朱曉霞，賈瑜琦*，劉暢，弓韜，李高鵬，張宏偉，于保鋒

0 引言

對(duì)于單一驅(qū)動(dòng)增殖的癌癥，通過(guò)靶向相應(yīng)的靶點(diǎn)，阻斷增殖驅(qū)動(dòng)因子，能夠?qū)崿F(xiàn)精準(zhǔn)有效的治療。例如，西妥昔單抗等藥物通過(guò)靶向表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）有效治療頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[1-2]和非小細(xì)胞肺癌[3]；伊馬替尼通過(guò)靶向BCR-ABL酪氨酸激酶，能顯著提高慢性髓性白血病患者的長(zhǎng)期生存[4]；曲妥珠單抗和帕妥珠單抗作用于HER2，可以顯著降低早期HER2陽(yáng)性乳腺癌患者腦轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[5]。

然而，大多數(shù)實(shí)體瘤具有多驅(qū)動(dòng)增殖的特點(diǎn)，單獨(dú)阻斷某一增殖驅(qū)動(dòng)因子并不能抑制實(shí)體瘤的發(fā)展。前期研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高和12個(gè)基因的錯(cuò)義突變或蛋白截?cái)嘧儺惷芮邢嚓P(guān)[6]；KRAS、NRAS、PI3KCA、BRAF等基因的變異累積能促進(jìn)結(jié)腸癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-9]；黑色素瘤中攜帶至少10個(gè)驅(qū)動(dòng)因子突變[10]。

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）與多基因突變密切相關(guān)，這些突變引起相關(guān)信號(hào)通路的激活或抑制能影響肝細(xì)胞的異常增殖與分化[11-12]。研究表明，BRAF和PIK3CA基因突變?cè)隗w細(xì)胞水平上促進(jìn)肝癌的發(fā)生[13]，肝癌細(xì)胞中RAS基因的低表達(dá)調(diào)節(jié)異常與腫瘤的異質(zhì)性有關(guān)[14]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）信號(hào)通路是BRAF和RAS基因發(fā)揮調(diào)控作用的基礎(chǔ)，MAPK通路的下游信號(hào)系統(tǒng)為Ras/Raf/MEK/ERK，當(dāng)機(jī)體因應(yīng)激引起該信號(hào)通路激活時(shí)，這兩種基因（BRAF和RAS兩種突變?cè)谕荒[瘤細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)的情況很少見，且即使在單細(xì)胞水平上同時(shí)表達(dá)，兩者發(fā)揮作用也是相互獨(dú)立的[15-16]）就會(huì)發(fā)揮MAPK激酶激酶（MAPKKK）作用，進(jìn)一步激活ERK，從而調(diào)控細(xì)胞的周期及凋亡[17]。PIK3CA突變可提高下游激酶PI3Ks的活性，激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，減少細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)[18]。因此肝癌的發(fā)生是多驅(qū)動(dòng)且多步驟的，進(jìn)一步了解相關(guān)發(fā)病機(jī)制是挖掘潛在抗癌藥物的基石。

本研究選用SK-Hep-1肝癌細(xì)胞株，從分子和細(xì)胞層面了解肝癌多驅(qū)動(dòng)增殖的發(fā)病機(jī)制；通過(guò)建立更有效的數(shù)學(xué)模型，量化藥物對(duì)細(xì)胞的作用；采用不同的組合，發(fā)掘有效的協(xié)同藥物，為臨床研究開發(fā)潛在的用藥組合。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

SK-Hep-1肝癌細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞系STR（cell line authentication by STR profiling）鑒定正確，細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 藥物

本實(shí)驗(yàn)所用藥物均為蛋白激酶抑制劑，見表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用藥物Table 1 All drugs used in this study

1.3 主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶（含EDTA）、青鏈霉素混合液（100×）、MTT、DMSO、SDS、Tris、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PVDF膜均購(gòu)于北京索萊寶生物有限公司；Tween-20、RIPA蛋白裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、5×SDS-PAGE蛋白質(zhì)上樣緩沖液、BCA定量試劑盒均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；一抗Src/p-Src、一抗Mek/p-Mek、一抗Erk/p-Erk、一抗PDK1/p-PDK1、一抗AKT/p-AKT、一抗BRAF/p-BRAF、一抗MET/p-MET均購(gòu)于美國(guó)CST公司；一抗GAPDH購(gòu)于北京中杉金橋生物有限公司；彩虹180廣譜蛋白Marker（11～180 kD）購(gòu)于北京Solarbio公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗均購(gòu)于上海Santa Cruz公司；熒光顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱、凝膠成像儀均購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)BioTek公司；蛋白電泳儀、垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)膜儀均購(gòu)于北京六一儀器廠。

