鄧杰華， 李存金， 周云峰， 鄧見(jiàn)春， 吳 喆， 黃炳泉*

(1.宜春市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江西 宜春 336000；2.江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330029；3.高安市人民醫(yī)院，江西 宜春 336000)

右歸丸由熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、菟絲子、鹿角膠、杜仲、肉桂、當(dāng)歸、制附子組成，具有溫補(bǔ)腎陽(yáng)、填精益髓的功效，主治腎陽(yáng)不足，命門(mén)火衰證，方中附子、肉桂、鹿角膠培補(bǔ)腎中元陽(yáng)，溫里祛寒，共為君藥[1]。鹿角膠又稱(chēng)白膠、鹿膠，是由鹿科動(dòng)物梅花鹿或馬鹿等的角經(jīng)水煎煮[2]、濃縮制成，乃溫補(bǔ)腎陽(yáng)之上品[3]，同時(shí)具有抗乳腺增生、抗骨質(zhì)疏松、活血、鎮(zhèn)痛[4-8]等作用。

膠類(lèi)藥材是指由動(dòng)物的皮、骨骼等加工而成的膠原蛋白水解肽，根據(jù)原料來(lái)源和功效不同，可分為阿膠、鹿角膠、龜甲膠、黃明膠、海龍膠、新阿膠等[9]，其蛋白質(zhì)類(lèi)成分組成較為復(fù)雜[4]，對(duì)胰蛋白酶消化膠類(lèi)藥材蛋白質(zhì)產(chǎn)生的肽段進(jìn)行分析的研究已有報(bào)道[9-10]。鹿角膠屬于名貴藥材，全國(guó)需求量大，一些不法商家為節(jié)約成本、謀求暴利，會(huì)在鹿角膠熬制過(guò)程中摻入豬皮、牛皮、驢皮等成分[11-12]，以達(dá)到以次充好、以假亂真的目的。右歸丸標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)鹿角膠藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，難以保證鹿角膠投料質(zhì)量[2]。基于此，擬采用UPLC-MS/MS 技術(shù)，建立同時(shí)檢測(cè)右歸丸中鹿角膠、豬皮源(新阿膠)、牛皮源(黃明膠)及驢皮源(阿膠)的方法，實(shí)現(xiàn)右歸丸中同時(shí)測(cè)定鹿角膠與非法添加成分，以期為右歸丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供依據(jù)和思路。

1 材料

Waters Acquity UPLC H-class/xevo TQD液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)；SPX-150881-II生化培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；PL-S60超聲波清洗儀(東莞康士潔超聲波科技有限公司)；MS205DU電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；TG16-WS離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

右歸丸(43批來(lái)自市場(chǎng)監(jiān)督抽樣，2批通過(guò)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)自購(gòu))。鹿角膠(批號(hào)121694-201702)、阿膠(批號(hào)121274-201703)、新阿膠(批號(hào)121745-201701)、黃明膠(批號(hào)121695-201802)對(duì)照藥材均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。碳酸氫銨(批號(hào)BCBL9865V)、胰蛋白酶(批號(hào)SLBZ8570)均購(gòu)于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。乙腈購(gòu)于德國(guó)默克公司；甲酸購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～1.5 min，5%A；1.5～3.0 min，5%～10%A；3.0～4.0 min，10%～20%A；4.0～5.0 min，20%～60%A；5.0～5.1 min，60%～95%A；5.1～6.5 min，95%A；6.5～6.6 min，95%～5%A；6.6～8.5 min，5%A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測(cè)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；脫溶劑氣溫度600 ℃，體積流量1 000 L/h；錐孔氣體積流量60 L/h，其他參數(shù)見(jiàn)表1。其中，鹿角膠離子對(duì)選擇參照2020年版《中國(guó)藥典》[2]鹿角膠鑒別項(xiàng)，黃明膠、阿膠離子對(duì)選擇參照藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件(編號(hào)2014014)[13]，新阿膠離子對(duì)選擇參照鹿角膠中豬皮源成分檢查項(xiàng)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法(BJY201915)[14]。

表1 各樣品質(zhì)譜參數(shù)

2.3 溶液制備

2.3.1 對(duì)照藥材溶液 稱(chēng)取鹿角膠對(duì)照藥材粉末約0.1 g，置于50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm水系微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液10 mL，置于50 mL離心管中，加胰蛋白酶溶液(取胰蛋白酶適量，加1%碳酸氫銨溶液制成每1 mL中含1 mg的溶液，臨用現(xiàn)配)1 mL，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。精密稱(chēng)取黃明膠、新阿膠、阿膠對(duì)照藥材粉末各0.1 g，置于50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取5 mL，置于同一100 mL量瓶中，加鹿角膠基質(zhì)溶液(取鹿角膠對(duì)照藥材粉末約0.1 g，置于50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，即得)稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液1 mL，置于1.5 mL進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液100 μL，搖勻，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中恒溫酶解12 h，即可。

