楊 榮，張 健,2，崔可栩，王艷君,4，趙現(xiàn)方,4，衛(wèi)玉梅，李靜思，趙慶桃，南立軍,4*，李雅善,4*

（1.楚雄師范學(xué)院資源環(huán)境與化學(xué)學(xué)院，云南楚雄 675000；2.昆明理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，云南昆明 650500；3.香格里拉酒業(yè)股份有限公司，云南香格里拉 674400；4.云南省高校葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，云南楚雄 675000）

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平的提高，健康越來越受到人們的重視，目前有關(guān)花色苷和果膠酶的研究主要集中在其各自領(lǐng)域的研究[1-3]，有關(guān)產(chǎn)花色苷果膠酶菌株的研究卻很有限，產(chǎn)花色苷果膠酶不僅是上述兩個(gè)獨(dú)立的整體集中體現(xiàn)，而且在食品發(fā)酵工業(yè)中將會(huì)有很大的發(fā)展空間和潛力。

果膠酶是能降解果膠物質(zhì)的復(fù)合酶類總稱，具有提高色素和單寧穩(wěn)定性的作用[4-5]。果膠酶廣泛分布于高等植物和微生物體內(nèi)，但高等植物的果膠酶產(chǎn)量低、難以提取，且絕大多數(shù)不含花色苷。微生物生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單，是果膠酶的良好來源[6-8]，故可通過微生物固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶。

工業(yè)生產(chǎn)果膠酶最常用的菌種是黑曲霉。產(chǎn)果膠酶菌株的篩選主要有高碘酸法、剛果紅法和溴酚藍(lán)法[9-10]，均是利用產(chǎn)生水解圈作為篩選依據(jù)。高碘酸法只適用于酶具有活性和底物含有淀粉的情況，溴酚藍(lán)法使用的條件必須為酸性，剛果紅法具有操作簡(jiǎn)單、使用條件廣泛的優(yōu)點(diǎn)?；ㄉ赵谒嵝院蛪A性條件下有不同的顯色反應(yīng)，高碘酸和溴酚藍(lán)的使用條件會(huì)在一定程度上影響花色苷顯色。因此本試驗(yàn)主要采用的是剛果紅法。果膠酶生產(chǎn)菌多采用經(jīng)典法和分子生物學(xué)方法相結(jié)合對(duì)新分離菌株進(jìn)行鑒定[4-8]。

花色苷是一種類黃酮色素，是深色果蔬、果蔬汁中呈色的重要化合物，是植物體內(nèi)次生代謝的物質(zhì)，通過苯丙氨酸代謝途徑合成，其結(jié)構(gòu)和含量的穩(wěn)定性直接影響果蔬汁的外觀及食用價(jià)值。花色苷是由花色素和糖苷鍵結(jié)合形成的配糖體化合物，花色苷中花青素母核上的羥基可以發(fā)生酰基化反應(yīng)，使花色苷種類多樣化[11-12]。與人工合成花色苷相比，天然花色苷生理功能多樣，且用途和提取方法有所不同?；ㄉ找兹苡谒?，在強(qiáng)酸性條件下呈穩(wěn)定的紅色，在弱酸性至中性條件下呈紫紅色，在堿性條件下呈藍(lán)色。花色苷性質(zhì)極不穩(wěn)定，很少以游離態(tài)形式存在于自然界中。

不同葡萄品種的花色苷和果膠酶含量不同，即使是同一葡萄品種，也會(huì)因?yàn)榈乩項(xiàng)l件和成熟度等差異導(dǎo)致花色苷和果膠酶含量存在差異。通常果膠酶在葡萄酒中具有加速澄清、提高出汁率、促進(jìn)花色苷等酚類物質(zhì)的釋放、提取生物活性物質(zhì)和改善酒品質(zhì)等功能[13-16]。果膠酶能浸提花色苷，同時(shí)也能促進(jìn)單寧的浸提，單寧具有抗氧化活性，能防止花色苷氧化，且能與花色苷結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，所以果膠酶能起到穩(wěn)定色素的作用[17]。以葡萄皮、葡萄園土壤和葡萄酒等為原料，從微生物角度開展產(chǎn)花色苷果膠酶的研究，能最大程度降低提取成本、節(jié)約時(shí)間。

