沈加熙， 詹小蘭， 孫張弛

(浙江省榮軍醫(yī)院藥劑科，浙江 嘉興 314000)

肺癌是癌癥相關死亡的常見原因，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占所有肺癌病例的80%～85%，其5年生存率差[1-2]。晚期NSCLC患者的主要治療方法是鉑類雙線化療，但這些藥物通常會有腎毒性、神經(jīng)毒性和骨髓抑制等副作用[3]。因此，臨床上迫切需要具有良好抗腫瘤活性、毒性較小的新型藥物，而中藥因其較化療藥物具體更少的副作用引起了越來越多的關注[4-5]。川芎嗪是中藥川芎的有效成分，主要用于治療各種腦血管和心血管疾病[6-7]。此外，已有研究證明，川芎嗪對包括肺癌、卵巢癌和肝細胞癌在內(nèi)的多種上皮惡性腫瘤有著一定的療效[5,8]。川芎嗪可能是一種潛在的預防和治療肺癌的化學藥物[8]，但其在肺癌治療中的具體作用及機制仍然未知。因此，本研究探索了川芎嗪對NSCLC細胞系細胞活力、細胞凋亡和細胞周期的作用和機制。

1 材料

1.1 細胞 人肺上皮細胞Beas-2B、人支氣管上皮細胞HBE和NSCLC細胞系A549、H460、HCC827、H1650、PC-9、H1975購自上海生物科學研究所和細胞資源中心。細胞用含10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 試劑與藥物 川芎嗪對照品(純度≥98%，批號1124-11)購自美國Sigma公司，溶于二甲基亞砜(DMSO，批號30072418，國藥集團化學試劑有限公司)配制成100 mmol/L母液備用。四甲基噻唑藍(MTT，批號021005)購自美國Sigma公司；一抗p-STAT3、STAT3、Bax、Bcl-2、cleaved PARP、cyclin D1、CDK-4、CDK-6、β-actin(貨號9145、9139、89477、15071、5625、55506、12790、13331、3700)均購自美國Cell Signaling Technology公司；IgG-HRP二抗(貨號sc-2357)購自美國Santa Cruz公司；FITC Annexin V和PI凋亡檢測試劑(批號556547)購自美國BD公司。

2 方法

2.1 MTT法檢測細胞活力 細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中孵育過夜，棄培養(yǎng)基，并用不同濃度(0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L)的川芎嗪處理所有細胞72 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，加入200 μL DMSO，振蕩器上孵育5 min，用酶標儀在490 nm波長處測定吸光度，實驗重復3次。

2.2 平板細胞克隆實驗檢測細胞集落形成 將HCC827和H1650細胞以每孔1 000個的密度接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，加入DMSO和川芎嗪(25、50 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)，溫育2周后，PBS洗滌2次，甲醇固定15 min，結晶紫染色15 min。計數(shù)包含50個以上的細胞集落，然后拍攝可視化的細胞集落。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 取HCC827和H1650細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，用DMSO和川芎嗪(25、50、100 μmol/L)處理細胞24 h，收集細胞，PBS洗滌2次，重懸于100 μL結合緩沖液中，加入5 μL FITC Annexin V和PI，室溫孵育15 min，用400 μL結合緩沖液稀釋后，通過FACS Calibur流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

2.4 細胞周期檢測 將HCC827和H1650細胞以每孔3×105個密度接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，用DMSO和川芎嗪(25、50、100 μmol/L)處理24 h，收集細胞，PBS洗滌后在4 ℃的75%乙醇中固定過夜，離心棄上清，沉淀用冷PBS洗滌，重懸于含50 mg/mL PI的500 μL PBS中，4 ℃避光孵育30 min，將細胞懸液置于FACS Calibur儀上分析。

2.5 蛋白印跡法檢測蛋白表達 收集細胞，裂解提取蛋白，通過BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，通過SDS-PAGE電泳分離，并將其轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，加入一抗cyclin D1(1∶500)、CDK4(1∶500)、CDK6(1∶500)、PARP(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、p-STAT3(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜，然后加入二抗(1∶5 000)孵育2 h，化學發(fā)光試劑顯色，通過Amersham Imager 600系統(tǒng)曝光并分析。

3 結果

3.1 川芎嗪抑制NSCLC細胞增殖和細胞集落形成 如圖1A所示，川芎嗪對HCC827和H1650細胞具有抑制作用，IC50值分別為20.12、22.45 μmol/L，但對非致瘤細胞系(Beas-2B和HBE)的細胞活力無明顯影響，因此選擇HCC827和H1650細胞用于實驗。如圖1B所示，HCC827和H1650細胞的集落形成均減少，說明川芎嗪對NSCLC細胞的克隆生成具有抑制作用。

