朱晶鳳，高玉俠，李習冉，劉 藻，韋 歡，王云鵬，王曉莉*

（1.淮陰工學院生命科學與食品工程學院，江蘇省益生菌制劑重點實驗室，江蘇淮安 223003；2.淮安市淮安區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，江蘇淮安 223200）

我國是桃子的原產(chǎn)國，種植面積廣、種類繁多，廣泛分布于我國江蘇、浙江、山東等多個省份[1]。近年來，桃子作為經(jīng)濟型水果，種植面積不斷擴大，產(chǎn)量也在快速增加。2019 年數(shù)據(jù)顯示，我國桃子的種植面積已達89 萬hm2，總產(chǎn)量達到了1 599.3 萬t，位居世界第一[2]。桃子色、香、味俱全，尤其因營養(yǎng)豐富、肉嫩汁多、香氣獨特而倍受廣大消費者的喜愛[3]。桃子采收時間正值夏季高溫，采后代謝旺盛，果實的自然衰老、軟化以及生理失調(diào)會影響果實組織結(jié)構(gòu)[4]。在采摘期以及后期運輸貯藏過程中又極易受到真菌的侵害，病原菌能夠從果實表面機械損傷處侵入果實，生長繁殖過程中所分泌的果膠酶能夠分解果實細胞初生壁和中膠層中沉積的大量果膠，從而破壞細胞，使果實松弛、軟化、水分外滲、硬度下降[5]，導致其耐貯性差，甚至腐爛變質(zhì)，縮短貨架期[6]。

目前常見的采后病害防治方法有化學防治、物理防治和生物防治。然而化學防治中長時間使用殺菌劑使病原菌耐藥性增強，果實體內(nèi)農(nóng)藥殘留增加。物理防治中的低溫貯藏、氣調(diào)貯藏以及熱處理等，均可以達到防治效果，但是在低溫條件下貯藏過久，果實容易遭受冷害或凍害；氣調(diào)減壓貯藏等方法投資較大，成本過高，不適合小批量貯藏；熱處理的溫度以及時間等難以控制[7-8]。近年來，生物防治因其成本低、操作簡單、安全有效等優(yōu)勢，被認為是最具潛力的采后防治方法[9]。不同的生防菌對果蔬采后病害的防治機制是不一樣的，目前為了使拮抗菌發(fā)揮其在采后生物防治中的潛力，研究者們致力于探究生防菌的作用機制。眾多研究顯示，生防菌主要通過直接抑制病原菌生長、與病原菌競爭營養(yǎng)或者分泌抗菌物質(zhì)、誘導有機體產(chǎn)生抗病性等對果蔬采后病害起到防控的作用。蔡傅紅等[10]研究發(fā)現(xiàn)，生防菌W51 對番茄青枯病有很好的防治效果。本文研究了生防菌W51 對桃果實采后病害的防治效果，為生防菌在果蔬采后保鮮及貯運中的開發(fā)應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桃品種為‘突圍’，采摘于江蘇金綠源尋味樂園有限公司。采摘后立即運回實驗室，選擇成熟度和大小一致、無機械損傷、無病害的桃為供試果實。

PDA 培養(yǎng)基，環(huán)凱微生物公司。稱取本品干粉39 g，加入蒸餾水1 L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，121 ℃高壓滅菌15 min。

乙酸-乙酸鈉緩沖液，含29 mg 1 mmol/L 的EDTA、35 μL 5 mmol/L 的β-巰基乙醇。

1.2 W51 及菌懸液的制備

試驗所用菌為W51 株（發(fā)明專利授權(quán)號ZL201910933964.4），由實驗室提供。吸取100 μL 的W51于LB 平板上涂板活化，培養(yǎng)方法參照蔡傅紅等[10]。隨后將發(fā)酵液進行常溫離心（10 000×g、15 min），棄去上清液，沉淀部分用無菌水懸浮并稀釋至1×108CFU/mL，備用。

1.3 病原菌及孢子懸浮液的制備

R.stolonife分離于自然發(fā)病的桃果實，在PDA 培養(yǎng)基上28 ℃活化2 d，用10 mL 的無菌水洗下孢子，利用血球計數(shù)板計數(shù)，用無菌水將孢子懸浮液濃度稀釋至1×105CFU/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 W51 對R. stolonife 的抑制作用

將2.5 mL 的W51 懸液與50 mL PDA 培養(yǎng)基混勻，倒入培養(yǎng)皿中，制備平板。挑取少量R.stolonifer接種于平板中央，28 ℃培養(yǎng)24 h，對照組為不加W51 的培養(yǎng)基培養(yǎng)的R.stolonifer。參考袁夢思等[11]的方法計算抑菌率，如式（1）所示。