1.4 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖能力

將SK-Hep-1細(xì)胞按1×103個(gè)/孔接種至96孔板，24 h后加藥處理，每種藥物設(shè)16個(gè)濃度（20 μmol/L倍比稀釋直至0.6 nmol/L）處理細(xì)胞，72 h后加入50 μl MTT溶液（5 mg/ml），避光孵育4 h。棄掉MTT，加入200 μl DMSO，使用BioTek酶標(biāo)儀于490 nm和750 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔吸光度（OD）值。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用SPSS22.0軟件計(jì)算各種藥物的IC50值。

1.5 細(xì)胞經(jīng)藥物處理后的動(dòng)力學(xué)分析

根據(jù)SK-Hep-1細(xì)胞對(duì)各種藥物的IC50值，制作單靶點(diǎn)動(dòng)力學(xué)分析曲線，定量了解SK-Hep-1細(xì)胞對(duì)藥物的動(dòng)態(tài)和復(fù)雜反應(yīng)。單靶點(diǎn)動(dòng)力學(xué)分析曲線遵守如下公式：I=[D]/（[D]+IC50），I是相對(duì)抑制率，[D]是藥物濃度。雙相抑制曲線遵守如下公式：I=F1x[D]/（[D]+Kd1）+F2x[D]/（[D]+Kd2）。I是細(xì)胞經(jīng)藥物處理后的增殖抑制率，F(xiàn)1是細(xì)胞中對(duì)藥物敏感的部分，Kd是計(jì)算出來(lái)的最佳擬合參數(shù)，Kd1是敏感部分細(xì)胞的Kd，表示藥物對(duì)靶細(xì)胞的親和力，F(xiàn)2是細(xì)胞中對(duì)藥物不敏感的部分，Kd2是不敏感部分細(xì)胞的Kd，表示藥物對(duì)靶細(xì)胞的脫靶毒性。該雙相公式要求F1+F2=1。擬合曲線為三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的平均結(jié)果，并計(jì)算擬合曲線的殘差平方和（the sums of squared residues,SSR）。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

SK-Hep-1細(xì)胞融合程度達(dá)到70%時(shí)，使用2.50 μmol/L crizotinib，2.50 μmol/L dasatinib，0.15 μmol/L HG6-64-1和12.00 μmol/L MK-2206處理SK-Hep-1細(xì)胞，2 h后提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，運(yùn)用BCA法在酶標(biāo)儀中于562 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品蛋白濃度，配置12%SDS-PAGE凝膠，上樣、電泳，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉，TBST洗滌3次，孵育一抗（Src、p-Src、Mek、p-Mek、Erk、p-Erk、PDK1、p-PDK1、AKT、p-AKT、BRAF、p-BRAF、Met、p-Met、GAPDH）。4℃慢搖過(guò)夜，TBST洗滌3次，孵育二抗，室溫慢搖孵育1 h，TBST洗滌3次，凝膠成像顯影，Image J軟件分析目的條帶蛋白表達(dá)水平。

1.7 藥物聯(lián)合曲線繪制

按1.3的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行藥物聯(lián)合處理后，計(jì)算IC50及IC70，并根據(jù)Chou-Talalay公式計(jì)算劑量減少指數(shù)（dose reduction index,DRI），評(píng)價(jià)藥物組合與單藥比較達(dá)到相同抑制水平減少藥物濃度的倍數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差顯示。兩個(gè)樣本均數(shù)之間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)之間采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SK-Hep-1細(xì)胞敏感藥物確定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：SK-Hep-1細(xì)胞對(duì)HG6-64-1敏感，IC50為0.027±0.007 μmol/L，但單藥HG6-64-1對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞的抑制率不能達(dá)到100%。dasatinib、crizotinib和sunitinib是能作用于不同信號(hào)通路靶點(diǎn)的蛋白激酶抑制劑，在本課題組先前的研究[19]中已經(jīng)證實(shí)這三種藥物能有效地抑制SKHep-1細(xì)胞的活力，且IC50分別為0.842±0.083、0.796±0.060和0.568±0.070 μmol/L，SK-Hep-1細(xì)胞對(duì)MK-2206不敏感，IC50為4.011±0.507 μmol/L，見表2。這些研究表示SK-Hep-1細(xì)胞對(duì)多種藥物敏感，提示其可能有多種獨(dú)立驅(qū)動(dòng)因子。

