湯琦琦，李艷，孫國偉，梁蓓蓓，趙健

0 引言

最新統(tǒng)計分析顯示我國肝癌發(fā)病率位居第5位，死亡率高居第2位[1]。肝臟是膽固醇合成的主要器官，小鼠肝癌模型提示膽固醇合成增加有利于肝癌形成[2-3]。膽固醇是通過甲羥戊酸（mevalonate,MVA）通路的一系列酶促反應(yīng)產(chǎn)生的，HMG-CoA還原酶（HMGCR）是其限速酶[4]，可被他汀類藥物阻斷。甾醇調(diào)節(jié)元素結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子2（SREBP2）是MVA通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[5]，我們之前的研究發(fā)現(xiàn)P53凋亡刺激蛋白（apoptosis stimulating proteins of P53,ASPP）家族成員ASPP2可以與SREBP2結(jié)合，負向調(diào)節(jié)肝癌細胞HMGCR表達和膽固醇合成[6]。本研究通過下調(diào)ASPP2建立膽固醇合成增強的小鼠肝癌細胞Hepa1-6，分析降脂藥辛伐他?。╯imvastatin,sim）和黃連素（berberine,BBR）對肝癌細胞增殖、侵襲和中性粒細胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps,NETs）形成的影響，以期為肝癌的臨床治療提供更多的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

C57/L小鼠中產(chǎn)生的BW7756小鼠肝癌的衍生株Hepa1-6由海軍軍醫(yī)大學(xué)國際腫瘤研究所提供；小鼠乳腺癌細胞株4T1由中科院上海生物科技研究所提供，小鼠乳腺癌細胞株D2F2由海軍軍醫(yī)大學(xué)國際腫瘤研究所提供；DMEM-F12培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司。靶向小鼠ASPP2和HMGCR基因的shRNA慢病毒購自上海漢恒生物科技上海有限公司；辛伐他汀、ASPP2抗體購自美國Sigma公司。黃連素購自美國MCE公司。H3cit抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；MPO抗體購自美國R&D公司。辛伐他汀用DMSO配置成10 mmol/L的儲備液，使用時稀釋至2 μmol/L工作液。黃連素用DMSO配置成10 mmol/L的儲備液，使用時稀釋成10 μmol/L的工作液。

1.2 細胞培養(yǎng)

Hepa1-6和D2F2細胞使用不完全高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，4T1細胞使用不完全1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，1%青鏈霉素并將細胞置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 細胞感染慢病毒（1/2體積感染法）

細胞生長狀態(tài)良好的Hepa1-6細胞，以2×105個/孔接種于6孔板中，待細胞生長密度達到40%～50%時換液，加入1 ml新鮮培養(yǎng)基和適量慢病毒感染細胞，并加入2 μl Polybrene促進慢病毒透膜。4 h后，加入1 ml新鮮培養(yǎng)基。24 h后棄含有慢病毒的培養(yǎng)基，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后收集細胞沉淀，提取RNA，qRT-PCR檢測ASPP2和HMGCR基因水平，評價shRNA干擾效率。后續(xù)培養(yǎng)時定期加入10 μg/ml嘌呤霉素以構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，即可得shNon、shASPP2和shHMGCR組。

1.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hepa1-6 細胞，給予10 μmol/L黃連素或2 μmol/L辛伐他汀處理24 h，提取細胞總RNA，轉(zhuǎn)錄合成為cDNA，實時熒光定量PCR擴增。引物序列如下：ASPP2正義：5′-AGATAGTGATGGATGGACGCC-3′，反義：5′-CTGGGTCATCTTTTCACGGT-3′；HMGCR正義：5′-CGATCCTTCCTTATTGGCGG-3′，反義：5′-CGGATCTCAATGGAGGCCAA-3′；CD133正義：5′-CTGGACCGGAGAGGGATG-3′，反義：5′-AGCCATAGTTGTTGGCCTGA-3′；EPCAM正義：5′-ATCGCTGTCATTGTGGTGGT-3′，反義：5′-ACCCATCTCCTTTATCTCAGCC-3′；OCT-4正義：5′-CAGTGGGGCGGTTTTGAGT-3′，反義：5′-GGCTGAACACCTTTCCAAAGAGA-3′；CD44正義5′-CACCTTGGCCACCACTCCTAAT-3′，反義：5′-GATGGTTGTTGTGGGCCGAA-3′。

