朱梓維，白宇新，李云霞，孫冶，劉光焱，楊彪*

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2018級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室；3.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科）

中國國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，我國2018年有393萬人被確診患有癌癥，其中死亡率前五位的癌癥分別為肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌和乳腺癌［1］。我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均保持上升趨勢［2-3］。因此，探索結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找特異性的早期診斷標(biāo)志物及潛在的治療靶點對于提高患者健康，提升患者生活質(zhì)量具有重要意義。

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多階段、多環(huán)節(jié)參與的復(fù)雜過程，在此過程中腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中各種成分之間的相互作用起重要作用。缺氧微環(huán)境是腫瘤生長所必需的，這個過程中缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）發(fā)揮了關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，而且在結(jié)直腸癌中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義［4］。在低氧條件下，癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞通過HIF-1α和轉(zhuǎn)化生長因子β的協(xié)同作用，可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌化療耐藥［5］。

腫瘤耐藥的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，是當(dāng)前臨床治療所面臨的最主要問題之一。本研究通過沉默轉(zhuǎn)錄應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子HIF1α的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄組分析差異表達(dá)基因，預(yù)測可能的腫瘤耐藥分子機(jī)制，為全面了解和應(yīng)對癌癥的耐藥提供線索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480購置于中國科學(xué)院，RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%FBS，1%青霉素和鏈霉素）5 ml，吹勻后轉(zhuǎn)入25 cm2螺口培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞計數(shù)，1×106/孔，接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（康寧公司），當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)75%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實驗所用的siRNA-HIF1α引物從上海吉瑪公司購得。RNA Oligo序列如下：siRNA-HIF1α-830：上游引物：5′-GGAAAUGAGAGAAAUGCUU TT-3′；下游引物：5′-AAGCAUUUCUCUCAUUUC CTT-3′。siRNA-HIF1α-934：上游引物：5′-GGAA AUGAGAGAAAUGCUUTT-3′；下游引物：5′-AAGC AUUUCUCUCAUUUCCTT-3′。siRNA-HIF1α-1067：上游引物：5′-GCUGAUUUGUGAACCCAUUTT-3′；下游引物：5′-AAUGGGUUCACAAAUCAGCTT-3′。陰性對照：上游引物：5′-UUCUCCGAACGUGUCAC GUTT-3′；下游引物：5′-ACGUGACACGUUCGGA GAATT-3′。siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟如下：（1）將GPtransfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑5μl與195μl的RPMI 1640無血清培養(yǎng)基混勻于1.5 ml的離心管中，靜置5 min。（2）將10μl siRNA與190μl RPMI 1640無血清培養(yǎng)基混勻于1.5 ml的離心管中，靜置5 min。（3）將上述（1）步驟混勻靜置的轉(zhuǎn)染試劑和（2）步驟混勻靜置的siRNA再次混勻，靜置20 min。（4）將6孔板培養(yǎng)的細(xì)胞更換RPMI 1640無血清培養(yǎng)基1.8 ml。（5）將各組的孵育試劑加入到更換無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞中，37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)6 h，更換完全培養(yǎng)基。（6）48 h后提取總RNA。

1.3 總RNA提取，電泳質(zhì)檢，逆轉(zhuǎn)錄cDNA及Real-time PCR（qPCR）驗證轉(zhuǎn)染siRNA結(jié)果。

1.3.1 Trizol法提取總RNA 采用Trizol Reagent試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）提取細(xì)胞總RNA。（1）消化收集約有100μl體積的SW480細(xì)胞株，加入1ml Trizol反復(fù)吹勻，室溫靜置5 min；（2）加五分之一體積氯仿進(jìn)行分離，混勻15 s，室溫5 min。4℃，12 000×g離心15 min；（3）轉(zhuǎn)水相到EP管，加入等體積異丙醇，混勻10 min，進(jìn)行RNA沉淀。4℃，12 000×g離心10 min；（4）棄上清，加1 ml冰預(yù)冷75%乙醇（DEPC水配制）。4℃，7 500×g，5 min（2次）。棄上清，室溫干燥5~10 min；（5）DEPC水50μl在55~60℃水中溶解RNA。