表2 不同藥物對(duì)肝癌細(xì)胞SK-Hep-1增殖抑制的IC50和IC70值Table 2 IC50 and IC70 values of inhibition of the proliferation of SK-Hep-1 cells by different drugs

2.2 SK-Hep-1細(xì)胞對(duì)不同藥物的動(dòng)力學(xué)分析

單靶點(diǎn)動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果顯示：HG6-64-1和dasatinib對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞的實(shí)際抑制情況與最佳擬合結(jié)果相比，SSR為0.187和0.432，擬合效果不佳。在低濃度藥物范圍，最佳擬合結(jié)果比實(shí)際抑制率高很多，而在高濃度藥物范圍，最佳擬合結(jié)果比實(shí)際抑制率又低很多。Crizotinib、sunitinib和MK-2206這三種藥物處理的細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象，但差異并不顯著，SSR值分別為0.027、0.042、0.125，見圖1（左側(cè)）。由此可見，單靶點(diǎn)動(dòng)力學(xué)分析曲線不能準(zhǔn)確反映 SK-Hep-1細(xì)胞對(duì)這五種靶向藥物的反應(yīng)。

于是，我們猜測(cè)細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)是雙相的。雙相分析曲線顯示：最佳擬合結(jié)果與實(shí)際抑制率擬合效果較好，SSR值分別為0.029、0.021、0.004、0.019、0.058，見圖1（右側(cè)）。提示雙相動(dòng)力學(xué)曲線更能準(zhǔn)確反映不同藥物對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞的抑制情況。

進(jìn)一步分析雙相變化，SK-Hep-1細(xì)胞經(jīng)HG6-64-1處理后分為兩部分：F1部分占（76.1±5.8）%，Kd1是10.8±6.7 nmol/L；F2部分占（23.9±5.8）%，Kd2是4.4±2.2 μmol/L。因F1是藥物發(fā)揮抑制作用最重要的部分，幾乎所有的抑制活動(dòng)都在此處發(fā)生，可見76.8%的F1和10.4 nmol/L的Kd1比IC50=0.027 μmol/L更能準(zhǔn)確反映藥物和靶點(diǎn)之間的關(guān)系，見圖1A。SK-Hep-1細(xì)胞對(duì)其他藥物的反應(yīng)也能夠類似地分解為這四個(gè)參數(shù)，見表3?？梢娝幬锇邢蛱禺愋宰饔媚茏钄嗑哂懈哂H和力的驅(qū)動(dòng)因子使F1抑制，而藥物的非特異性脫靶作用能導(dǎo)致F2抑制，這一結(jié)果與我們的猜測(cè)一致。

圖1 SK-Hep-1細(xì)胞經(jīng)蛋白激酶抑制劑抑制的動(dòng)力學(xué)分析Figure 1 Kinetic analysis of SK-HEP-1 cells inhibited by protein kinase inhibitors

表3 肝癌細(xì)胞SK-Hep-1經(jīng)蛋白激酶抑制劑處理后的單相和雙相動(dòng)力學(xué)分析Table 3 Single-phase and two-phase kinetics analysis of SK-Hep-1 cells treated with protein kinase inhibitors

2.3 藥物作用的信號(hào)通路

為驗(yàn)證HG6-64-1、dasatinib、MK-2206和crizotinib在SK-Hep-1細(xì)胞中阻斷的驅(qū)動(dòng)因素，我們檢測(cè)了每種藥物作用的關(guān)鍵信號(hào)蛋白水平。Western blot結(jié)果顯示：crizotinib能強(qiáng)烈抑制Met磷酸化，也能較小程度抑制Akt磷酸化。HG6-64-1能完全抑制Akt磷酸化，部分抑制BRAF磷酸化和Mek磷酸化。dasatinib能完全抑制Y416位點(diǎn)和Y527位點(diǎn)Src磷酸化，也能較小程度抑制Mek和Erk磷酸化。MK-2206能完全抑制Akt磷酸化，也能夠輕微抑制Mek和Erk磷酸化，見圖2。上述結(jié)果證明HG6-64-1、dasatinib、MK-2206和crizotinib通過(guò)抑制不同信號(hào)通路的關(guān)鍵成員阻斷某一信號(hào)通路，對(duì)細(xì)胞增殖造成影響，并且也能交叉抑制相同通路，起到協(xié)同增強(qiáng)作用，也間接證明了SK-Hep-1細(xì)胞的多驅(qū)動(dòng)增殖。

