郝冬梅，樊瑩，徐進，郭岳琴，李繼蓮，姚軍*

（1.中國農業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100093；2.貴州省畜禽遺傳資源管理站，貴陽 550001）

地熊蜂（Bombus terrestris）屬于蜜蜂總科（Apidae）熊蜂屬（Bombus），其不僅采集能力強[1]，而且環(huán)境適應能力強，具有耐熱、耐濕、耐寒、可規(guī)?；曫B(yǎng)和易運輸?shù)忍攸c[2-3]，已大規(guī)模的應用于農業(yè)授粉中。地熊蜂的生長發(fā)育有卵、幼蟲、蛹、成蜂4 個階段，其中，幼蟲和成蜂階段是營養(yǎng)攝入的主要階段，此階段提供優(yōu)質、充足營養(yǎng)的飼料與熊蜂規(guī)?；曫B(yǎng)和后期授粉應用關系密切。在為設施作物授粉期間，單一作物的花粉很難提供熊蜂生長發(fā)育所需全部營養(yǎng)，適當?shù)臓I養(yǎng)強化則有助于延長熊蜂的授粉周期。在熊蜂工廠化繁育中，盡管目前人工飼養(yǎng)技術已逐漸成熟[4]，但為了飼養(yǎng)更強健、授粉周期更長的蜂群，都會對飼料配方進行不斷優(yōu)化。蛋白質是熊蜂所必需的營養(yǎng)，對成年蜜蜂的免疫應答、壽命有積極影響[5-6]。氨基酸是大多數(shù)生物合成蛋白質的基礎，對蜜蜂生長、發(fā)育起關鍵作用，影響營養(yǎng)需求的平衡，成年蜂的飛行能力、健康和壽命也與其有關，最終將影響授粉效果。因此了解成年熊蜂的氨基酸需求對熊蜂規(guī)?；曫B(yǎng)和授粉應用都十分重要。

除了參與蛋白質合成外，氨基酸在調節(jié)基因表達、細胞信號、抗氧化反應和免疫反應方面發(fā)揮著重要作用[7]。食物中補充谷氨酰胺或精氨酸可增加小腸與脂肪組織中抗氧化基因的表達，降低促炎基因的表達；谷氨酸與天冬氨酸調節(jié)還原當量物通過線粒體膜的轉移，從而調節(jié)糖酵解和細胞氧化還原狀態(tài)；色氨酸通過吲哚胺2,3-雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）的分解代謝對巨噬細胞和淋巴細胞的免疫功能有著重要作用。

氨基酸在營養(yǎng)學中分為必需氨基酸和非必需氨基酸，其中，生物體內無法自行合成必需氨基酸，必需通過食物獲得，而蛋白質種類決定昆蟲消化產生必需和非必需氨基酸的比例和類型[8-9]，單一種類花粉通常不能滿足熊蜂發(fā)育所需的氨基酸。與非必需氨基酸相比，飼喂含有必需氨基酸飼料可增加哺育蜂頭部與覓食蜂胸部重量，通過頭部與胸部質量可反映蜜蜂腺體與肌肉發(fā)育情況[10]，并且蜜蜂對必需氨基酸的偏好高于非必需氨基酸[11]。研究發(fā)現(xiàn)，向日葵花粉中蛋氨酸與色氨酸含量低，導致使用向日葵花粉飼喂的熊蜂蜂群幼蟲重量顯著低于其他花粉組[5,12]，飼喂單一向日葵花粉會降低工蜂壽命，抑制新出房工蜂咽下腺發(fā)育[13]。Groot[14]通過籠養(yǎng)試驗確定了蜜蜂所需的10 種必需氨基酸。熊蜂對必需氨基酸的需求與蜜蜂相似，但熊蜂對氨基酸的需求量鮮有報道，因此有必要進一步深入研究不同氨基酸對熊蜂發(fā)育的影響。

自然界中，熊蜂一般采集蛋白質豐富、氨基酸含量高的混合花粉[15]，氨基酸含量高的花粉可提高熊蜂產卵率與幼蟲質量[16]。如果飼料中缺乏某種必需氨基酸或氨基酸含量低都會抑制熊蜂蜂群的發(fā)育。熊蜂飼糧中，必需氨基酸水平過高會導致體內增加過多氮排泄物，從而縮短壽命[17]。