1.5 細胞總膽固醇含量檢測

慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hepa1-6細胞經(jīng)黃連素或辛伐他汀處理24 h后，收集細胞沉淀。加入適量提取液，冰浴超聲破碎細胞。離心取上清液，依據(jù)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說明書加入檢測試劑后用酶標(biāo)儀于500 nm處進行檢測。

1.6 CCK-8細胞存活檢測

將細胞以1×104個/孔的密度接種到96孔板中，并在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用10 μmol/L黃連素或2 μmol/L辛伐他汀或黃連素和辛伐他汀聯(lián)合給藥處理細胞。依據(jù)試劑盒說明書，CCK-8（碧云天生物科技有限公司）在治療24和48 h后測量相對細胞活力。測量每個樣品在450 nm處的吸光度（OD）值，并將細胞活力計算為藥物處理細胞和未處理細胞之間OD值的比率，以shNon組細胞為對照組。

1.7 平板克隆形成實驗

消化Hepa1-6細胞以2×103個/孔接種于六孔板，加入含20%FBS的培養(yǎng)基，shASPP2細胞給予黃連素或辛伐他汀處理。10天后，棄培養(yǎng)基用4%多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫染色。水洗，拍照，計數(shù)集落形成情況。

1.8 低吸附板成球?qū)嶒?/h3>

消化Hepa1-6細胞以2×103個/孔加至低吸附板（24孔板）中，加入培養(yǎng)基（以50 ml為例，基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM-F12中加入胰島素4 μg/ml；0.4%BSA；B27添加劑1 ml；表皮生長因子EGF 20 ng/ml；成纖維細胞生長因子FGF 20 ng/ml）。shASPP2細胞中加入黃連素或辛伐他汀。每天觀察細胞狀態(tài)，6天后光學(xué)顯微鏡拍照、計數(shù)，記為一次成球。隨后用PBS吹打細胞至單細胞懸液，離心后加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，15天后拍照、計數(shù)，記為二次成球。

1.9 細胞劃痕實驗

消化Hepa1-6細胞，以5×105個/孔均勻鋪于六孔板中，待細胞密度長至90%時，使用10 μl槍頭進行垂直劃痕處理。PBS清洗至無漂浮細胞后在顯微鏡下于0 h、24 h和48 h拍照，分析細胞傷口愈合率。

1.10 Transwell侵襲實驗

消化Hepa1-6細胞，計數(shù)為1×106個/毫升。每孔添加100 μl細胞懸液至鋪有50 μl稀釋基質(zhì)膠的Transwell小室中。下室孔板中添加含有20% FBS的新鮮培養(yǎng)基或2.5×105個經(jīng)佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸（phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA）刺激不含F(xiàn)BS的中性粒細胞懸液。24 h后取出Transwell小室，置于4%多聚甲醛中固定，后用0.1%結(jié)晶紫染色。水洗后，用棉簽小心擦去膜上未穿孔細胞，風(fēng)干后置于顯微鏡隨機選取五個視野拍照，并計數(shù)。

1.11 共培養(yǎng)體系誘導(dǎo)NETs形成

從小鼠股骨和脛骨中分離出中性粒細胞，用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基重懸并計數(shù)為每毫升5×105個細胞，添加500 μl到包被多聚賴氨酸的載玻片上用20 nm PMA刺激30 min后，加入或不加DNase 1（0.32 u/ml,shASPP2+DNase1組）。將Hepa1-6細胞添加至鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室中，含中性粒細胞的載玻片置于下室孔上。22～24 h后，取出下室載玻片，免疫熒光染色檢測髓過氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）和瓜氨酸化組蛋白H3（citrullinated histone-3,H3Cit），NETs的生成情況使用以下公式計算，NET形成百分比=（NET形成中性粒細胞/中性粒細胞）×100%。熒光值通過Image J軟件獲得。

1.12 免疫熒光實驗

載玻片上的細胞經(jīng)4%多聚甲醛固定，0.5%Trionx-100透化，1% BSA封閉1 h后，孵育ASPP2（1:100）抗體、H3cit（1:400）或MPO（10 μg/ml）過夜（4℃）。第二天孵育同種屬二抗室溫孵育2 h。PBS清洗后用含有DAPI的封片劑封片。風(fēng)干后置于共聚焦顯微鏡拍照。