式中，IR 為抑菌率，%；A為對照菌落半徑，cm；B為處理菌落半徑，cm。

1.5 試驗設(shè)計

用75%乙醇對供試桃子進行表面消毒，自然晾干后，在桃子赤道部等距處穿刺2 個孔，孔深4 mm，直徑2 mm。定量注射1×108CFU/mL W51 懸液15 μL（對照組為無菌水）。24 h 后，每孔再注入1×105CFU/mL 根霉孢子懸液10 μL。自然風干后，將已接菌種的果實裝入聚乙烯袋中，置于（20±1）℃、相對濕度為80%條件下，貯藏3 d。每天統(tǒng)計果實的發(fā)病率和病斑直徑。每組處理30 個桃子，重復(fù)3 次，每天取樣后用液氮速凍，放于-80 ℃冰箱儲存，用于指標的測定。

1.6 測量指標與方法

1.6.1 桃子品質(zhì)指標測定

桃子硬度采用GY-3 指針式水果硬度儀測定，結(jié)果以牛頓（N）單位表示?？偪扇苄怨绦挝铮╰otalsolublesolid，TSS）含量測定采用便攜式糖度計（PAL-1），數(shù)據(jù)以百分比表示?？傻味ㄋ幔╰itratable acid，TA）含量測定采用酸堿滴定法，結(jié)果以蘋果酸百分數(shù)表示[12]。維生素C（VitamineC，VC）含量測定采用2,6-二氯靛酚滴定法[13]，結(jié)果以mg/kg表示。

1.6.2 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定

參照Jiao 等[14]的方法測定。

1.6.3 氧化應(yīng)激相關(guān)酶活測定

活性過氧化物酶（peroxidase，POD）活性測定參照Wang 等[15]的方法。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）以每分鐘反應(yīng)體系在波長420 nm 處吸光值變化增加1 時所需要的酶量為一個酶活單位[16]。過氧化氫酶（catalase，CAT）活性采用Liu 等[17]的方法。超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）活性的測定參照李易初等[18]的方法。

1.6.4 幾丁質(zhì)酶（CHI）和β-1,3-葡聚糖酶（GLU）活性測定

參照Ahmed 等[19]的方法，略作修改。

CHI：稱取1 g 樣品，加5 mL 預(yù)冷的乙酸-乙酸鈉緩沖液，冰浴研磨勻漿，4 ℃離心后取上清液。利用二甲氨基苯甲醛測定CHI 催化水解過程中產(chǎn)生的N-乙酰葡萄糖胺的生成量來反應(yīng)CHI 的活性。

GLU：將0.1 mL 粗酶液和0.1 mL 的昆布多糖混合，在37 ℃下保溫40 min，以煮沸5 min 的酶液作為對照。然后加入1.8 mL 蒸餾水和1.5 mL DNS 試劑，在沸水浴加熱3 min，用蒸餾水稀釋至25 mL 混勻，測波長540 nm處的吸光值。

1.6.5 總酚含量和DPPH 自由基清除能力的測定

參照Sheng 等[20]的方法測定總酚含量和DPPH 自由基清除能力。

1.7 桃果實轉(zhuǎn)錄組學分析

1.7.1 樣品處理

共取三組樣品，分別取自對照組的第0 天和第2 天以及W51 處理組的第2 天，三組樣品分別命名為W_CK0 d、W_CK2 d 和W51_2 d。剝?nèi)スず?，將果核和腐爛的果肉去除，將剩余的果肉切片剁碎，立即用液氮速凍，放于-80 ℃冰箱。每組樣品2 個重復(fù)，保存于干冰中，送往天津諾禾致源科技股份有限公司進行轉(zhuǎn)錄組檢測。

1.7.2 熒光定量PCR 驗證分析

共取三組樣品，分別取自對照組的第0 天和第2 天以及W51 處理組的第2 天，三組樣品分別命名為W_CK0 d、W_CK2 d 和W51_2 d，每組樣品3 個重復(fù)，實驗重復(fù)2 次。采用逆轉(zhuǎn)錄PCR 試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）后進行熒光定量PCR。按照Novozan 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（R223）說明書，用含2 μg Total RNA 的20 μL 反應(yīng)混合物合成cDNA。以桃Actin基因為內(nèi)參，以cDNA 為模板進行熒光定量PCR（Novozan qPCR 試劑（Q341））。循環(huán)條件，Stage1：95 ℃、90 s；Stage2：95 ℃、5 s，60 ℃、15 s，72 ℃、20 s；進行40 個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算3 個生物重復(fù)中各基因的相對表達量[21]。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA），用鄧肯法比較分析相關(guān)數(shù)據(jù)在顯著水平0.05 時的差異，用Origin 2018 軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 W51 處理對根霉的抑制作用

