趙 芳， 王洪新， 魯美麗， 孟 巖

(錦州醫(yī)科大學(xué)心腦血管藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121001)

阻塞性睡眠呼吸暫停是指在睡眠過程中上氣道部分或完全堵塞[1]，導(dǎo)致間歇性缺氧、復(fù)氧，這些病理生理改變通過引發(fā)氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能障礙，進(jìn)而促進(jìn)心血管疾病的發(fā)展[2-4]。內(nèi)皮功能障礙的主要特征是一氧化氮(nitric oxide，NO)的生成或生物利用度降低及血管張力改變[5]，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)是一種組成性表達(dá)的酶，調(diào)控著血管系統(tǒng)中NO生成。Calpain-1作為calpain家族中的主要研究對(duì)象，是一種Ca2+依賴性半胱氨酸蛋白酶，在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，其過度激活參與多種疾病的生物過程，并被證明影響NO的生成[6]。研究已表明，抑制calpain可減輕心血管疾病的內(nèi)皮功能障礙[7]。

黃芪甲苷是從黃芪中提取純化的天然小分子化合物，具有抗炎、抗纖維化、抗氧化應(yīng)激、抗糖尿病等多種藥理活性[8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷具有保護(hù)作用[9]，也有研究報(bào)道，其能抑制阻塞性睡眠呼吸暫停導(dǎo)致的心肌損害及炎癥[10-11]，但在血管內(nèi)皮功能方面的研究尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)主要探討黃芪甲苷對(duì)阻塞性睡眠呼吸暫停引起的血管內(nèi)皮功能障礙的影響，并研究其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 黃芪甲苷(純度≥98.0%, 批號(hào)JZ2018011017，南京景竹生物科技有限公司)。超氧化物陰離子熒光探針(dihydroethidium，DHE)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)S0063、S0101S、S0131S、S0056，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；calpain-1兔多克隆抗體(批號(hào)10538-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；eNOS兔多克隆抗體、β-actin兔單克隆抗體(批號(hào)A1548、AC026，武漢愛博泰克生物科技有限公司)；L-NAME(批號(hào)S2877，上海藍(lán)木化工有限公司)；蘇木素-伊紅(HE)染料、NO試劑盒(批號(hào)D006-1-3、A012-1-2，南京建成生物工程研究所)；腎上腺素(phenylephrine，PE)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)[批號(hào)P1240000、A6625，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]。

1.2 動(dòng)物 健康雄性C57BL/6小鼠40只，10～12周齡，體質(zhì)量(25±5)g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(遼)2020-0001。

1.3 儀器 ProOx-100型編程式間歇氧濃度實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(上海塔望智能科技有限公司)；DMT720M型離體微血管張力測(cè)定儀(丹麥Myotechnology公司)；高速臺(tái)式大容量離心機(jī)(德國Hermle公司)；電泳系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像儀(美國Bio-Rad公司)；NM-9602G 型酶標(biāo)分析儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；DMI3000B型顯微鏡(德國Leica公司)；SIM-F140AY65-PC型制冰機(jī)(日本大阪松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社)。

1.4 分組及給藥 將小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和黃芪甲苷低、高劑量(40、80 mg/kg)組，每組10只，適應(yīng)飼養(yǎng)3 d后，將模型組和黃芪甲苷各劑量組小鼠放入間歇氧濃度實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)動(dòng)物艙，交替給予90 s低氧(5% O2)及常氧(21% O2)，每天重復(fù)8 h，共4周[10]，空白組小鼠置于正常氧濃度的同等條件動(dòng)物艙中。于造模第1天開始，黃芪甲苷各劑量組小鼠灌胃給予黃芪甲苷(溶于0.5%羧甲基纖維素鈉中)，空白組和模型組小鼠灌胃給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉，連續(xù)4周。

1.5 樣本采集 小鼠使用20%烏拉坦(7 mL/kg)進(jìn)行麻醉，摘眼球取血，3 600 r/min離心5 min，取血清，保存待測(cè)。再取出胸主動(dòng)脈組織，部分用于HE、DHE染色，部分進(jìn)行離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)，部分置于-80 ℃冰箱中保存。