本試驗(yàn)以剛果紅法為菌株的篩選方法，通過形態(tài)外觀和顯微鏡觀察鑒定菌株，經(jīng)液態(tài)深層發(fā)酵獲得發(fā)酵液，離心后得到粗酶液，進(jìn)一步采用pH 示差法測(cè)定花色苷含量，綜合試驗(yàn)獲得相關(guān)數(shù)據(jù)，最終得到目的產(chǎn)物，用于提高和穩(wěn)定葡萄酒品質(zhì)的研究，主要解決葡萄酒色素不穩(wěn)定給葡萄酒的品質(zhì)帶來消極影響的問題，穩(wěn)定葡萄酒顏色、提高葡萄酒品質(zhì)、減少葡萄酒釀造工藝環(huán)節(jié)、降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料

‘赤霞珠’葡萄，采摘于香格里拉產(chǎn)區(qū)。葡萄園土壤取樣于香格里拉產(chǎn)區(qū)的斯農(nóng)。葡萄酒購(gòu)買于香格里拉酒業(yè)赤霞珠葡萄釀造的干紅葡萄酒。

1.1.2 試劑

蛋白胨、瓊脂，生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛肉膏、葡萄糖，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀，分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；磷酸氫二鉀，生物試劑，天津市大茂化學(xué)試劑廠；酵母浸粉，生物試劑，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-100B-Z 型電熱恒溫培養(yǎng)箱、立式蒸汽高壓滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；離心機(jī)，KDC-140HR，云南科儀化玻有限公司；恒溫培養(yǎng)震蕩器，BSD-100，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；紫外分光光度計(jì)，UV-5500，上海元析儀器有限公司；生物顯微鏡，WMS-1030，上海豫光儀器有限公司；生物安全柜，BSC 系列，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.3 樣品處理方法

1.3.1 赤霞珠葡萄皮粉末的制備

將赤霞珠葡萄皮剝下，放入鼓風(fēng)干燥箱55 ℃烘干，研磨至粉末狀，用40 目篩過濾，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 葡萄園土壤培養(yǎng)液的制備

稱取5 g 葡萄園土壤于45 mL 無(wú)菌水中，160 r/min震蕩培養(yǎng)3 h，梯度稀釋備用。

1.3.3 葡萄酒培養(yǎng)液

無(wú)需處理，直接使用。

1.4 菌株的初篩和復(fù)篩

參考華寶玉等[17]的研究，略作修改。

1.5 菌株的初步鑒定

參照尹樂斌等[18-19]的方法，略作修改。觀察菌株在平板上的菌落形態(tài)，用生物顯微鏡進(jìn)行菌落形態(tài)特征的觀察，參考魏景超[20]的《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步的分類。將培養(yǎng)篩選出的菌落進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)觀察和顯微鏡觀察，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.6 指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 花色苷的測(cè)定

參照王貝等[10]和劉洪海等[22]的方法，略作修改。分別取0.2 mL 粗酶液于兩支5 mL 試管中，分別加入3.8 mL pH 1.0 的KCl 緩沖液和pH 4.5 的CH3CO2Na·3H2O 緩沖液，避光穩(wěn)定20 min，用光路直徑為1 cm 的比色皿在波長(zhǎng)為520、700 nm 下測(cè)定吸光度值。通過吸光度值差，結(jié)合Fuleki T 公式（1）（2），計(jì)算得到樣品花色苷含量。

式中，M為二甲花翠素葡萄糖苷分子量，493.5；Df為稀釋倍數(shù)，22.5；ε為二甲花翠素葡萄糖苷消光系數(shù)，28000；W為花色苷含量，mg/L；L為比色皿的光程長(zhǎng)度，1 cm。

1.6.2 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取標(biāo)準(zhǔn)D-半乳糖醛酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，分別置于9 只25 mL 具塞比色管中，分別用蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，各加入DNS 試劑3 mL，置沸水浴中煮沸10 min，然后以流動(dòng)水迅速冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，充分混勻，用紫外分光光度計(jì)在520 nm 處測(cè)定吸光度值，以吸光度值（A）為橫坐標(biāo)，半乳糖醛酸濃度（B，mg/mL）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.3 酶活力測(cè)定