2.3.2 供試品溶液 樣品剪細(xì)，取約1.5 g(約相當(dāng)于鹿角膠0.1 g)，精密稱(chēng)定，置于50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，8 000 r/min離心10 min，0.22 μm水系微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液1 mL，置于1.5 mL進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液100 μL，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。

2.3.3 陰性樣品溶液 取不含鹿角膠的右歸丸陰性樣品約1.5 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40 mL，超聲處理30 min，1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm水系微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液40 mL，置于50 mL離心管中，加胰蛋白酶溶液4 mL，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，即得。

2.3.4 陽(yáng)性樣品溶液 取陰性樣品約1.5 g，精密稱(chēng)定，加入鹿角膠、黃明膠、新阿膠、阿膠對(duì)照藥材各0.1 g，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3.5 空白溶液 取空白樣品適量，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照藥材、供試品、陰性樣品、陽(yáng)性樣品、空白溶液適量，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，供試品溶液出現(xiàn)與鹿角膠對(duì)照藥材保留時(shí)間一致的色譜峰；陽(yáng)性樣品溶液出現(xiàn)與各對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)的色譜峰；空白溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾；陰性樣品溶液含有1個(gè)與阿膠對(duì)照藥材保留時(shí)間一致的色譜峰，但提取相應(yīng)離子對(duì)后未發(fā)現(xiàn)上述色譜峰，表明陰性樣品、空白溶液均對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，該方法專(zhuān)屬性良好。

2.5 檢出限 精密量取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照藥材溶液適量，加陰性樣品溶液稀釋?zhuān)?dāng)鹿角膠對(duì)照溶液稀釋5 000倍(相當(dāng)于稱(chēng)取對(duì)照藥材0.02 mg)、黃明膠對(duì)照溶液稀釋1 000倍(相當(dāng)于稱(chēng)取對(duì)照藥材0.1 mg)、新阿膠對(duì)照溶液稀釋1 000倍(相當(dāng)于稱(chēng)取對(duì)照藥材0.1 mg)、阿膠對(duì)照溶液稀釋1 000倍(相當(dāng)于稱(chēng)取對(duì)照藥材0.1 mg)時(shí)，能檢出各成分相應(yīng)離子對(duì)。

2.6 精密度、重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份混合對(duì)照藥材溶液適量，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得4種膠特征肽的定量離子對(duì)峰面積RSD為0.8%～1.4%，表明儀器精密度良好。平行精密稱(chēng)取同一批樣品6份，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得鹿角膠、黃明膠、新阿膠、阿膠峰面積RSD分別為2.5%、2.9%、3.2%、2.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 樣品測(cè)定 取45批樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，提取各成分離子流圖，進(jìn)行子離子掃描驗(yàn)證，與對(duì)照藥材溶液進(jìn)行比較，若供試品溶液出現(xiàn)與各對(duì)照藥材特征離子對(duì)保留時(shí)間一致的色譜峰，而且二級(jí)質(zhì)譜基本一致，則可判定該溶液含有相應(yīng)成分。結(jié)果，所有批次樣品均檢出鹿角膠特征離子對(duì)，而豬皮源、牛皮源、驢皮源成分均未檢出。

3 討論

鹿角膠取樣量為0.1 g，按照右歸丸處方量及制劑工藝計(jì)算，樣品取樣量約為1.5 g；各對(duì)照藥材在用1%碳酸氫銨溶液溶解定容后，可直接用水膜過(guò)濾，而樣品屬于小蜜丸和大蜜丸，煉蜜含量較高，用1%碳酸氫銨溶液超聲提取后，溶液較黏稠渾濁，難以透過(guò)0.22 μm水膜，過(guò)濾操作困難，需要經(jīng)過(guò)離心使溶液沉淀下沉，選取上清液再進(jìn)行過(guò)濾。另外，當(dāng)樣品與酶的比例為10∶1、酶解時(shí)間為12 h時(shí)，酶解基本完全，各特征離子的峰面積基本無(wú)顯著變化。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS/MS)法建立右歸丸中鹿角膠質(zhì)量控制方法，其檢測(cè)速度快，專(zhuān)屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，能同時(shí)完成方中鹿角膠及常見(jiàn)摻偽成分的檢驗(yàn)檢測(cè)，可對(duì)該制劑中鹿角膠藥材進(jìn)行有效監(jiān)控，并能進(jìn)一步完善相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。