艾則孜·艾海提，安夢宇

椎間盤退變性變（intervertebral disc degeneration，IVDD）是導致慢性腰背痛的常見病因之一，與遺傳、生活方式和衰老有關，但分子機制尚不明確[1]。最近研究表明，髓核（nucleus pulposus，NP）細胞簇的形成、軟骨組織增生及纖維化在IVDD 的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[2]。 雖然microRNAs（miRs）與多種病理生理過程有關[3]，然而miRs 在IVDD 中的作用尚不清楚。miR-21 是目前研究較多的一種miRs，與多種疾病有關[4]。 miR-21 與軟骨細胞凋亡、增殖和軟骨基質生成有關[5]。參與細胞增殖的通路較多，磷酸酶和張力蛋白同源物 （phosphatase and tensinhomolog，PTEN）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（protein kinase B，Akt）是其中研究較多的一種，磷脂酰肌醇-3 磷酸（phosphatidylinositol 3-phosphate，PIP3）受PTEN/Akt 通路參與了人退行性變NP 細胞的自噬、增殖[6]。然而miR-21 與PTEN/Akt 信號通路在NP 細胞增殖過程中的作用尚不清晰。筆者分析了miR-21 在IVDD 發(fā)病中的功能，希望為IVDD 的診治、預防提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞

人NP 細胞（李龍實驗室捐贈）。

1.1.2 臨床材料

選擇2017 年9 月至2020 年9 月腰椎間盤突出患者30 例，其中男性21 例，女性9 例；年齡29 ～56歲，平均年齡46.18 歲（標準差7.84 歲）。 選擇同時期4 例特發(fā)性脊柱側凸患者為正常對照組， 其中男性3例，女性1 例；年齡18 ～22 歲，平均年齡20.38 歲（標準差1.53 歲）。 患者均書面簽訂同意書，上報筆者所在醫(yī)院倫理委員會批復。

1.1.3 主要試劑與儀器

改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）（BI 公司， 以色列）；miR-NC、miR-21-mimic、突變型（mutant type，MUT）-PTEN 和 野生型（Wild type，WT）-PTEN（蘇州金唯智公司，中國）；LipofectAMINE 2000 （Thermo 公司， 美國）； 兔抗人PTEN、周期素D1（CyclinD1）、Akt、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（p-Akt）、三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆一抗、 鼠抗兔二抗（北京中山金橋生物有限公司，中國）；Akt 抑制劑Ly294002、 四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、RNA 提取試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（天津順佳生物有限公司，中國）；酶標儀、ABI 7900 PCR擴增儀（寧波SCIENTZ 公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1 組織標本收集

在無菌條件下取NP 組織樣本，檢測標本于液氮中保存。

1.2.2 細胞培養(yǎng)、轉染和分組

用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)NP 細胞。 利用轉染試劑將不同物質轉染到細胞，分為Untreated 組（未進行任何處理）、Scramble 組（轉染miR scramble）、miR-21 組（轉染miR-21-mimic）。 將Ly294002、 二 甲 基 亞 砜（dimethylsulfoxide，DMSO）分別加入上述各組，進而觀察細胞生物學行為的改變。

契約精神是人類在長期的契約實踐中培育形成的理想信念、價值觀念、思維方式，行為方式、行為規(guī)范等精神性成果。契約精神從經濟交往中產生、發(fā)展，然后滲透到社會、政治、文化領域，成為人類文明的一道蔚為壯觀的風景，影響并塑造著人類的歷史。近代，伴隨著資本主義工業(yè)化和民主政治的發(fā)展，契約精神成為資本主義社會的精神支柱，同時超越國家、民族的限制，成為人類共同的精神財富，有力地指導著人們的行動，成為現代公民和現代社會的基本精神?！?〕

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測miR-21水平

將NP 組織樣本用超聲波打碎，經胰酶消化成單細胞，離心后去除沉淀，保留上清液。向上清液中加入TRIzol，提取總RNA。合成DNA，反應體系：90 ℃30 s，95 ℃10 s，70 ℃30 s，85 ℃10 s，共30 循環(huán)。 以2-△△Ct法表示miR-21 表達量。

miR-21 引物上下游分別為：5′-ACACTCCAGCTGGGTAACACTGTAA-3′，5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；PTEN 引物上下游分別為：5′-ACGCATTTACTGTCACGGTTCC-3′，5′- CGATGGGGTTCCGGCTTCAG-3′；U6 上 下 游 分 別 為：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4 熒光素酶實驗驗證miR-21 與磷酸酶和張力蛋白同源物的靶向關系

