付英杰， 王 肖， 賈玉民， 侯 林， 王建安， 于定榮， 趙穎異

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 日照 276826；2.東阿阿膠股份有限公司，國(guó)家膠類(lèi)中藥工程技術(shù)研究中心，山東 聊城 252201；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

阿膠是傳統(tǒng)動(dòng)物藥，主含膠原蛋白[1]。由于加工時(shí)間長(zhǎng)、步驟繁瑣、輔料多，工藝指標(biāo)難以量化，成分復(fù)雜，產(chǎn)品為隨機(jī)結(jié)構(gòu)的水解物。阿膠中所含成分是蛋白質(zhì)、肽和氨基酸，還含有豐富的微量元素[2]，其中小肽段組分為阿膠等動(dòng)物藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[3-4]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)膠劑質(zhì)量控制方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。HPLC法精密度高，但耗時(shí)長(zhǎng)、樣品處理難度較大；HPLC-MS法靈敏度最高，但需要大型數(shù)據(jù)庫(kù)的支持，分析費(fèi)用昂貴[5-6]；普通凝膠電泳法簡(jiǎn)單快速，但由于膠劑的分子量是在一個(gè)范圍，因而普遍存在精密度較低、條帶模糊的現(xiàn)象[7-8]。其他方法各有其理論及假說(shuō)支持[9-16]，但相關(guān)設(shè)備的普及性尚顯不足。2015年版《中國(guó)藥典》采用MS法對(duì)阿膠進(jìn)行質(zhì)量控制[1]。研究膠劑時(shí)發(fā)現(xiàn)中藥膠劑水溶液的普通SDS-PAGE電泳譜有2～4條模糊條帶，鑒定依據(jù)不足，然而其胰蛋白酶水解液的Tricine-SDS-PAGE電泳譜出現(xiàn)多條固定位置的細(xì)條帶，且采用不同酶對(duì)動(dòng)物膠進(jìn)行水解，由于不同蛋白酶的酶切位點(diǎn)不同，條帶位置具有一定差異。該法可對(duì)不同物種(阿膠、鹿角膠、龜甲膠)膠劑進(jìn)行分辨，但無(wú)法分辨不同廠家相同物種膠劑，且方法較繁，精細(xì)度不足，僅作為膠劑定性鑒別思路之一[8]。

采用不同蛋白酶對(duì)中藥膠劑進(jìn)行酶解，取不同蛋白酶的酶解產(chǎn)物作為樣品進(jìn)行HPLC特征譜帶研究，相當(dāng)于把1個(gè)樣品劃分為多個(gè)樣品，其顯示的信息量是單一藥材的多數(shù)倍，且由于酶切位點(diǎn)固定，樣品會(huì)按照酶解規(guī)律進(jìn)行裂解，成為固定的低分子量肽，如能進(jìn)行分離，則可顯示其指紋特征性。

1 材料

α-糜蛋白酶(批號(hào)B604BA0026，1 000 U/mg)、胰蛋白酶(批號(hào)C119BA0026，≥300 U/mg)木瓜蛋白酶(批號(hào)B709BA0015，≥3 500 U/mg)、胃蛋白酶(批號(hào)B326BA0296，3 000 U/mg)、胰糜蛋白酶(批號(hào)B329BA0126，2 400∶400 U/mg)均購(gòu)于生物工程(上海)股份有限公司。阿膠(山東東阿阿膠股份有限公司，批號(hào)1305077、1407017、1505039)。其余試劑均為色譜純。

PH-3E酸度計(jì)(南京桑力電子設(shè)備廠)；島津LC-20A高效液相色譜儀[島津國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司]；SYC-15c超級(jí)恒溫水浴(南京桑力電子設(shè)備廠)。

2 方法

2.1 酶解液的制備 阿膠加純水加熱配成體積分?jǐn)?shù)為5%的溶液，40 ℃水浴中酶解4 h，制成胃蛋白酶酶解液(將pH調(diào)至2.0，加胃蛋白酶10萬(wàn)U/g)、胰蛋白酶酶解液(將pH調(diào)至8.0，加胰蛋白酶5 000 U/g)、木瓜蛋白酶酶解液(將pH調(diào)至6.0，加木瓜蛋白酶10萬(wàn)U/g)，接著于95 ℃水浴中滅活20 min，冷卻后依次使用脫脂棉、定量濾紙和0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，得阿膠酶解物樣品。

2.2 色譜條件 Dikma C18色譜柱；流動(dòng)相0.2 mol/L Na2SO4-H3PO4(pH 2.3)(A)-90%乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，90%～84%B；5～25 min，84%～72%B；25～35 min，72%～60%B；35～40 min，60%～48%B)；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

2.3 酶種類(lèi)的篩選 擬篩選蛋白酶種類(lèi)有胃蛋白酶(切斷氨基或羧基端為芳香族氨基酸或亮氨酸的肽鍵)、胰蛋白酶(選擇性的水解蛋白質(zhì)中由賴(lài)氨酸或者精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈)、木瓜蛋白酶(切斷L-精氨酸、L-賴(lài)氨酸、甘氨酸、L-瓜氨酸殘基羧基參與形成的肽鍵)、糜蛋白酶(切斷多肽鏈中的芳香族氨基酸殘基的羧基一側(cè))、胰糜蛋白酶。糜蛋白酶酶解條件為pH 8.0，加酶量25 000 U/g；胰糜蛋白酶酶解條件為pH 8.0，加酶量25 000 U/g。