1.3.2 RNA質(zhì)量鑒定（1）2%瓊脂糖凝膠配制：稱取瓊脂粉1 g，倒入錐形瓶中，加50 ml 1×TAE電泳緩沖液，搖勻后微波爐加熱1 min取出放涼至約50℃，加入2.5μl核酸染料，充分混勻，倒入電泳槽中，膠完全凝固后備用。（2）將凝膠放入電泳槽中，加入足量1×TAE電泳緩沖液，沒過凝膠，取一定量RNA與10×Loading buffer按10∶1比例混勻后加入凝膠孔。（3）電壓80 V，電泳約15 min，于凝膠成像儀紫外光下成像，觀察條帶邊緣情況、28S和18S條帶亮度以及有無DNA污染。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄cDNA 將提取的2μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。應(yīng)用GoScript Reverse Transcription System試劑盒（Promega），獲得cDNA。

1.3.4 qPCR驗證siRNA-HIF1α轉(zhuǎn)染結(jié)果 通過ABI 7500 real time PCR擴(kuò)增儀檢測驗證測序得到的篩選基因。qPCR引物序列如下：HIF1α，上游引物：5′-CCACAGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物：5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′；GAPDH，上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引 物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。通過ΔΔCT法進(jìn)行樣品間相對量的比較。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 在普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)特征改變。

1.5 RNA-Seq 轉(zhuǎn)錄組高通量測序由華大基因公司完成。DNBSEQ平臺一共測了6個樣品（siRNA干擾實驗組3個樣品重復(fù)，對照組3個樣品重復(fù)）。測序文庫構(gòu)建、簇生成、上機(jī)測序、數(shù)據(jù)分析。依據(jù)結(jié)果對siRNA-HIF1α-934干擾的結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株的差異表達(dá)基因的GO（Gene ontology）聚類、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）等Pathway分析，獲得篩選基因。

1.6 qPCR驗證篩選基因 在轉(zhuǎn)錄水平對RNA-Seq結(jié)果的Pathway分析及篩選基因進(jìn)行實驗驗證。通過ABI 7500 real time PCR擴(kuò)增儀檢測，驗證測序得到的篩選基因，6個上調(diào)基因（H2AC19、SULT1A4、GALNT4、H3C14、EIF3CL和CT45A6）和3個下調(diào)基因（OR2A4、CSNK2A3和MIOX）。引物序列見表1。

表1 qPCR的引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad Prism 6（GraphPad Software，CA，USA）對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)報告為3個獨立實驗的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。使用2組的非配對雙尾Student′st檢驗進(jìn)行統(tǒng)計比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qPCR驗證siRNA-HIF1α的敲除結(jié)果 將siRNA-HIF1α-830、siRNA-HIF1α-934、siRNAHIF1α-1067分別轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480，提取siRNA-HIF1α和對照組細(xì)胞株的4種細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過qPCR驗證3種siRNAHIF1α的敲除結(jié)果。通過分析HIF1α的基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)siRNA-HIF1α-934敲除效果最為顯著，即mRNA的表達(dá)水平下調(diào)1倍以上，見圖1。

圖1 qPCR檢測3種siRNA-HIF1α的敲除結(jié)果

2.2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài) 與轉(zhuǎn)染陰性對照引物相比較，轉(zhuǎn)染siRNA-HIF1α-934組細(xì)胞，其形態(tài)與對照組基本無太大的變化，但是通過計數(shù)發(fā)現(xiàn)SW480細(xì)胞的偽足較對照組有所減少，但細(xì)胞的體積無顯著改變，見圖2。

圖2 siRNA-HIF1α轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞的形態(tài)觀察（100×）

2.3 RNA-Seq結(jié)果

2.3.1 差異表達(dá)基因分析 通過對6個樣品（siRNA干擾實驗組3個樣品重復(fù)，對照組3個樣品重復(fù)）RNA-Seq結(jié)果分析，每個樣品平均產(chǎn)出7.25 G數(shù)據(jù)，一共檢測到17 230個基因。如圖3，得到了差異表達(dá)基因共計3 900個，其中上調(diào)表達(dá)1 292個，下調(diào)表達(dá)1 608個。為了驗證差異表達(dá)基因的mRNA表達(dá)水平，從RNA-Seq的結(jié)果中隨機(jī)選擇9個顯著差異基因進(jìn)行qPCR檢測，包括6個上調(diào)基因（H2AC19、SULT1A4、GALNT4、H3C14、EIF3CL和CT45A6）和3個下調(diào)基因（OR2A4、CSNK2A3和MIOX）。通過實驗證實了RNA-Seq的分析結(jié)果，且趨勢與高通量測序數(shù)據(jù)一致，見表2。