分別將WT-PTEN 或MUT-PTEN 質粒分別與miR空載質粒、miR-21-mimic 一起轉染NP 細胞，孵育48h，吸去培養(yǎng)液。 用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗3 次，裂解細胞，于4 ℃、1 500 r/min 條件下離心5 min，保留上清液，上機檢測。

1.2.5 MTT 檢測細胞增殖能力

將5×105/L 細胞懸液鋪于96 孔板，設置復孔3個， 分 別 于 培 養(yǎng)0、24、48、72、96 h 時 加 入20 μL MTT，常溫4 h 去上清液，加入150 μL DMSO，室溫孵育30 min；上機檢測光密度值。

1.2.6 Western blot 檢測

用6 孔板每孔加入200μL 裂解液，冰上放置30min，于14.0×g 條件下離心5 min，保留上清液，于100 ℃煮10 min。配膠，各孔中加入20 μg 蛋白，電泳1 h，轉膜，用5 %封閉液慢搖1 h，逐次兔抗人PTEN（1 ∶1 500）、CyclinD1（1 ∶1 000）、Akt（1 ∶1 000）、p-Akt（1 ∶1 000）一抗、二抗（1 ∶2 500）。曝光成像，用Image J 測灰度值。 測量PTEN、CyclinD1、Akt、p-Akt 水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用Prism 8 軟件分析數據。計數資料采用均數±標準差表示，組間t 檢驗，多組間單因素方差分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-21 mRNA 在髓核組織中的表達

IVDD NP 組織miR-21 mRNA 水平（2.62±0.12）明顯高于正常NP 組織 （0.34±0.07）（t=36.850，P=0.000）。

2.2 過表達miR-21 對細胞增殖的影響

與Untreated 組、Scramble 組相比，miR-21 組細胞miR-21 含量增加（P=0.000、0.000）。 72、96 h 時，miR-21 組細胞活力（2.59±0.33、3.75±0.55）明顯高于Untreated 組（1.63±0.27、2.05±0.41）、Scramble 組（1.65±0.31、2.07±0.48）（P<0.05）。 miR-21 組CyclinD1 蛋白表達水平明顯高于Untreated 組、Scramble組（P=0.000、0.000）。 見圖1、表1。

圖1 3 組細胞增殖能力和CyclinD1 蛋白表達水平比較曲線和電泳圖Fig.1 Comparison curves and electropherogram of cell proliferation ability and CyclinD1 protein expression levels in 3 groups

表1 3 組miR-21 水平、CyclinD1 蛋白水平比較Tab.1 Comparison of miR-21 level and CyclinD1 protein level in 3 groups

2.3 miR-21 與磷酸酶和張力蛋白同源物的靶向關系

通過生物學信息軟件分析發(fā)現，miR-21 與WT-3′UTR-PTEN 存在一定數量的互補堿基對。熒光素酶實驗表明， 轉染miR-21-mimic+WT-PTEN 的細胞熒光素酶活性（0.31±0.09）低于轉染miR scramble+WT- PTEN 組 （0.84 ± 0.11）（t = 6.459, P = 0.003）。miR-21 組細胞PTEN 蛋白、PTEN mRNA 表達水平明顯低于Untreated 組、Scramble 組（P<0.05）。 見圖2和表2、3。

表2 3 組PTEN 蛋白、mRNA 水平比較Tab.2 Comparison of PTEN protein and mRNA levels in 3 groups

圖2 miR-21 與PTEN 的靶向關系和3 組PTEN 蛋白表達水平比較電泳圖Fig.2 Diagrams of targeting relationship between miR-21 and PTEN and electropherogram of comparison PTEN expression levels in 3 groups