2.4 蛋白酶用量的考察 按“2.1”項(xiàng)下方法，分別制備胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解液。以峰形、分離度等為指標(biāo)，篩選出蛋白酶的用量。

2.5 干擾因素考察 輔料干擾，由于阿膠在制作過(guò)程中加入了黃酒、豆油、冰糖，因此，需要考慮將這些干擾因素去除，因樣品為水溶液，且經(jīng)過(guò)脫脂棉過(guò)濾，已經(jīng)去除了油脂，所以輔料干擾主要為黃酒和冰糖；試劑干擾，由于在酶解過(guò)程中加入了NaOH調(diào)節(jié)pH，所以可能會(huì)有試劑的干擾峰；蛋白酶的干擾[17]。

按“2.1”項(xiàng)下方法，分別制備黃酒、冰糖(5 g)、黃酒+冰糖、NaOH(pH 8.0)、純水、NaHCO3(pH 8.0)的胰蛋白酶酶解液，以及NaOH (pH 8.0)水溶液、4種酶的水溶液。上述樣品均配制5 mL，以確定干擾峰。

2.6 精密度試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下方法，分別制備阿膠的胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解液。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件，以S1為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗為0.2 min，進(jìn)行全譜峰匹配，然后計(jì)算相似度，酶解液相似度分析結(jié)果應(yīng)達(dá)到0.90以上，且主要色譜峰的保留時(shí)間及峰面積RSD<5%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下方法，分別制備胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解液，當(dāng)日不進(jìn)樣的樣品迅速冷凍，在第2、3、4、5天融化后分別進(jìn)樣。以第1天色譜圖作為對(duì)照，考察同一批阿膠在制成樣品后的穩(wěn)定性。

2.8 重現(xiàn)性試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下方法，分別制備胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解液。以相似度為指標(biāo)，考察使用不同C18色譜柱、不同人員進(jìn)行HPLC獲得色譜圖的重現(xiàn)性。

2.9 驗(yàn)證性試驗(yàn) 隨機(jī)稱(chēng)取3批次的阿膠各10 g，按“2.1”項(xiàng)下方法，分別制備胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶酶解液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。截取5～40 min色譜圖，扣除掉干擾進(jìn)行結(jié)果分析。

3 結(jié)果

3.1 酶種類(lèi)的篩選 由圖1可知，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶酶解液分離出較多峰，其次為胃蛋白酶，而胰糜蛋白酶有較多小峰，難以與噪音區(qū)分，這是因?yàn)殡p酶合用，酶解后形成的肽分子量小，且酶解產(chǎn)物更不穩(wěn)定，因此棄用胰糜蛋白酶。

注：S1為胃蛋白酶酶解，S2為胰蛋白酶酶解，S3為木瓜蛋白酶酶解，S4為糜蛋白酶酶解，S5為胰糜蛋白酶酶解。

3.2 蛋白酶用量的考察 由圖2可知，胃蛋白酶用量在1×105U/g以下時(shí)，峰形有變化，加大酶量，峰形基本不變。因此，胃蛋白酶加酶量選擇為1×105U/g。同理，胰蛋白酶為25 000 U/g，木瓜蛋白酶為3×105U/g，糜蛋白酶為 25 000 U/g。

注：A為胃蛋白酶酶解，B為胰蛋白酶酶解，C為木瓜蛋白酶酶解，D為糜蛋白酶酶解。S1為原酶量(胃蛋白酶的原酶量為1×105 U/g，胰蛋白酶的原酶量為5 000 U/g，木瓜蛋白酶的原酶量為1×105 U/g，糜蛋白酶的原酶量為5 000 U/g)，S2為3倍原酶量，S3為5倍原酶量，S4為1/5倍原酶量，S5為7倍原酶量。

3.3 干擾因素排除 由圖3～4和表1可知，輔料黃酒在9.0、13.6、14.9、17.1 min出峰，冰糖在8.9、11.8 min出峰，峰面積較大，按阿膠中含有0.5%輔料量進(jìn)行計(jì)算，其峰面積均應(yīng)在10 000以下，對(duì)阿膠酶解液的低肽或蛋白出峰干擾可忽略不計(jì)；而試劑水、NaOH、NaHCO3在整個(gè)過(guò)程中并沒(méi)有出峰，說(shuō)明輔料及試劑對(duì)阿膠特征峰沒(méi)有干擾。胰蛋白酶除在19.8 min處有一小的干擾，其他峰面積均小于10 000，其干擾可以忽略不計(jì)；胃蛋白酶在12.0 min處有一干擾峰；糜蛋白酶在10.4、12.0、14.6 min處有3個(gè)干擾峰；木瓜蛋白酶效果較差，在7.1、9.1、12.3、12.8、14.2、15.0 min有6個(gè)干擾峰，因此在后續(xù)試驗(yàn)中，需要扣除掉這些干擾峰。