圖3 RNA-Seq分析的差異表達(dá)基因火山圖

表2 siRNA-HIF1α-934干擾SW480細(xì)胞后的差異基因表達(dá)情況

2.3.2 差異基因表達(dá)富集分析 通過Pathway分析表明，20種通路受這些差異表達(dá)基因的調(diào)控影響，主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路、肌動蛋白細(xì)胞骨架及黏附調(diào)節(jié)通路和叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子（FoxO）信號通路等通路（圖4A）。差異表達(dá)基因的功能如圖4B所示，這些差異基因的轉(zhuǎn)錄物最常見的功能是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)液、細(xì)胞質(zhì)、黏附作用、核糖體、細(xì)胞骨架和線粒體基質(zhì)等。

圖4 差異基因表達(dá)富集分析圖

3 討論

結(jié)直腸癌在全球最常見癌癥中排名第三，每年報告的新病例超過100萬，約有600 000例患者死于該?。?］?；颊吣退幮缘漠a(chǎn)生仍然是結(jié)直腸癌患者生存率低的重要原因。由于耐藥的發(fā)生及多重耐藥的出現(xiàn)，經(jīng)常導(dǎo)致化療的失敗，從而導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響人民群眾的健康。腫瘤耐藥機(jī)制是一個復(fù)雜的過程，其影響因素較多，主要包括個體遺傳差異、腫瘤微環(huán)境、腫瘤干細(xì)胞、藥物失活、藥物吸收減少、抗腫瘤藥物代謝改變等。惡性腫瘤的重要特征就是缺氧微環(huán)境，在缺氧環(huán)境下HIF-1α起到了重要的作用，與腫瘤的生長情況以及侵襲能力密切相關(guān)。因此，HIF-1α在結(jié)直腸癌中參與了多種與腫瘤相關(guān)的途徑的調(diào)節(jié)，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及侵襲遷移過程，導(dǎo)致了患者的不良預(yù)后［7］。

缺氧微環(huán)境是惡性腫瘤的重要特征，實體瘤中的腫瘤細(xì)胞會表達(dá)HIF-1轉(zhuǎn)錄因子，而HIF-1在缺氧環(huán)境下起到了重要的作用，與腫瘤的生長以及侵襲能力密切相關(guān)。研究證明，腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與多種機(jī)制有關(guān)，包括血管生成、糖酵解、細(xì)胞侵襲和細(xì)胞存活等，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的低氧環(huán)境促進(jìn)了這些環(huán)節(jié)的發(fā)展［8-10］。本研究中，我們使用siRNA技術(shù)獲得了HIF1α低表達(dá)的細(xì)胞株，以期研究腫瘤細(xì)胞在引發(fā)HIF-1α這類治療藥物耐藥后，腫瘤發(fā)展的調(diào)控通路改變情況，解析其可能的腫瘤耐藥分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，siRNA-HIF1α-934組細(xì)胞的偽足明顯減少，同時腫瘤細(xì)胞在面對HIF1α低表達(dá)調(diào)整了其部分的調(diào)控通路，如上調(diào)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工蛋白通路、激動蛋白細(xì)胞骨架及黏附調(diào)節(jié)通路和叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子信號通路等通路基因的表達(dá)。所以，通過本研究了解和應(yīng)對癌癥的耐藥，能夠有效提高患者健康、提升患者生活質(zhì)量，對于癌癥患者和所屬家庭來說意義重大。

低表達(dá)HIF1α后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路調(diào)控活性增強(qiáng)。細(xì)胞合成的蛋白質(zhì)經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的修飾后，參與細(xì)胞功能和命運的調(diào)控過程。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無法完成功能蛋白的修飾時，細(xì)胞就會受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［11］。引發(fā)范圍廣泛的細(xì)胞紊亂，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)修飾的效率，并導(dǎo)致錯誤折疊蛋白質(zhì)的積累，從而觸發(fā)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的同時，UPR最初發(fā)出適應(yīng)性輸出，減少負(fù)荷并增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌途徑的能力，以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。面對更為強(qiáng)烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，UPR會發(fā)出促炎和死亡信號，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［12］。腫瘤塊內(nèi)的惡劣微環(huán)境條件，如營養(yǎng)缺乏、氧限制、高代謝需求和氧化應(yīng)激，會干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊能力，這些條件可以促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊蛋白的積累從而引發(fā)“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激”的狀態(tài)［13］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器的持續(xù)激活賦予惡性細(xì)胞更大的致瘤性、轉(zhuǎn)移性和耐藥性。研究中我們發(fā)現(xiàn)，siRNA-HIF1α-934組細(xì)胞的KEGG分析，分值最高就是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白通路的改變。說明當(dāng)SW480細(xì)胞面對低HIF1α表達(dá)的情況，將啟動新一輪的蛋白修飾程序，通過加強(qiáng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的調(diào)控，編輯新的修飾蛋白，從而在轉(zhuǎn)錄水平實現(xiàn)新的微環(huán)境的適應(yīng)。