1.6 小鼠離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn) 將收集的胸主動(dòng)脈置入提前預(yù)冷的PSS營養(yǎng)液[NaCl(130 mmol/L)、KCl(4.7 mmol/L)、KH2PO4(1.18 mmol/L)、MgSO4(1.17 mmol/L)、CaCl2(1.16 mmol/L)、NaHCO3(14.9 mmol/L)、EDTA(0.026 mmol/L)、glucose(11.1 mmol/L)]中，在顯微鏡下去除周圍脂肪及結(jié)締組織，并切割成約2 mm長的血管環(huán)，采用離體微血管張力測(cè)定儀測(cè)量記錄各血管環(huán)張力變化。在正式實(shí)驗(yàn)前，使用K-PSS(PSS溶液中加入60 mmol/L KCl)激活血管環(huán)，如果2次收縮幅度差小于10%，則認(rèn)為血管收縮相對(duì)穩(wěn)定，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。再用1.0×10-5mol/L PE預(yù)收縮血管環(huán)，待曲線達(dá)到平臺(tái)期后加入累積濃度(1.0×10-8、3.0×10-8、1.0×10-7、3.0×10-7、1.0×10-6、3.0×10-6、1.0×10-5mol/L)ACh，繪制劑量依賴曲線。為確定NO對(duì)血管舒張的影響，各組血管環(huán)加入eNOS抑制劑L-NAME(100 μmol/L)，并于預(yù)收縮前孵育30 min。

1.7 小鼠胸主動(dòng)脈HE染色 胸主動(dòng)脈固定于4%多聚甲醛中，24 h后包埋于石蠟中，切片后HE染色，觀察主動(dòng)脈細(xì)胞排列狀態(tài)，測(cè)量中膜厚度。

1.8 小鼠胸主動(dòng)脈ROS水平檢測(cè) DHE染色用于檢測(cè)胸主動(dòng)脈中活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成情況。將各組胸主動(dòng)脈組織進(jìn)行冰凍切片，厚度為5 μm，然后滴加DHE染色液(5 μmol/L)，在37 ℃下孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，再對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察，通過Image J軟件進(jìn)行分析。

1.9 小鼠血清GSH-Px、SOD活性和MDA、NO水平檢測(cè) 采用相應(yīng)試劑盒，按照說明書步驟分別檢測(cè)血清GSH-Px、SOD活性和MDA、NO水平。

1.10 Western blot法檢測(cè)小鼠胸主動(dòng)脈中calpain-1、eNOS蛋白表達(dá) 取100 mg胸主動(dòng)脈組織于1 mL裂解緩沖液(RIPA+1% PMSF)中裂解、均勻化，冰上超聲30 s后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，加入適量5×SDS上樣緩沖液，100 ℃煮沸4 min，將樣品置于8%～10% SDS-PAGE膠中，電泳槽中85 V電泳2 h，再置于轉(zhuǎn)膜儀器中使其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入1% BSA，室溫?fù)u床封閉1.5 h，隨后加入calpain-1(1∶1 000)、eNOS(1∶1 000)、β-actin(1∶100 000)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，最后通過Image J軟件分析各條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對(duì)慢性間歇性缺氧小鼠胸主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)的影響 與空白組比較，模型組小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞的排列稍紊亂，中膜厚度增加(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷各劑量組小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞排列較整齊，中膜厚度降低(P<0.01)，見圖1。

2.2 黃芪甲苷對(duì)慢性間歇性缺氧小鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張的影響 與空白組比較，模型組小鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能降低(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷各劑量組小鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能提高(P<0.01)，見圖2。

2.3 eNOS抑制劑對(duì)黃芪甲苷保護(hù)慢性間歇性缺氧小鼠血管舒張的影響 為了證明黃芪甲苷對(duì)慢性間歇性缺氧小鼠的血管舒張的保護(hù)機(jī)制，各組血管環(huán)中加入eNOS抑制劑(L-NAME)預(yù)孵育30 min，結(jié)果如圖3所示，各組小鼠的血管環(huán)對(duì)ACh均無舒張作用，表明L-NAME抵消了黃芪甲苷對(duì)間歇性缺氧小鼠血管舒張的保護(hù)作用，其動(dòng)脈對(duì)ACh的舒張反應(yīng)呈NO依賴性。