以上每個獨立實驗重復(fù)三次以上。

1.13 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗采用GraphPad Prism 7軟件分析，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析方法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ASPP2表達水平和膽固醇水平檢測

qRT-PCR結(jié)果顯示，與小鼠乳腺癌細胞4T1和D2F2相比，小鼠肝癌細胞Hepa1-6細胞中有較高的HMGCR基因表達和較低的ASPP2基因表達。Hepa1-6細胞中總膽固醇水平較高。免疫熒光結(jié)果顯示ASPP2蛋白在Hepa1-6細胞的胞內(nèi)和核內(nèi)都有表達，且核內(nèi)表達較高，見圖1A～C。

為了建立膽固醇合成增強和減弱的肝癌細胞，用shRNA分別干擾ASPP2和HMGCR表達。qRT-PCR結(jié)果顯示，LV-shASPP2的抑制效率大于70%，LV-shHMGCR的抑制效率大于80%，且shASPP2肝癌細胞表現(xiàn)出了旺盛的膽固醇生物合成（P=0.0075）和HMGCR基因表達增加（P=0.0496）。辛伐他汀和黃連素可以抑制這種由于下調(diào)ASPP2引起的膽固醇合成增加（P=0.0009）和HMGCR增強（P=0.01）。shHMGCR的Hepa1-6細胞膽固醇合成被抑制（P=0.0081），見圖1D。

圖1 ASPP2表達水平和膽固醇水平檢測Figure 1 ASPP2 expression level and cholesterol level detection

2.2 降脂藥抑制肝癌細胞增殖

降脂藥處理24 h后，CCK-8細胞存活檢測結(jié)果顯示，shASPP2的Hepa1-6細胞存活率比對照細胞（shNon）高（64.8±7.401）%，而shHMGCR肝癌細胞存活率較對照細胞低（24.12±1.157）%。給予黃連素或辛伐他汀后可以顯著抑制shASPP2肝癌細胞的增殖（P=0.005，P=0.002）。黃連素和辛伐他汀連用后對腫瘤細胞增殖的抑制作用更顯著（P=0.0002），見圖2A。降脂藥處理48 h后，觀察到相似的結(jié)果。與對照組相比，shASPP2組腫瘤細胞的克隆數(shù)顯著增多（P=0.0008），給予黃連素或辛伐他汀顯著抑制克隆形成（P=0.0006，P=0.0005），而敲低HMGCR基因表達后克隆形成顯著減少（P=0.0001），見圖2B。

圖2 降脂藥抑制小鼠肝癌細胞增殖Figure 2 Cholesterol-lowering agents inhibited proliferation of liver cancer cells

2.3 降脂藥抑制肝癌細胞干性特征

shASPP2肝癌細胞表現(xiàn)出旺盛的膽固醇生物合成，促進了Hepa1-6細胞在低吸附板中的連續(xù)成球能力，細胞球體大且數(shù)量多，干性相關(guān)標(biāo)志物CD44、CD133、EpCAM和轉(zhuǎn)錄因子OCT4的表達顯著增加（P=0.0270）。給予黃連素、辛伐他汀顯著抑制ASPP2下調(diào)引起的肝癌細胞成球生長（P=0.0218）和干性基因表達（P=0.0187）。抑制HMGCR基因表達后，肝癌細胞細胞干性特征減弱，見圖3。

圖3 降脂藥抑制肝癌細胞干性特征Figure 3 Cholesterol-lowering agents inhibited stemness of liver cancer cells

2.4 降脂藥抑制肝癌細胞遷移和侵襲

通過下調(diào)ASPP2表達增強膽固醇生物合成使Hepa1-6細胞表現(xiàn)出更強的遷移（P=0.0207）和侵襲能力（P=0.0017），給予辛伐他汀和黃連素后顯著抑制細胞的遷移和侵襲（P=0.0087）。然而，shHMGCR使Hepa1-6細胞遷移（P=0.0436）和侵襲（P=0.0216）能力下降，見圖4。

圖4 降脂藥抑制肝癌細胞遷移和侵襲Figure 4 Cholesterol-lowering agents inhibited liver cancer cells migration and invasion

2.5 降脂藥抑制NETs生成

在與中性粒細胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，shASPP2的Hepa1-6細胞組比對照組細胞表現(xiàn)出更多的侵襲性（P=0.0058），辛伐他汀和黃連素可以抑制這種侵襲（P=0.0044），見圖5A。DNase 1顯著抑制了shASPP2細胞的侵襲能力（P=0.0027），這表明NETs形成參與了膽固醇合成增加誘導(dǎo)的腫瘤細胞侵襲。