賴氨酸是蜜蜂生長發(fā)育必需的，在動物體內參與酶、血清蛋白、激素等蛋白質的合成，對脂肪代謝、免疫功能方面有著重要作用[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中不同賴氨酸水平對肉雞日增重和仔雞血清中白蛋白、總膽固醇尿素氮有著顯著影響[20]。Chen 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，賴氨酸缺乏導致肉雞體內對新城病毒抗體水平下降。此外，飼糧中添加賴氨酸可顯著提高單胃型肉用動物的肌肉蛋白質含量與大菱鲆的粗蛋白含量[22-23]。當豬飼料中賴氨酸水平降低時，肌內脂肪含量增加，腰眼面積減少[24]。對于蜜蜂，賴氨酸、色氨酸等氨基酸在蜜蜂生長中起關鍵作用，并影響營養(yǎng)需求的平衡[25]；Groot[26]研究表明西方蜜蜂對賴氨酸的適宜需求量為3%；王帥等[27]推薦意大利蜜蜂幼蟲對賴氨酸需求量為11.08～16.08 mg·g-1。對于畜禽養(yǎng)殖，賴氨酸是谷類蛋白質的第一限制氨基酸，而對于熊蜂全價飼料或氨基酸營養(yǎng)補充劑的研發(fā)，谷物是最易于獲取的原料來源。因此，本研究首選了賴氨酸作為研究重點。

代謝組學是研究生物體系代謝途徑的學科，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分?；诖x組學分析熊蜂血淋巴的生物標志性成分有助于改善熊蜂健康監(jiān)測和鑒別營養(yǎng)壓力來源[28]。本研究擬通過飼喂熊蜂含有一定水平賴氨酸的飼糧，通過液相色譜∕質譜聯(lián)用技術（liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS）檢測其對熊蜂工蜂血淋巴代謝的影響，同時采用主成分分析（principal component analysis,PCA）和正交偏最小二乘法-判別分 析（orthogonal partial leastsquaresdiscriminant analysis,OPLS-DA），篩選對熊蜂工蜂血淋巴代謝影響的差異代謝物，并結合代謝通路數(shù)據庫（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）探討涉及賴氨酸代謝的通路，有助于了解賴氨酸對熊蜂的生理功能，發(fā)掘對熊蜂生長、發(fā)育和壽命有利的因素。

1 材料與方法

1.1 供試蜂群

供試熊蜂由中國農業(yè)科學院蜜蜂研究所傳粉蜂生物學與授粉飼養(yǎng)室提供。選擇群勢相當?shù)慕】捣淙?，共選取體質量相近的1 日齡工蜂140 只，置于同一蜂箱中，隨后從中隨機選取5 只工蜂組成無王工蜂群，共28 個。將28 個無王蜂群分為4 組，分別飼喂4 種不同賴氨酸含量的糖水，每組7個重復，溫度為（26±2）℃，相對濕度為60%±5%，黑暗條件下進行飼養(yǎng)。

1.2 飼糧配置

供試飼糧為60%（質量體積分數(shù)）蔗糖水溶液，含18種氨基酸（賴氨酸、精氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、胱氨酸、酪氨酸、羥脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸），總氨基酸添加量為蔗糖（干質量）的3%。除賴氨酸外，各種氨基酸添加量參照酪蛋白中氨基酸組成添加。所用氨基酸均為L-型氨基酸，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。賴氨酸處理設置4 個水平，添加量分別占總氨基酸的0%（對照）、2%、4%、6%。

1.3 飼喂管理

4 組工蜂群分別飼喂4 種不同含量賴氨酸的飼糧，9:00—10:00 飼喂，飼喂結束后將瓶中剩余的蔗糖與氨基酸混合液清除掉，并清洗飼喂瓶，每隔3 d 飼喂1 次，注入新熬制的蔗糖與氨基酸混合液。每天觀察微蜂群情況，及時將死亡的工蜂移除，至20 日齡時終止飼喂，完成試驗蜂群的整個飼養(yǎng)階段。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 工蜂存活率 在試驗期間，每天觀察每組工蜂死亡情況，并記錄死亡數(shù)量。

1.4.2 工蜂肌肉蛋白含量 試驗結束后每個處理隨機選取工蜂，稱重后取出胸部肌肉，加入0.9%的生理鹽水，使用微型渦旋震蕩器（QL-901，江蘇南海市其林貝爾儀器制造有限公司）勻漿，2 500 r·min-1離心10 min后取上清液。采用總蛋白定量測試盒（A045-2-2，南京建成生物工程研究所）測定胸部蛋白含量，每組處理5個重復。