2.4 藥物聯(lián)合使用對(duì)SK-hep-1細(xì)胞增殖的影響

通過(guò)雙相分析得出，F(xiàn)1部分的數(shù)值越大，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用越好。但僅單藥作用時(shí)，即使是SK-Hep-1細(xì)胞非常敏感的藥物HG6-64-1也不能達(dá)到100%抑制。我們猜想將F1部分靶點(diǎn)不重合的抑制劑進(jìn)行組合，可能會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)協(xié)同效應(yīng)。由表3可知，10.8 nmol/L的HG6-64-1能夠抑制約76%的SK-Hep-1細(xì)胞增殖，因此，我們?cè)囍鴮ふ铱梢砸种剖Ｓ嗉?xì)胞增殖的藥物。SK-Hep-1細(xì)胞中約30%對(duì)dasatinib敏感，約6%對(duì)crizotinib敏感，約7%對(duì)sunitinib敏感，約15%對(duì)MK-2206敏感，見表3。將HG6-64-1分別與dasatinib、crizotinib和sunitinib聯(lián)用，結(jié)果顯示，從劑量-效應(yīng)曲線可見：在低濃度區(qū)間（6.104×10-4μmol/L～6.25×10-1μmol/L），HG6-64-1與dasatinib的協(xié)同作用要優(yōu)于HG6-64-1與crizotinib和HG6-64-1與MK-2206，HG6-64-1與sunitinib沒(méi)有協(xié)同作用（數(shù)據(jù)未顯示）；在高濃度（1.25 μmol/L～20 μmol/L）區(qū)間，HG6-64-1與crizotinib的協(xié)同作用更優(yōu)，見圖3。從劑量減量曲線可見：細(xì)胞存活率為10%時(shí)，DRI約為2；細(xì)胞存活率為70%時(shí)，DRI升高至6左右，可知細(xì)胞存活率為70%時(shí)，HG6-64-1和crizotinib兩藥聯(lián)合的效果約為單藥處理的6倍，見圖3A。細(xì)胞存活率為20%時(shí)，DRI約為5；細(xì)胞存活率為60%時(shí)，DRI升高至14左右，可知細(xì)胞存活率為60%時(shí)，HG6-64-1和dasatinib兩藥聯(lián)合的效果約為單藥處理的14倍，見圖3B。因此，我們可以證實(shí)HG6-64-1和dasatinib兩藥聯(lián)合對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞增殖的抑制作用更佳，在0.6 μmol/L時(shí)抑制率能達(dá)到30%～40%。

進(jìn)一步分析HG6-64-1與dasatinib聯(lián)用的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)：在低濃度區(qū)間，dasatinib能使SK-Hep-1細(xì)胞中對(duì)HG6-64-1敏感的部分變得更敏感；在高濃度區(qū)間對(duì)HG6-64-1不敏感的部分對(duì)dasatinib也不敏感，見圖3B。為了使高濃度區(qū)間藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用更顯著，我們需選用一種可以使HG6-64-1和dasatinib聯(lián)用也不敏感的部分變得敏感的藥物。而在高濃度區(qū)間，crizotinib顯示與HG6-64-1藥物聯(lián)合的協(xié)同作用更好，于是我們將crizotinib與dasatinib和HG6-64-1聯(lián)合處理SK-Hep-1細(xì)胞，但結(jié)果顯示協(xié)同作用不顯著（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，我們從不同藥物作用靶點(diǎn)出發(fā)，根據(jù)圖2可知：crizotinib能夠完全抑制Met磷酸化；HG6-64-1能夠部分抑制BRAF磷酸化，完全抑制Akt磷酸化；dasatinib是一種Src抑制劑。于是我們篩選靶點(diǎn)是Akt但F1高于10%的藥物。MK-2206是Akt的特異性抑制劑，F(xiàn)1約為15%，將HG6-64-1與dasatinib和MK-2206聯(lián)用，觀察能否降低高濃度區(qū)域不敏感的細(xì)胞比例。結(jié)果顯示：MK-2206顯著降低了高濃度區(qū)間對(duì)HG6-64-1不敏感的細(xì)胞比例，見圖3C。HG6-64-1、dasatinib和MK-2206單藥的IC50分別為0.027±0.007、0.842±0.083和4.011±0.507 μmol/L，IC70分別為0.094±0.016、5.444±2.530和8.193±0.216 μmol/L，而三藥聯(lián)合的IC50僅為0.003±0.001 μmol/L，IC70僅為0.017±0.009 μmol/L，見圖3D、表2。以上結(jié)果表明，HG6-64-1、dasatinib和MK-2206三藥聯(lián)用能夠有效抑制SK-Hep-1細(xì)胞增殖。