采用固體平板法，測量統(tǒng)計W51 對R.stolonifer菌絲生長的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)W51 對R.stolonife菌絲生長的抑制效果很明顯，抑制率達到了75.00%。由圖1 可以看出，在含有菌懸液的培養(yǎng)基上R.stolonife生長緩慢，只生長出非常稀薄的菌絲，而對照培養(yǎng)基上R.stolonife正常生長。

圖1 W51 對根霉的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of W51 on R. stolonifer

2.2 W51 處理對桃子病害的防治效果

從圖2 中可以直觀地看出，W51 處理桃子的效果，抑制根霉病菌的擴散，有效抑制了軟腐病的發(fā)生。圖3顯示，在貯藏第2 天，經(jīng)過W51 處理的果實發(fā)病率為69.68%，低于對照組的96.66%。從貯藏第2 天開始，對照組的桃子出現(xiàn)不同程度的腐爛，果實的病斑直徑已經(jīng)達到（3.52±0.28）cm，而處理組的病斑直徑僅為（0.85±0.08）cm。

圖2 W51 處理對桃子病害的防控效果圖Fig.2 Prevention and control effect of W51 treatment on peach disease

圖3 W51 處理對桃子病斑直徑（A）和發(fā)病率（B）的影響Fig.3 Effect of W51 treatment on disease spot diameter (A)and incidence (B) of peaches

2.3 W51 處理對桃子品質(zhì)的影響

表2（見下頁）中顯示，接種R.stolonife之后，兩組桃子的硬度都在下降，在貯藏第2 天，處理組的硬度是對照組的1.57 倍。在整個貯藏期間，TSS 含量逐漸升高。在貯藏第1 天，處理組的TSS 含量迅速上升，達到10.57%。接種R.stolonife后，VC 含量隨貯藏時間的延長而降低，在貯藏第1 天，對照組的含量下降幅度較大，比第0 天時降低了34.46%，而處理組比第0 天時僅降低了10.32%。TA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第1 天達到峰值，處理組的含量達到了0.46%，是對照組的1.14 倍。

表2 W51 處理對桃子品質(zhì)的影響Table 2 Effect of W51 treatment on fruit quality of peaches

2.4 W51 處理對桃子MDA 含量的影響

如圖4（見下頁）所示，兩組桃子中的MDA 含量隨貯藏天數(shù)的增加而增加。對照組MDA 含量在貯藏第2 天增加較快，達到了5.03 μmol/kg，處理組的含量增加較緩慢，達到了3.53 μmol/kg，分別是接種后第0 天的3.03 倍和2.13 倍。在整個貯藏期間，處理組MDA 含量始終低于對照組。

圖4 W51 處理對桃子MDA 含量的影響Fig.4 Effects of W51 treatment on MDA content of peach fruit

2.5 W51 處理對桃子POD、PPO、CAT 和SOD 活性的影響

如圖5 所示，隨著貯藏時間的延長，POD、PPO 和SOD 酶活性均逐漸升高。在貯藏過程中，對照組的POD酶活性上升緩慢，而處理組的POD 酶活性在貯藏后期直線上升，是對照組的1.47 倍。在貯藏第2 天，處理組的PPO 酶活性達到了82.40 U/mg 蛋白質(zhì)，比對照組高了32.31%。在接種后第1 天，處理組的SOD 酶活性直線上升，比對照組高了20.28%。CAT 酶活性在貯藏第1 天達到峰值，處理組的酶活性比第0 天的酶活性高了72.38%。

圖5 W51 處理對桃子POD（A）、PPO（B）、CAT（C）和SOD（D）活性的影響Fig.5 Effects of W51 treatment on POD(A),PPO(B),CAT(C) and SOD(D) activities of peach fruit

2.6 W51 處理對桃子CHI 和GLU 活性的影響

由圖6 可知，在貯藏過程中，桃子的CHI 和GLU 活性呈現(xiàn)上升趨勢，在貯藏第2 天，W51 處理組的CHI 活性比對照組高50.60%，在貯藏第3 天，處理組是對照組的1.21倍。在貯藏第2 天，處理組的GLU活性比對照組高45.20%，貯藏第3 天，處理組的酶活性比對照組高了23.37%。

2.7 W51 處理對桃子總酚含量和DPPH 自由基清除能力的影響

如圖7 所示，總酚含量在第2 天達到峰值，處理組的總酚含量達到3.18 mg/g，而對照組的總酚含量達到2.75 mg/g，分別是第0 天的2.23 倍和1.93 倍。在第2 天，對照組DPPH 的清除自由基能力下降的速度比處理組快，對照組下降了10.68%，而處理組僅下降了4.10%。