1.5 血淋巴代謝物提取和檢測

1.5.1 樣品采集 無王蜂群飼養(yǎng)至15 日齡時，隨機選取工蜂10 只，選取頭部一端觸角，使用70%乙醇對觸角周圍的區(qū)域消毒，隨后用鑷子去除該觸角，輕輕按壓工蜂腹部至工蜂觸角部位出現(xiàn)血淋巴，立即用移液槍將其吸出[29]，收集于1.5 mL離心管，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.5.2 代謝物提取和檢測 利用100%甲醇提取血淋巴中的代謝物，每個處理組6 個平行。將凍存的樣品在冰上充分解凍，取10μL 淋巴樣品，加入50μL甲醇，超聲10 min,使樣品充分溶解，4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，取上清液于內襯管中，置于2 mL棕色進樣瓶中供LC-MS分析。

超高效液相色譜系統(tǒng)（Ultimate 3000，美國Thermo Fisher Scientific 公司）檢測條件：ACQUITY BEH Amide 色譜柱（Waters，150 mm×2.1 mm，1.7 μm），進樣量2 μL，柱溫50 ℃；流動相A 為30%乙腈溶液（含0.1%甲酸和10 mmol 甲酸銨），流動相B 為95% 乙腈溶液（含0.1% 甲酸和10 mmol 甲酸銨），流速0.3 mL·min-1。梯度洗脫：0.0～1.0 min，100% B；1.1～11.0 min，100%～30%B；11.1～11.5 min，30%～100%B；11.6～15.0 min，100%B。

質譜儀（Q-Exactive，美國Thermo FisherScientific公司）采用HESI離子源，在正、負離子切換模式下采集。參數(shù)設置：離子源溫度320 ℃，噴霧電壓正離子3.5 kV 和負離子3.0 kV，鞘氣體流速40 arb，輔助氣流速5 arb，S-lens 射頻電壓60%，母離子掃描分辨率70 000，掃描范圍70～1 000 m·z-1，自動增益控制目標離子數(shù)1×106，最大離子注入時間50 ms，掃描速率1 scan·s-1。

1.6 數(shù)據分析

1.6.1 蛋白質含量統(tǒng)計分析 工蜂胸部蛋白含量利用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，組間比較采用最小顯著性差異法（LSD 法）；生存曲線采用Logrank 檢驗分析，統(tǒng)計結果以P＜0.05 具有統(tǒng)計學差異，使用Graphpad Prism 8軟件進行圖表的繪制。

1.6.2 代謝組學數(shù)據分析 將原始代謝組學數(shù)據Raw 文件導 入Compound Discoverer 2.1軟件（Thermo Fisher Scientfic）進行離子峰識別、峰對齊、峰面積歸一化處理及數(shù)據庫搜索，使用KEGG（http:∕∕www.genme.jp∕kegg∕）和HMDB（http:∕∕www.hmdb.ca∕）數(shù)據庫進行化合物鑒定。隨后采用MetaboAnalyst 5.0 進行統(tǒng)計學和富集分析：通過主成分分析反映處理組間的樣本總體代謝差異；正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial leastsquares-discriminant analysis,OPLS-DA）反映組內樣本間的變異度大??；對OPLS-DA 圖驗證模型是否穩(wěn)定和出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，其中R2X和R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率，Q2表示模型的預測能力，Q2＞0.5 表示模型具有較好的判別分析能力，Q2與R2越接近說明模型越穩(wěn)定且無過擬合現(xiàn)象。根據變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值＞1、P值＜0.05、FC 值＞1.5或FC 值＜1∕1.5篩選差異代謝物，最后進行富集分析。

2 結果與分析

2.1 飼糧賴氨酸水平對工蜂胸部肌肉蛋白含量的影響

由圖1 可知，隨著飼糧賴氨酸水平的增加，20 日齡工蜂胸部肌肉蛋白含量呈上升趨勢。與飼糧無賴氨酸對照（0%）相比，飼糧賴氨酸含量4%時工蜂胸肌肉部蛋白含量顯著升高。當賴氨酸水平提高至6%時，胸部肌肉蛋白含量顯著高于2%和0%處理組（P＜0.05）。

圖1 不同處理下工蜂胸部肌肉蛋白含量Fig.1 Chest muscle protein content of worker bees under different treatment

2.2 飼糧賴氨酸對工蜂死亡數(shù)量的影響

在不同的賴氨酸添加量飼喂中，熊蜂的存活率不同（χ2=21.70，P＜0.001）。由圖2和表1可以看出，當飼料中缺乏賴氨酸（0%）時，工蜂存活率最低，賴氨酸水平為6%時，工蜂存活率最高，且兩處理間差異極顯著（P＜0.001）；賴氨酸水平為2%與4%時，工蜂存活率相近，組間差異不顯著。