于甲、乙兩支25 mL 比色管中分別加入1.8 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的果膠溶液（用pH 4.8 乙酸-乙酸鈉緩沖液配制），甲管中加入0.2 mL 稀釋粗酶液，立即搖勻，在50 ℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)30 min，再向乙管中加0.2 mL 稀釋粗酶液，立即放入沸水浴中煮沸10 min，終止反應(yīng)，冷卻；再分別向甲、乙管加入3 mL DNS 試劑，混合，沸水浴煮沸10 min，取出，立即冷卻。加蒸餾水定容至25 mL，以煮沸滅活的稀釋粗酶液為空白，在520 nm 處測(cè)定兩試管的吸光度（OD值），用測(cè)得的（OD甲-OD乙）值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的D-半乳糖醛酸的量。果膠酶活力公式見式（3）。

式中，D為酶活力，U/mL；B為酶作用生成的D-半乳糖醛酸，mg/mL；C 為樣品稀釋倍數(shù)；v為測(cè)定酶活時(shí)取反應(yīng)液的量，mL；t為反應(yīng)時(shí)間，min。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 數(shù)據(jù)分析計(jì)算法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

2.1.1 初篩

初篩根據(jù)菌株生長(zhǎng)時(shí)利用果膠使平板產(chǎn)生水解圈能力，挑選出Dp/Dc 值較大的菌株，作為復(fù)篩的出發(fā)菌株，結(jié)果見表1（見下頁(yè)）。葡萄酒樣品篩選得到的菌株編號(hào)為1 號(hào)、2 號(hào)和3 號(hào)；葡萄園土壤篩選得到的菌株編號(hào)為4 號(hào)、5 號(hào)和6 號(hào)；葡萄皮中篩選得到的菌株編號(hào)為7號(hào)、8 號(hào)和9 號(hào)。通過平板菌落觀察，發(fā)現(xiàn)菌株3 號(hào)、5 號(hào)和8 號(hào)菌株直徑均為0.53 cm，顏色都為乳黃色，透明且表面光滑，初步判定為同一種菌，統(tǒng)一編號(hào)為3-1 號(hào)。4號(hào)和7 號(hào)直徑均為0.2 cm，為乳黃色，不透明且表面光滑，判定為同一種菌，統(tǒng)一編號(hào)為4-1 號(hào)。最終篩選得到的菌株有6 種降解果膠能力較好的菌株。

表1 葡萄皮、葡萄園土壤和葡萄酒菌株初篩水解圈直徑（Dp）與菌落直徑（Dc）及其比值Table 1 Grape skin,vineyard soil and wine strains Initial screening hydrolysis circle diameter (Dp) to colony diameter(Dc) and their ratios

（1）葡萄酒篩選得到的菌株

從葡萄酒中篩選出3 種不同形態(tài)的單菌落，直徑范圍在0.26～0.53 cm 之間，顏色為乳白色、乳黃色和白色，以半透明和透明為主，1 號(hào)和3 號(hào)表面光滑，2 號(hào)表面粗糙。如表2 所示，菌株經(jīng)剛果紅染色，獲得較大透明圈的菌株序號(hào)為1 號(hào)。

表2 葡萄酒中單菌落外觀形態(tài)Table 2 Appearance and morphology of single colonies in wine

（2）葡萄園土壤篩選得到的菌株

從葡萄園土壤中篩選出3 種不同形態(tài)的單菌落，直徑范圍在0.20～0.53 cm 之間，顏色為乳白色、乳黃色和淺黃色，透明度分別為不透明、半透明和略透明，均表面光滑。如表3 所示，菌株經(jīng)剛果紅染色，獲得較大透明圈的菌株序號(hào)為6 號(hào)。

表3 葡萄園土壤中單菌落外觀形態(tài)Table 3 Appearance of single colonies in vineyard soils

（3）葡萄皮篩選得到的菌株

由表4 可知，從葡萄皮中篩選出3 種不同形態(tài)的單菌落，直徑范圍在0.20～0.53 cm 之間，顏色為乳白色、乳黃色和粉紫色，以不透明和透明為主，均為表面光滑。菌株經(jīng)剛果紅染色，獲得較大透明圈的菌株序號(hào)為9 號(hào)。