2.4 3 組細胞Akt、p-Akt 蛋白表達水平

3 組Akt 蛋白含量差異無統(tǒng)計學意義，miR-21組p-Akt 蛋白相對表達量高于其他兩組（P<0.05）；3組間p-Akt/Akt 比較 （1.44±0.32、1.58±0.42、9.45±1.34），差異有統(tǒng)計學意義（F=12.034，P=0.000）。 見圖3。

圖3 3 組細胞Akt、p-Akt 蛋白含量Fig. 3 Diagrams of Akt and p-Akt protein contents of cells in 3 groups

2.5 Ly294002 對細胞增殖的影響

72、96 h 時，Ly294002+miR-21 組細胞活力明顯低于DMSO+miR-21 組（P<0.05）。 見表4。

表4 3 組72、96 h 細胞活力比較Tab.4 Comparison of cell viability at 72-hour and 96-hour in 3 groups

2.6 Ly294002 對細胞CyclinD1 蛋白的影響

加入Ly294002 后，Untreated 組、Scramble 組細胞CyclinD1 蛋白表達水平無改變，miR-21 組細胞加入Ly294002 后CyclinD1 蛋白表達水平降低（P<0.01）。見圖4、表5。

表5 3 組72、96 h CyclinD1 蛋白水平比較Tab.5 Comparison of CyclinD1 protein levels at 72-hour and 96-hour in 3 groups

圖4 Ly294002 對3 組細胞CyclinD1 蛋白的影響的電泳圖Fig.4 Electropherograms of effect of LY294002 on CyclinD1 protein in 3 groups

表3 Scramble 組熒光素酶活性與miR-21 組比較Tab. 3 Comparison of luciferase activities between Scramble group and miR-21 group

3 討論

IVDD 是老年人常見的慢性疾病，多項研究提示miRs 在退行性變NP 組織中差異表達[7，8]。 miR-21 與腫瘤的惡性生物學行為有關[9，10]。但miR-21 在IVDDNP 組織中的表達及其在IVDD 發(fā)病機制中的作用尚不清楚。 筆者研究結果顯示，IVDD 患者NP 組織中miR-21mRNA 水平顯著升高，miR-21 mRNA 水平升高可能是由于椎間盤的局部炎癥和相關的創(chuàng)傷后的反應結果。先前研究表明，miR-21 在血小板衍生生長因子治療后上調[11]，但miR-21 過表達的確切機制仍有待闡明。 筆者用miR-21 轉染NP 細胞，結果顯示，miR-21 過表達的NP 細胞增殖能力顯著增強， 并上調了周期蛋白CyclinD1 表達。已有研究表明[12]，NP 細胞團簇和軟骨組織的增殖參與了IVDD 的發(fā)生，筆者研究結果提示miR-21 上調誘導NP 細胞增殖可能是IVDD 發(fā)生的可能機制。

PTEN 是一種抑癌基因，可使PIP3 脫磷酸，抑制磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/Akt通路，增強細胞凋亡，抑制細胞生長[13]。研究發(fā)現[14～16]，PTEN/Akt 通路可促進腫瘤細胞的惡性生物學行為。但PTEN/Akt 通路與NP 細胞、miR-21 的關系不詳。有研究表明miR-21 可調控PTEN， 促進血管上皮細胞的增殖，抑制凋亡[17]。 王濤等[18]研究結果顯示，miR-21 可通過PTEN 抑制肝癌細胞凋亡。 筆者研究結果顯示，過表達miR-21 的NP 細胞低表達PTEN，雙熒光素酶實驗表明兩者存在靶向關系。 這些結果表明miR-21 通過直接靶向PTEN 促進NP 細胞的增殖。

Akt 與P13K 共同組成P13K/Akt 信號通路[19]。Akt 通路與細胞凋亡、增殖密切相關[20，21]。 張健博等[22]研究發(fā)現，miR-378c 可通過Akt1 抑制骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖， 促進凋亡。 筆者研究結果顯示， 過表達miR-21 的NP 細胞高表達p-Akt， 加入Akt 抑制劑Ly294002 后，miR-21 過表達對NP 細胞的增殖效應被阻斷， 說明miR-21 通過Akt 通路促進了NP 細胞增殖。

總之，miR-21 在退行性變NP 中高表達，可能與調控PTEN/Akt 通路有關。 但更為詳細的機制有待進一步體內實驗驗證。