表1 不同賴氨酸水平下工蜂存活率的差異Table 1 Differences in survival rate of workerbees under different lysine levels

圖2 不同賴氨酸水平下工蜂存活率Fig.2 Survival rate of worker bees under different lysine levels

2.3 工蜂血淋巴代謝組學分析

2.3.1 主成分分析 對飼喂賴氨酸水平為0%與6%的工蜂血淋巴代謝物進行主成分分析，結果如圖3 所示?？梢钥闯?，0%的賴氨酸飼喂組與6%飼喂組差異明顯。為了更準確地顯示2 種賴氨酸含量對工蜂血淋巴的代謝物影響，使用正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）模型進行了深入分析，血淋巴代謝物OPLS-DA 得分如圖4 所示。對模型進行排序驗證，參數(shù)為：R2X（cum）=0.725。R2Y（cum）=0.998，Q2（cum）=0.996，Q2＞0.5，且Q2與R2Y相接近，表明模型穩(wěn)定可靠，沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象。

圖3 PCA得分Fig.3 PCA score scatter plot

圖4 OPLS-DA 得分圖Fig.4 OPLS-DA score scatter plot

2.3.2 差異代謝物的鑒定與分析 如表2 所示，通過OPLS-DA 分析，根據VIP＞1、P＜0.05、FC 值＞1.5 或FC 值＜1∕1.5 的標準，經KEGG、HMDB 數(shù)據庫檢索，共鑒定出28 種差異代謝物，包括氨基酸及其衍生物、嘌呤類化合物等，其中，含量上升的物質有10 種，下降的物質有18 種。哌啶酸、L-酵母氨酸、黃嘌呤上升差異倍數(shù)最為顯著，可能是飼糧中賴氨酸含量增加導致。而過量賴氨酸可能影響其他氨基酸的吸收，如組氨酸等。

表2 差異代謝物Table 2 Differential metabolites

2.3.3 KEGG 富集分析 KEGG 通路富集顯示，28 種差異代謝物富集到了20 條代謝通路（表3），其中，5 條具有顯著差異的富集通路：組氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，精氨酸生物合成，嘌呤代謝，泛酸和輔酶A生物合成。

表3 KEGG 通路富集詳情Table 3 Enrichmegnt of KEGG pathway

3 討論

3.1 飼糧賴氨酸水平對工蜂生長的影響

賴氨酸作為必需氨基酸，其主要作用是參與機體蛋白質合成，如血清蛋白、酶、多肽、激素等。長期進食低賴氨酸飼料會降低大鼠體內血清球蛋白與β-球蛋白的含量抑制肝臟蛋白質的合成，影響大鼠的生長[30]。當飼料中賴氨酸水平增加時，大鼠大腦、肝臟和腎的蛋白含量也隨之增加[31]。當賴氨酸水平為6%時，工蜂胸部肌肉蛋白含量達到為47.53 mg·mL-1。

工蜂的壽命是衡量熊蜂授粉價值的重要指標，飼糧中不同賴氨酸水平對其壽命影響很大，當飼糧中賴氨酸水平為0%時，工蜂存活率最低，且隨著時間的增加死亡數(shù)量也在增加。這可能是熊蜂飼糧中缺乏賴氨酸，導致一些蛋白無法合成，從而無法滿足工蜂生長發(fā)育的需求。當賴氨酸水平增加至2%和4%時，工蜂死亡數(shù)量減少；當賴氨酸水平增加至6%時，工蜂僅在前5 日內有工蜂死亡，且死亡數(shù)量最少，與其他3 組存活率存在極顯著差異。綜上可知，飼糧中賴氨酸水平為6%時，工蜂存活率最高。隨著賴氨酸水平增加，工蜂生存率隨之上升，這可能與體內蛋白質含量增加有關。