表4 葡萄皮中單菌落外觀形態(tài)Table 4 Appearance of single colonies in grape skins

對(duì)比1 號(hào)、6 號(hào)和9 號(hào)菌落的透明圈大小，1 號(hào)和9號(hào)菌落的透明圈最大，成為目的菌株的可能性更大，作為復(fù)篩中重點(diǎn)觀察的菌株。

2.1.2 復(fù)篩

將初篩得到的6 種菌株接種于種子培養(yǎng)基上，30 ℃、160 r/min 震蕩培養(yǎng)24 h，使其活力增強(qiáng)，再取3 mL 種子培養(yǎng)液接種于50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min 發(fā)酵培養(yǎng)48 h 后，發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min 離心15 min，取上清液為粗酶液。

2.2 果膠酶活測(cè)定

2.2.1D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

DNS 法測(cè)定D-半乳糖醛酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為B=0.657 3A+0.040 7，R2=0.996。

2.2.2 三種樣品獲得降解果膠能力較好菌株粗酶液的酶活

由表5 可知，三種樣品獲得降解果膠能力較好菌株粗酶液的酶活中，9 號(hào)的酶活最高，為307.75 U/mL，然后依次為1、6、3-1、4-1、2。

表5 三種樣品獲得降解果膠能力較好菌株粗酶液的酶活Table 5 Three samples obtained enzymatic activity of the initial enzyme solution of strains with good degradation ability of pectin

2.3 花色苷含量測(cè)定

將初篩得到的6 種菌株分別接種于種子培養(yǎng)基上，30 ℃震蕩培養(yǎng)24 h 后，取3 mL 種子培養(yǎng)液接種于50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基上，30 ℃、160 r/min 震蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液經(jīng)4 ℃、6 000 r/min 離心15 min 后，吸取上清液獲得果膠酶粗酶液，測(cè)定粗酶液中花色苷含量如表6 所示。3-1號(hào)菌株來源于葡萄酒、葡萄園土壤和葡萄皮，其花色苷含量為5.95 mg/L；4 號(hào)菌株來源于葡萄園土壤和葡萄皮，花色苷含量為5.95 mg/L；1 號(hào)和2 號(hào)菌株來源于葡萄酒，花色苷含量分別為8.72 mg/L 和6.35 mg/L；6 號(hào)菌株來源于葡萄園土壤，花色苷含量為8.33 mg/L；9 號(hào)菌株來源于葡萄皮，花色苷含量為14.28 mg/L。果膠酶能浸提花色苷，同時(shí)也能促進(jìn)單寧的浸提，單寧具有抗氧化活性，能防止花色苷氧化，且能與花色苷結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，所以果膠酶能起到穩(wěn)定色素的作用[23]。綜上分析可得，三種原料篩選得到的產(chǎn)果膠酶菌株中均檢測(cè)得到花色苷，其含量如表6 所示，數(shù)據(jù)顯示9 號(hào)菌株產(chǎn)花色苷果膠酶的粗酶液花色苷含量最高，最終確定出最佳原料為葡萄皮。

表6 粗酶液中花色苷含量Table 6 Anthocyanin content in crude enzyme solution

3 結(jié)論

本研究以香格里拉的‘赤霞珠’葡萄、葡萄園土壤及葡萄酒作為原料，菌株根據(jù)其利用果膠產(chǎn)生水解圈（變色圈）的能力，三種原樣品各分離得到3 種產(chǎn)透明圈菌株。結(jié)合初步的菌落形態(tài)及顯微鏡結(jié)構(gòu)觀察分析，將菌株3 號(hào)、5 號(hào)和8 號(hào)菌株判定為同一種菌，編號(hào)為3-1號(hào)。4 號(hào)和7 號(hào)同一種菌，編號(hào)為4-1 號(hào)。最終篩選得到的菌株有6 種降解果膠能力較好的菌株作復(fù)篩的出發(fā)菌株。初步得到粗酶液，用DNS 法測(cè)定出酶活力最強(qiáng)的一組為葡萄皮中篩選出的9 號(hào)菌株；用pH 示差法測(cè)定出花色苷含量最高的一組為葡萄皮中篩選出的9 號(hào)菌株。因此，葡萄皮是產(chǎn)花色苷果膠酶的最佳原料。