圖7 W51 處理對桃子總酚含量（A）和DPPH自由基清除能力（B）的影響Fig.7 Effects of W51 treatment on total phenolic content(A)and DPPH free radical scavenging ability(B) of peach fruit

2.8 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與分析

2.8.1 過氧化酶體代謝通路分析

由圖8、9（見下頁）分析發(fā)現(xiàn)，編碼ROS 代謝相關(guān)的PXMP2 蛋白的差異基因PRUPE_7G022300和PRUPE_4G018300，在第2 天時，W51 處理組的表達量發(fā)生上調(diào)，說明與對照相比，W51 處理可以誘導ROS 代謝相關(guān)基因表達量的升高。此外，POD 相關(guān)的基因（PRUPE_8G164400、PRUPE_1G186500）、SOD 相 關(guān) 的 基因（PRUPE_1G347200、PRUPE_7G005300）以及CHI 相關(guān)的基因（PRUPE_5G011400）也發(fā)生了上調(diào)，可能與桃子抗病性的增強相關(guān)。

圖8 三個比較組KEGG 富集分析氣泡圖Fig.8 Bubbles of KEGG enrichment analysis in the three comparison groups

圖9 過氧化酶體代謝通路Fig.9 Peroxidase metabolic pathway

2.8.2 基因表達的定量PCR 分析

本研究篩選了3 個基因進行qRT-PCR 分析（圖10）。這些基因為POD 相關(guān)的基因（PRUPE_1G186500和PRUPE_8G164400）和ROS 代謝相關(guān)的PXMP2 蛋白的差異基因PRUPE_4G018300。結(jié)果顯示，在貯藏第2 天與第0 天相比三組相關(guān)基因都發(fā)生了上調(diào)，但是W51 處理組的基因上調(diào)明顯高于對照組。

圖10 差異表達基因的定量PCR 分析Fig.10 Quantitative PCR analysis of differentially expressed genes

3 結(jié)論

ROS 在植物-病原菌相互作用中可能的作用已被證實，如直接的抗菌活性、細胞壁糖蛋白的氧化交聯(lián)、參與信號轉(zhuǎn)導和基因表達[22]。在正常生理情況下，植物組織內(nèi)ROS 的產(chǎn)生與清除維持在一個動態(tài)平衡狀態(tài)，但是機械損傷、病害等逆境脅迫會誘導產(chǎn)生大量的ROS，參與植物的防御反應(yīng)。而過多的ROS 積累對植物細胞具有毒害作用，植物也會通過提高自身ROS 清除系統(tǒng)的活性來抑制其積累，避免ROS 傷害[23]。本研究中，W51 處理誘導的CAT、和SOD 活性的增加形成了一種抗氧化體系，可以清除細胞環(huán)境中過量的H2O2，保護細胞免受氧化損傷。

現(xiàn)有研究表明，誘導果實抗病性可以通過激活抗病相關(guān)酶活性和相關(guān)基因的表達來達成。例如，β-氨基丁酸（β-Aminobutyric acid，BABA）處理提高CHI 和PAL 酶活性的同時，還誘導了CHI 和PAL 相關(guān)基因的表達，從而增強草莓的抗病性[24]。本研究發(fā)現(xiàn)在整個貯藏過程中，W51 處理組的抗病相關(guān)酶CHI 和GLU 活性始終高于對照組，說明W51 可能通過誘導桃果實抗病能力，從而減輕軟腐病的發(fā)生。

綜上所述，W51 可以有效控制桃果實采后腐爛的發(fā)生，并且能夠保持桃子良好的品質(zhì)。W51 可以誘導活性氧相關(guān)酶、抗病相關(guān)酶的活性，提高總酚含量的上升和DPPH 自由基清除能力。另外，W51 還上調(diào)抗病相關(guān)基因PRUPE_1G186500和PRUPE_8G164400和ROX 相關(guān)基因PRUPE_4G018300的表達。同時，體外研究也發(fā)現(xiàn)，W51 可以顯著抑制R.stolonifer菌絲的擴展。這些結(jié)果表明，W51 對桃果實采后病害的防治和保鮮主要是通過直接誘導果實的抗病性，同時通過提升自身的抗氧化能力實現(xiàn)的。綜上，本研究將杰米拉類芽孢桿菌W51 用于桃子采后病害防控，為生防菌處理在果蔬采后保鮮及貯運中的開發(fā)應(yīng)用提供理論支持。