低表達(dá)HIF1α后，肌動蛋白細(xì)胞骨架及黏附調(diào)節(jié)通路發(fā)生顯著的改變。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是癌癥進(jìn)展過程中重要的細(xì)胞程序。肌動蛋白調(diào)控細(xì)胞骨架介導(dǎo)了細(xì)胞形狀和極性所必需的結(jié)構(gòu)框架等生物學(xué)功能。研究表明，肌動蛋白重塑是轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中EMT的加速劑［14］。當(dāng)敲低HIF1α表達(dá)使得肌動蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生重塑，說明抑制HIF1α表達(dá)可以增加肌動蛋白細(xì)胞骨架的動力調(diào)控的異常，同時腫瘤細(xì)胞通過相應(yīng)轉(zhuǎn)錄通路調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架，導(dǎo)致了惡性腫瘤的遷移能力增強(qiáng)。轉(zhuǎn)移的早期步驟涉及細(xì)胞內(nèi)信號和微環(huán)境的協(xié)調(diào)，通過細(xì)胞形態(tài)的變化，以允許細(xì)胞從原發(fā)部位分離。黏著斑在細(xì)胞成熟過程中通過黏附作用及改變分子組合來產(chǎn)生牽引并轉(zhuǎn)換信號驅(qū)動細(xì)胞遷移，細(xì)胞的黏附能力下降是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素之一［15］。實驗中，我們敲低了HIF1α表達(dá)，同時發(fā)現(xiàn)該組細(xì)胞的定植能力減弱，即細(xì)胞間彼此交流的偽足開始減少，說明細(xì)胞已經(jīng)開啟了一種新的遷移模式。惡性腫瘤細(xì)胞利用這種低的遷移阻力侵入鄰近組織和血管系統(tǒng)，并最終轉(zhuǎn)移。

低表達(dá)HIF1α后，F(xiàn)oxO信號通路活性上調(diào)。Fox蛋白家族是一大類在化療耐藥和EMT中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時，F(xiàn)oxO轉(zhuǎn)錄因子可大量激活，能夠控制多種特定的基因表達(dá)程序。FoxO可通過磷酸化、乙?；⒎核鼗图谆榷喾N修飾方式，同時參與PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等信號通路的作用，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、EMT及能量代謝等多種生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)FOXC1和FOXQ1通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵EMT相關(guān)分子促進(jìn)肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移［16-17］。FOXD1在包括胃癌在內(nèi)的幾種實體瘤中被發(fā)現(xiàn)失調(diào)，并抑制NF-κB活化，特別是p65亞單位的活化。據(jù)報道，F(xiàn)OXM1可調(diào)節(jié)卵巢癌的EMT、細(xì)胞干性和化療耐藥性［18］。FOXL2是FOX蛋白家族的另一成員，F(xiàn)OXL2在對常規(guī)化療耐藥的進(jìn)行性和復(fù)發(fā)性顆粒細(xì)胞腫瘤中也被發(fā)現(xiàn)上調(diào)［19-20］。本研究沉默轉(zhuǎn)錄應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子HIF1α的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞開啟了FOX的調(diào)控，通過激活FOX轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的信號通路，使得腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖和轉(zhuǎn)移，從而發(fā)展成為新一輪的耐藥細(xì)胞株。所以，在腫瘤藥物的研發(fā)過程中應(yīng)加入伴侶藥物的協(xié)同作用的研究，預(yù)測抗腫瘤藥物耐藥株的出現(xiàn)，同時加入另外一種協(xié)同成分，以期更好地抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。

腫瘤耐藥的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，其仍然是當(dāng)前臨床治療所面臨的最主要問題之一。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，沉默轉(zhuǎn)錄因子HIF1α的表達(dá)，可通過激活FoxO轉(zhuǎn)錄因子等信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖和轉(zhuǎn)移。我們接下來將針對HIF-1α這類治療藥物進(jìn)行腫瘤耐藥性分析，解釋其可能的腫瘤耐藥分子機(jī)制，以全面了解和應(yīng)對癌癥的耐藥，此途徑將有效提高患者健康、提升患者生活質(zhì)量，是新的治療選擇和生存希望，具有廣泛而深遠(yuǎn)的社會意義。