3.2 川芎嗪誘導NSCLC細胞周期停滯 如圖2所示，川芎嗪處理使HCC827和H1650細胞在G0/G1期以劑量依賴性方式蓄積(P<0.01)。如圖3所示，與DMSO組比較，川芎嗪組下調(diào)了細胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1、CDK4、CDK6的表達(P<0.01)。上述結果表明，川芎嗪通過減少HCC827和H1650細胞中細胞周期相關蛋白的表達，有效誘導了G0/G1期的細胞周期停滯。

3.3 川芎嗪誘導NSCLC細胞凋亡 如圖4、表1所示，與DMSO組比較，川芎嗪組HCC827和H1650細胞的早期和晚期凋亡率均增加(P<0.01)。為了建立川芎嗪誘導凋亡的分子機制，通過蛋白印跡分析檢測了凋亡相關蛋白的表達，包括裂解的PARP、Bax和Bcl-2。如圖5所示，與DMSO組比較，川芎嗪組裂解的PARP和促凋亡因子Bax蛋白表達上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達下調(diào)(P<0.05，P<0.01)。

表1 川芎嗪對細胞凋亡率的影響

3.4 川芎嗪抑制NSCLC細胞中STAT3蛋白磷酸化水平 如圖6所示，與DMSO組比較，川芎嗪劑量依賴性地降低STAT3蛋白磷酸化水平(P< 0.01)。

4 討論

天然產(chǎn)物具有多樣的生物活性，并被廣泛研究以發(fā)掘潛在的新抗癌劑。據(jù)報道，川芎嗪作為川芎的一種生物活性成分，顯示出了一定的抗癌特性，已被應用于多種類型的癌癥治療[5-8]。本研究評估了川芎嗪對2種NSCLC細胞的抑制作用，發(fā)現(xiàn)川芎嗪能抑制NSCLC細胞的增殖和生長，且對Beas-2B、HBE細胞沒有毒性。此外，川芎嗪以劑量依賴性地誘導NSCLC細胞周期停滯，促進細胞凋亡。由此提示，川芎嗪可能是一種安全有效的抗NSCLC藥物。

真核細胞以及癌細胞都經(jīng)由4個不同階段(G1期、S期、G2期和M期)，完整而有序的細胞周期對于癌細胞的生長和存活至關重要，而將細胞停滯在特定階段可嚴重阻礙腫瘤的進展[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪處理導致HCC827和H1650細胞在G0/G1期以劑量依賴性方式蓄積。細胞周期蛋白D1可以與CDK4和CDK6形成復合物，從而調(diào)節(jié)G1/S相變，并可能促進腫瘤發(fā)生[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪下調(diào)了細胞周期調(diào)節(jié)蛋白(cyclin D1、CDK4和CDK6)的表達，提示川芎嗪通過減少HCC827和H1650細胞中細胞周期相關蛋白的表達，有效誘導了G0/G1期的細胞周期停滯。誘導細胞凋亡是大多數(shù)抗癌藥物的關鍵[11-12]，Caspase 3及其底物聚ADP-核糖聚合酶(PARP)在轉導程序性細胞死亡信號中起著核心作用。此外，Bcl-2家族成員，例如Bcl-2和Bax，也對調(diào)節(jié)癌細胞的凋亡至關重要。因此，本研究通過用膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI雙重染色證實了川芎嗪對NSCLC細胞的促凋亡作用。

STAT3信號級聯(lián)反應的異常激活與多種惡性腫瘤的致癌性相關[13]。此外，在超過50%的NSCLC原發(fā)性腫瘤和細胞系中發(fā)現(xiàn)STAT3表現(xiàn)出高水平的組成性激活，這表明抑制STAT3可以作為單一療法或聯(lián)合療法用于治療肺癌。一項臨床前研究已經(jīng)對幾種天然來源的STAT3抑制劑(姜黃素、樺木酸和咖啡酸)的抗癌作用進行了評估[14]。然而，尚無對川芎嗪作為STAT3抑制劑在肺癌中進行應用的報道。本研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可以降低NSCLC細胞中STAT3蛋白磷酸化水平。已有研究證明NSCLC的發(fā)生與STAT3的磷酸化表達有關[15]，提示川芎嗪可能通過抑制STAT3的磷酸化來阻礙NSCLC的發(fā)展。

綜上所述，川芎嗪可能通過抑制STAT3的激活阻滯細胞周期進程并誘導NSCLC細胞凋亡，從而導致細胞活力降低和集落形成能力受損，提示川芎嗪可能作為新型有效的STAT3抑制劑，并有望成為安全有效治療NSCLC的候選治療劑。