圖2 SK-Hep-1細(xì)胞經(jīng)蛋白激酶抑制劑處理的信號(hào)通路分析Figure 2 Signaling pathway analysis of SK-HEP-1 cells treated with protein kinase inhibitors

圖3 靶向不同蛋白激酶藥物對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞增殖的的協(xié)同抑制作用Figure 3 Synergistic inhibitory effect of different protein kinase drugs on SK-Hep-1 cell proliferation

3 討論

肝癌SK-Hep-1細(xì)胞株本身具有BRAFV600E突變[20-21]，BRAF是MAPK（Ras-Raf-MEK-ERK）通路的成員，并通過(guò)該通路介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)信號(hào)的反應(yīng)，特別是激活BRAF能參與細(xì)胞周期進(jìn)程的持續(xù)誘導(dǎo)[13]。HG6-64-1是有效選擇性的BRAF抑制劑[22]，能顯著抑制BRAF磷酸化激活。SK-Hep-1細(xì)胞對(duì)HG6-64-1非常敏感，IC50值僅為0.027±0.007 μmol/L。在高侵襲性癌細(xì)胞系中，受體酪氨酸激酶能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，且在肝癌SK-Hep-1細(xì)胞中也已被證實(shí)通過(guò)化學(xué)抑制或mRNA沉默受體酪氨酸激酶家族中的DDR1（discoidin domain receptorⅠ）能夠降低AKT和ERK磷酸化，從而減少癌細(xì)胞的增殖和遷移[23]。本課題組已從一組酪氨酸激酶抑制劑中篩選出三種對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞敏感的抑制劑，分別為dasatinib、crizotinib和sunitinib[19]。因此，我們推測(cè)SK-Hep-1肝癌細(xì)胞有多種獨(dú)立驅(qū)動(dòng)因子參與細(xì)胞增殖。

一般使用IC50值反映細(xì)胞對(duì)藥物的敏感度，并根據(jù)IC50值繪制單靶點(diǎn)抑制曲線。但由圖1可知，單靶點(diǎn)抑制曲線與每種藥物的實(shí)際抑制作用之間存在偏差，說(shuō)明單靶點(diǎn)抑制曲線在本研究中并不能準(zhǔn)確描述藥物作用情況。癌細(xì)胞一般由多個(gè)致癌因子獨(dú)立驅(qū)動(dòng)，使用靶向某個(gè)靶點(diǎn)的激酶抑制劑只能部分抑制細(xì)胞增殖，使用某濃度的激酶抑制劑也可能同時(shí)影響成百上千個(gè)蛋白激酶。受影響的某些激酶可能與細(xì)胞增殖不直接相關(guān)，但抑制這些激酶可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性。因此可見，多驅(qū)動(dòng)增殖細(xì)胞對(duì)某一激酶抑制劑的反應(yīng)是兩種作用的混合：當(dāng)藥物抑制細(xì)胞敏感部分時(shí)，藥物對(duì)細(xì)胞存在靶點(diǎn)特異性；當(dāng)藥物作用于細(xì)胞不敏感部分時(shí)，藥物對(duì)細(xì)胞存在脫靶毒性。靶點(diǎn)特異性抑制是靶向治療的基礎(chǔ)，但脫靶毒性可能會(huì)限制靶向治療的有效性。綜上，準(zhǔn)確區(qū)分靶點(diǎn)特異性抑制和脫靶毒性有助于更好地開發(fā)針對(duì)多驅(qū)動(dòng)增殖細(xì)胞的聯(lián)合靶向治療策略。