免疫熒光結(jié)果顯示，NETs的生成在shASPP2組中顯著升高（P=0.0182），而在shHMGCR組中減少，見圖5B。辛伐他汀和黃連素減弱了ASPP2下調(diào)誘導(dǎo)的NETs形成（P=0.0325），表明腫瘤細胞膽固醇合成增加可以促進NETs形成。

圖5 降脂藥抑制NETs的生成Figure 5 Cholesterol-lowering agents inhibited neutrophil extracellular traps formation

3 討論

腫瘤細胞通常在新陳代謝方面具有特征性變化，異常的細胞代謝有助于細胞增殖和腫瘤進展[7]。細胞增殖是所有腫瘤的共同特征，膽固醇合成增加可以為腫瘤細胞提供原料，促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展[8]。大規(guī)?；蚝Y查結(jié)果顯示，多種MVA途徑代謝酶對腫瘤細胞的存活至關(guān)重要[9-10]。此外，多個研究結(jié)果顯示他汀類藥物家族可以在體內(nèi)和體外實驗中抑制多種腫瘤的生長和促進細胞凋亡[11-12]。臨床資料顯示，高表達MVA通路基因的患者預(yù)后較差[3,13]，而他汀類藥物可以降低肝癌患者的發(fā)病率和癌癥相關(guān)的死亡率[14-15]。這些觀察結(jié)果表明膽固醇合成不僅與腫瘤生長有關(guān)，還與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。靶向MVA通路和膽固醇代謝可能是腫瘤治療的一個潛在治療靶標(biāo)。目前他汀類藥物正在全球20多個臨床機構(gòu)開展治療肝癌、乳腺癌等腫瘤的臨床試驗[5,7]。

除了他汀藥物作用于HMGCR抑制膽固醇合成，黃連素可以通過促進低密度脂蛋白受體（LDLR）水平抑制膽固醇合成[16]，本研究選用辛伐他汀和黃連素作為降脂藥，探討降脂藥對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲和NETs形成的作用。本研究結(jié)果顯示降脂藥顯著抑制肝癌細胞增殖及其干性特征。之前文獻報道，MVA通路和膽固醇合成對于維持細胞的干性特征至為重要。p53突變可導(dǎo)致MVA通路激活，膽固醇合成增加，有利于乳腺癌細胞在3D培養(yǎng)中維持形態(tài)[17]。最近的研究結(jié)果提示膽固醇合成有利于低氧狀態(tài)下肝癌細胞維持其干性特征[18]。本研究結(jié)果顯示敲低ASPP2基因表達的肝癌細胞，一次成球和二次成球的球體大且數(shù)量多，給予降脂藥后球體的生長被顯著抑制。PCR結(jié)果顯示肝干細胞標(biāo)志物EpCAM[19]、CD133[20]和CD44[21]以及干性調(diào)節(jié)分子OCT-4的表達水平均被降脂藥顯著抑制。上述結(jié)果提示降脂藥可以通過抑制肝癌細胞干性特征抑制細胞增殖。

膽固醇合成不僅參與調(diào)控細胞增殖，與腫瘤轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)。膽固醇可以促進中性粒細胞聚集和腫瘤轉(zhuǎn)移[22]。最近的研究發(fā)現(xiàn)NETs通過激活“休眠”的腫瘤細胞和降解細胞外基質(zhì)在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[23-24]。NETs形成過程為活化的中性粒細胞通過向細胞外釋放去聚化的染色質(zhì)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它最初的作用是中性粒細胞誘捕和殺死細菌和真菌的一種免疫方式[25]。我們觀察到ASPP2下調(diào)的肝癌細胞可以誘導(dǎo)中性粒細胞產(chǎn)生更強的NETs網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這種NET網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可被降脂藥和DNase 1抑制。上述結(jié)果提示腫瘤細胞膽固醇合成增加可以促進腫瘤侵襲能力，NETs形成參與了這一過程。HMGCR是膽固醇合成的關(guān)鍵酶，我們的研究結(jié)果提示靶向抑制腫瘤細胞HMGCR活性可望為抑制NETs形成和腫瘤轉(zhuǎn)移提供新策略。

綜上，膽固醇合成增加可以通過增強肝癌細胞的干性特征和誘導(dǎo)NETs形成，促進肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。服用降脂藥可望成為治療肝癌轉(zhuǎn)移的潛在治療方式。