3.2 賴氨酸對工蜂代謝的影響

在5 條顯著富集通路中，組氨酸代謝為極顯著（P＜0.01）富集通路。有3 種顯著差異代謝物富集到了組氨酸代謝通路中，其中2 種為下調，包括組胺、尿刊酸，L-天冬氨酸為上調。在血淋巴代謝物中，組氨酸含量出現(xiàn)下調（FC=0.80），這可能與賴氨酸水平過高有關。賴氨酸水平過高可能會抑制腸道對其他氨基酸的消化吸收，從而使其他氨基酸在機體內含量降低。研究發(fā)現(xiàn)，不同賴氨酸水平飼糧喂食生長豬，其肝門靜脈血清中組氨酸含量隨著賴氨酸水平的增加而降低[32]。組氨酸作為必需氨基酸之一，參與蛋白質的合成，是動物體血紅蛋白的重要組成部分，其代謝產物具有調節(jié)神經系統(tǒng)、維持機體健康的作用。在組氨酸代謝途徑中，組氨酸在組氨酸轉氨酶的作用下產生尿刊酸，參與紫外線引起的免疫抑制作用[33]。組胺由組氨酸脫羧而產生，組胺作為神經元與腦部神經遞質，參與神經系統(tǒng)的調節(jié)[34]。除此之外，組氨酸還可作為中間產物參與谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸的合成[35]。

天冬氨酸為非必需氨基酸，但外源性天冬氨酸可緩解三羧酸循環(huán)中間產物如草酰乙酸和蘋果酸的缺失，從而提高ATP的合成[36-37]。α-酮戊二酸是三羧酸循環(huán)的中心物質，參與多條代謝途徑，對細胞新陳代謝有著重要作用[38]。本研究結果顯示，天冬氨酸與α-酮戊二酸顯著富集到精氨酸生物合成與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝兩條途徑中，且這兩種代謝物均顯著（P＜0.05）上調。精氨酸與賴氨酸都屬于必需氨基酸，精氨酸為一氧化氮與多種生物活性物質合成的前體，對機體的生長發(fā)育有著重要作用。研究表明，豬飼料中過量賴氨酸與精氨酸不存在拮抗作用[39]。在本研究中，賴氨酸水平為6%時，血淋巴代謝物精氨酸含量上升，賴氨酸與精氨酸未出現(xiàn)拮抗作用。高水平賴氨酸是否與精氨酸存在拮抗作用尚需進一步研究。

嘌呤在動物體內主要以嘌呤核苷酸的形式存在，在作為能量供應、代謝調節(jié)等方面有著重要作用。腺苷是合成腺嘌呤的重要中間體。本研究中嘌呤檢測出差異的有腺嘌呤、黃嘌呤。腺嘌呤、黃嘌呤與腺苷一起富集到嘌呤代謝途徑中，最終生成尿酸。黃嘌呤、尿酸在飼糧6%賴氨酸組飼喂下工蜂血淋巴中含量高于0%賴氨酸組。在昆蟲體內，嘌呤代謝的最終產物是尿酸[40]。尿酸具有抗氧化功能，可減少自由基對蛋白質、DNA 及膜脂質的損害[41]。但是，飼糧賴氨酸水平在6%下工蜂血淋巴代謝物腺苷、腺嘌呤呈下調趨勢，對于這一現(xiàn)象的原因是否與賴氨酸含量過高有關還需進一步研究。

輔酶A是一種含有泛酸的輔酶，是多種酶反應通路的輔助因子，參與物質代謝，可增強機體免疫力[42]。輔酶A的乙酰化形式是乙酰輔酶A，碳水化合物、蛋白質、脂質都會通過乙酰輔酶A進入三羧酸循環(huán)。試驗結果檢測出差異倍數(shù)較大代謝物為L-酵母氨酸、哌啶酸，且含量均為上調，這可能與賴氨酸分解代謝有關。賴氨酸可經過酵母氨酸途徑與哌啶酸途徑轉化為乙酰輔酶A參與TCA循環(huán)。

在本研究中，飼糧中賴氨酸水平的增加提高了熊蜂工蜂胸部肌肉蛋白含量與工蜂存活率，賴氨酸水平為6%時胸部肌肉蛋白含量與存活率最高。采用LC-MS 方法檢測飼喂賴氨酸缺乏組與6%賴氨酸組工蜂血淋巴代謝物，篩選鑒定出28種差異代謝物，主要涉及氨基酸與嘌呤的合成代謝途徑。綜上所述，考慮到飼糧6%賴氨酸組工蜂血淋巴代謝物中組胺、腺嘌呤等代謝物下降，熊蜂工蜂飼糧中賴氨酸水平為4%～6%時，更適合幼年工蜂的生長發(fā)育與生存。

本文研究了不同賴氨酸水平對幼年地熊蜂的生長及其血淋巴代謝物的影響，有助于探明地熊蜂工蜂賴氨酸的營養(yǎng)需求，更好地了解氨基酸在熊蜂飼糧中的重要性，為熊蜂規(guī)?；曫B(yǎng)和授粉應用中的營養(yǎng)補充提供部分理論依據。