注：S1為黃酒的胰蛋白酶酶解液，S2為冰糖的胰蛋白酶酶解液，S3為黃酒+冰糖的胰蛋白酶酶解液，S4為NaOH的胰蛋白酶酶解液，S5為純水的胰蛋白酶酶解液，S6為NaOH水溶液，S7為NaHCO3的胰蛋白酶酶解液。

注：S1為胃蛋白酶空白，S2為胰蛋白酶空白，S3為木瓜蛋白酶空白，S4為糜蛋白酶空白。

3.4 精密度試驗(yàn) 同一批樣品連續(xù)測(cè)定，扣除酶干擾，選取時(shí)間窗0.2 min，匹配數(shù)目6。所有峰的保留時(shí)間RSD均<2%，峰面積RSD除木瓜蛋白酶8.25 min處外均在2%～10%。木瓜蛋白酶6次試驗(yàn)中5次相似度>0.9，胰蛋白酶和糜蛋白酶精密度及相似度均符合要求。胃蛋白酶的相似度不達(dá)標(biāo)，在15～40 min處出現(xiàn)基線漂移，但5～12 min峰形重復(fù)較佳。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在相同條件下于不同日期對(duì)阿膠樣品進(jìn)行檢測(cè)，峰形逐漸發(fā)生變化，相似度逐漸下降，以相似度<0.9為依據(jù)，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶酶解物分別在2、4、3 d之后不可用，因此，樣品最好當(dāng)日或第2天進(jìn)樣。

表1 各種干擾成分對(duì)比參數(shù)

3.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 分別采取不同型號(hào)的色譜柱和3名試驗(yàn)人員分別對(duì)4種酶解物進(jìn)樣5次，峰形不變，所有樣品相似度均>0.9，表明方法重現(xiàn)性良好。

3.7 驗(yàn)證性試驗(yàn) 按匹配數(shù)目3、時(shí)間窗為0.2 min，并扣除酶干擾。胃蛋白酶特征峰為6.6 min，保留時(shí)間RSD為5.33%，峰面積RSD為22.6%，相似度均<0.9，不符合要求。胰蛋白酶特征峰在6.5、11.3、11.5、12.4 min處，保留時(shí)間RSD分別為1.19%、0.42%、0.42%、0.41%，峰面積RSD分別為24.96%、4.43%、14.82%、27.54%，相似度均>0.9。木瓜蛋白酶特征峰在10.9、11.3、11.8 min處，木瓜蛋白酶空白峰分布于9～15 min，干擾較大、峰形雜亂，保留時(shí)間RSD分別為0.2%、1.44%、1.91%，峰面積RSD分別為19.45%、27.3%、18.09%，相似度均>0.9。糜蛋白酶特征峰在13.0、13.4、13.8、15.1、18.2、33.6 min處，保留時(shí)間RSD分別為0.47%、0.51%、0.47%、0.45%、0.41%、0.19%，峰面積RSD分別為9.89%、9.24%、9.84%、14.64%、23.18%、5.36%，相似度均>0.9。見(jiàn)表2、圖5。

表2 驗(yàn)證性試驗(yàn)相似度結(jié)果

4 討論

中藥植物藥指紋圖譜的特征峰RSD小于5%[18]。蛋白類(lèi)色譜圖通常分離度較差[19]。在重現(xiàn)性試驗(yàn)中，由于不同色譜柱的保留時(shí)間有差異，難以調(diào)整T值一致，但采用調(diào)整時(shí)間窗為0.2，以相似度為指標(biāo)，來(lái)判定峰形的一致性。本研究中流動(dòng)相的酸及鹽濃度均較高，對(duì)于普通C18色譜柱具有一定磨損。

圖5 驗(yàn)證性試驗(yàn)東阿阿膠HPLC色譜圖

盡可能獲得酶解程度一致的樣品，這就需要使用蛋白酶充分水解阿膠藥材以獲得成分較為穩(wěn)定的小肽?；诖耍x用蛋白酶酶解的最長(zhǎng)時(shí)間4 h，以及最適pH值以獲得蛋白酶的最大活力。

針對(duì)阿膠質(zhì)量控制上樣品信息不全面以及指紋圖譜空缺，通過(guò)多種蛋白酶酶解物，無(wú)需質(zhì)譜，僅需使用原有液相儀器即可。由于使用多酶解物樣品進(jìn)樣，且方法為指紋圖譜而非單一成分，摻假難度極大，對(duì)打擊混偽品有較大的應(yīng)用價(jià)值。采用不同蛋白酶的酶解產(chǎn)物作為樣品進(jìn)行特征譜帶研究，其信息量更大，且由于酶切位點(diǎn)固定，各樣品的酶解物組成相對(duì)穩(wěn)定。

本研究為后續(xù)進(jìn)行的酶解物-HPLC法對(duì)阿膠的特征峰及規(guī)律研究提供方法學(xué)基礎(chǔ)，并為中藥膠劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一種新思路。