，從而誘導細胞產(chǎn)生大量NO[14]。NO是一種簡單但卻不穩(wěn)定的自由基，由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸產(chǎn)生，是機體免疫系統(tǒng)的效應器，可參與殺死病原微生物[15]。NO分泌量的增加，可促使巨噬細胞吞噬能力增強，機體抗病能力隨之增強[16]。這些生物活性因子進一步作用于淋巴細胞、成纖維細胞等，在天然免疫防御和獲得性免疫應答中起著不可忽視的作用。

黃精作為補益類中藥在提高機體免疫功能方面發(fā)揮著獨特的療效，本研究發(fā)現(xiàn)，黃精多糖可以增加RAW264.7巨噬細胞上清液中TNF-α、IL-6和NO分泌與表達，并且與LPS陽性對照相近，且黃精多糖在質(zhì)量濃度為250 μg/mL時不會影響正常巨噬細胞的活力，并表現(xiàn)出較強的免疫調(diào)節(jié)活性，能夠激活RAW264.7巨噬細胞，并誘導細胞因子的產(chǎn)生，從而增加機體非特異性免疫。黃精多糖有望成為免疫應答的調(diào)節(jié)劑，其開發(fā)和應用對于預防及提高機體免疫力低下具有重要意義。