本文選用雙相數(shù)學(xué)模型，定量描述多驅(qū)動(dòng)增殖SK-Hep-1肝癌細(xì)胞對(duì)靶向藥物治療的反應(yīng)。雙相動(dòng)力學(xué)模型中F1、F2分別表示癌細(xì)胞中對(duì)某一激酶機(jī)制劑的敏感和抗性部分；Kd1表示藥物對(duì)靶細(xì)胞的親和力；Kd2表示藥物對(duì)靶細(xì)胞的脫靶毒性。如果一個(gè)靶細(xì)胞是單驅(qū)動(dòng)增殖的，藥物反應(yīng)就變成了一種極端情況，F(xiàn)1變成了100%或接近100%，F(xiàn)2階段消失。在這種情況下增大F1的占比，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用越明顯，脫靶毒性越小，治療效果越好。一種癌細(xì)胞有多個(gè)獨(dú)立驅(qū)動(dòng)因素時(shí)，如果有一種完全可以與驅(qū)動(dòng)因素單獨(dú)作用的理想靶向藥物，該藥也只能部分抑制細(xì)胞增殖。當(dāng)一種以上具有明顯F1效應(yīng)的藥物對(duì)癌細(xì)胞有抑制作用時(shí)，將這些藥物聯(lián)合使用能更有效地阻斷細(xì)胞活力，實(shí)現(xiàn)藥物劑量顯著降低。因此，雙相分析不僅能有效評(píng)估多驅(qū)動(dòng)增殖癌細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)，也能為靶向治療提供新的框架。

大多數(shù)癌癥依賴多驅(qū)動(dòng)因素實(shí)現(xiàn)增殖，需要合理的藥物組合進(jìn)行靶向治療。常規(guī)的藥物組合離不開經(jīng)驗(yàn)篩選和不斷探索。本研究將HG6-64-1、dasatinib和MK-2206三藥聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)三藥聯(lián)合的IC50和IC70與單藥處理相比顯著降低，說(shuō)明這三藥組合能夠有效抑制SK-Hep-1細(xì)胞增殖。通過(guò)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，這三種藥物的作用靶點(diǎn)既有重合，也有不同，能夠顯著抑制Akt磷酸化和Src磷酸化，部分抑制BRAF磷酸化和Mek磷酸化。這些靶點(diǎn)與Ras/Raf/Mek/Erk和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)，說(shuō)明SK-Hep-1細(xì)胞增殖與這兩種通路密切相關(guān)，與之前的報(bào)道一致[24]。我們先前的研究也證實(shí)dasatinib對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞最可能的靶點(diǎn)是Src家族激酶[18]，因此本次的藥物組合結(jié)果有效。相關(guān)研究也證實(shí)，HGF/Met/JNK信號(hào)通路在肝硬化向肝癌發(fā)展的過(guò)程中具有一定作用[25]。Crizotinib是有效的c-Met抑制劑[26]，單藥也能夠抑制SK-Hep-1細(xì)胞增殖（IC50=0.796±0.060 μmol/L,IC70=2.155±0.076 μmol/L），但抑制效果不明顯，說(shuō)明Met并不是SK-Hep-1肝癌細(xì)胞增殖的主要靶點(diǎn)。Western blot結(jié)果表明，crizotinib與dasatinib和HG6-64-1聯(lián)合使用，多數(shù)作用靶點(diǎn)重疊，crizotinib能部分抑制Akt磷酸化，而HG6-64-1能完全抑制Akt磷酸化，說(shuō)明這三種藥物的結(jié)合并不互補(bǔ)，協(xié)同作用不顯著。本實(shí)驗(yàn)中HG6-64-1、dasatinib和MK-2206這三種藥物聯(lián)用僅在細(xì)胞和分子層面表明對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞增殖的有效抑制，今后有望進(jìn)一步通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)探討藥物聯(lián)用對(duì)肝癌的有效性。

綜上所述，對(duì)于多驅(qū)動(dòng)肝癌細(xì)胞SK-Hep-1而言，雙相驅(qū)動(dòng)分析能更好地反映藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用。HG6-64-1、dasatinib和MK-2206三藥聯(lián)合應(yīng)用能有效地抑制SK-Hep-1細(xì)胞增殖，可能是一種潛在治療肝癌的藥物組合。