2.4 黃芪甲苷對(duì)慢性間歇性缺氧小鼠胸主動(dòng)脈組織中ROS及血清NO水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠胸主動(dòng)脈組織中ROS水平升高(P<0.01)，血清中NO水平降低(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷各劑量組小鼠胸主動(dòng)脈組織中ROS水平降低(P<0.01)，血清中NO水平升高(P<0.05)，見圖4。

2.5 黃芪甲苷對(duì)慢性間歇性缺氧小鼠氧化應(yīng)激的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px活性降低(P<0.01)，MDA水平升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷各劑量組小鼠血清中SOD、GSH-Px活性升高(P<0.01)，MDA水平降低(P<0.01)，見圖5。

2.6 黃芪甲苷對(duì)慢性間歇性缺氧小鼠胸主動(dòng)脈組織中calpain-1、eNOS蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組小鼠胸主動(dòng)脈組織中calpain-1蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，eNOS蛋白表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷各劑量組小鼠胸主動(dòng)脈組織中calpain-1蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，eNOS蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，見圖6。

3 討論

流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明阻塞性睡眠呼吸暫停與心血管疾病有關(guān)[12-13]，內(nèi)皮功能障礙、氧化應(yīng)激在其中發(fā)揮著重要作用[14]。持續(xù)正壓通氣作為阻塞性睡眠呼吸暫?；颊叩囊痪€治療方案，由于依從率低、對(duì)心血管事件的預(yù)防效果欠佳[15-16]，故而迫切需要新的藥物方法來提高患者的生活質(zhì)量，并對(duì)心血管并發(fā)癥進(jìn)行預(yù)防。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過黃芪甲苷治療后，小鼠動(dòng)脈細(xì)胞排列狀態(tài)及中膜厚度改善，說明黃芪甲苷對(duì)慢性間歇性缺氧小鼠動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變具有保護(hù)作用；小鼠動(dòng)脈組織ROS水平和血清MDA水平降低，SOD、GSH-Px活性均增加，說明黃芪甲苷能減輕慢性間歇性缺氧小鼠氧化應(yīng)激；通過離體微血管張力檢測(cè)，ACh誘導(dǎo)的血管舒張得到改善，且血清NO水平提升，說明黃芪甲苷改善了慢性間歇性缺氧小鼠內(nèi)皮功能障礙。

calpain-1作為calpain家族的亞型之一，存在于內(nèi)皮細(xì)胞中，其過度激活與NO介導(dǎo)的糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化的內(nèi)皮功能障礙有著密切聯(lián)系[17-19]。eNOS是一種組成性表達(dá)的酶，調(diào)控NO的生成，NO通過內(nèi)皮細(xì)胞膜，擴(kuò)散到鄰近的平滑肌細(xì)胞中，從而促進(jìn)血管舒張和血管張力降低[20]。據(jù)報(bào)道，eNOS是一種高度敏感的calpain底物，calpain介導(dǎo)后廣泛降解，并抑制NO的產(chǎn)生[6]。因此，本課題組推斷黃芪甲苷可能通過calpain-1/NO改善慢性間歇性缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，eNOS抑制劑抵消了黃芪甲苷對(duì)慢性間歇性缺氧小鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張的保護(hù)作用,說明黃芪甲苷對(duì)慢性間歇性缺氧小鼠血管舒張功能障礙的保護(hù)作用是通過NO介導(dǎo)的，通過檢測(cè)小鼠動(dòng)脈組織calpain-1和eNOS蛋白表達(dá)，黃芪甲苷能降低慢性間歇性缺氧小鼠calpain-1蛋白表達(dá)，并增加eNOS蛋白表達(dá)，說明其能通過calpain-1/NO信號(hào)通路改善間歇性缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙。

綜上所述，黃芪甲苷能改善慢性間歇性缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙和氧化應(yīng)激，可能與calpain-1/NO信號(hào)通路有關(guān)，這可為黃芪甲苷治療阻塞性睡眠呼吸暫停提供了新的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。