謝春嫡，郭肖蓉，2，張煦棟，3，周榮*，李奎

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省動(dòng)物分子設(shè)計(jì)與精準(zhǔn)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東佛山 528225；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010010；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，深圳 518120）

我國(guó)是畜禽消費(fèi)大國(guó)，畜禽養(yǎng)殖也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)。藏豬是我國(guó)優(yōu)秀的高原品種，其耐粗飼、抗高寒環(huán)境、抗逆性強(qiáng)以及皮薄肉好的特質(zhì)是其他豬種所不及的[1-2]，解析藏豬抗逆性強(qiáng)，肉質(zhì)好的原因有助于培育畜禽新品種，從而促進(jìn)我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展。藏豬也能作為良好的研究模型，但是目前對(duì)藏豬或者其他優(yōu)秀高原畜禽種質(zhì)的研究都很少，這就限制了畜禽品種向抗逆方向的改良。

胰島素樣生長(zhǎng)因子家族是一類多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子,主要包括胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）、胰島素樣生長(zhǎng)因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1 受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）、胰島素 樣生長(zhǎng)因子2受體（IGF2R）以及多種胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（insulin-like growth factor binding proteins，IGFBPs），這些因子在細(xì)胞分化、增殖及胚胎、個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要的作用。IGF2R 是一種單鏈跨膜糖蛋白，分胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)，其中胞外區(qū)最大，由15 個(gè)相鄰的單元組成，每個(gè)單元都含有8 個(gè)位置高度相似的半胱氨酸殘基。IGF2R有兩種配體結(jié)合位點(diǎn)：一種是位于結(jié)構(gòu)域3和結(jié)構(gòu)域9 的甘露糖6-磷酸結(jié)合位點(diǎn)（mannose 6-phosphate，M6P）；另一種是位于結(jié)構(gòu)域11 的IGF2 的結(jié)合位點(diǎn)[3]，結(jié)構(gòu)域5 有1 個(gè)位點(diǎn)與結(jié)構(gòu)域3、9 以及陽 離子依 賴性的M6P受體（cation dependent M6P receptor，CD-M6PR）結(jié)合位點(diǎn)有顯著的同源性，但是結(jié)合配體的能力不如M6P 和IGF2 位點(diǎn)[4]。IGF2R 的M6P 位點(diǎn)與溶酶體分選相關(guān)功能有關(guān)，IGF2 位點(diǎn)與生長(zhǎng)功能相關(guān)，雖然這兩個(gè)位點(diǎn)并不在同一位置，但是會(huì)互相競(jìng)爭(zhēng)抑制[5]。最新的研究表明，Caspase 9 非凋亡活性會(huì)影響IGF2R 的逆行轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而影響溶酶體分選過程[6]。IGF2 結(jié)合IGF2R 后激活糖原合成激酶3α∕β（glycogen synthase kinase 3α∕β，GSK3α∕β）從而促進(jìn)甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNA-methyltransferase 3α，Dnmt3A)介導(dǎo)的DNA 甲基化，隨后影響液泡型H+-ATP 酶（vacuolar-type H+-ATPase，V-ATPase）的表達(dá)，最終導(dǎo)致質(zhì)子重新傳導(dǎo)到線粒體膜間隙，并引起持續(xù)的氧化磷酸化[7],說明IGF2R 可能與線粒體某些功能有關(guān)。

亞洲豬和歐洲豬種在基因組上存在許多大的結(jié)構(gòu)變異（structural variations，SVs），并且這些SVs比單核苷酸變異(single nucleotide variations，SNVs)對(duì)基因表達(dá)的影響更大[8]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究亞洲豬的基因組[9]發(fā)現(xiàn)，與國(guó)外豬相比，中國(guó)藏豬的IGF2R基因在其36內(nèi)含子上有1段274 bp的缺失，并通過PCR 和實(shí)時(shí)定量PCR（real time quantitative PCR,RT-qPCR）驗(yàn)證了這段缺失對(duì)IGF2R基因表達(dá)的影響?；贗GF2R基因功能和前期基礎(chǔ)，推測(cè)藏豬IGF2R基因內(nèi)含子上的缺失可能與其低氧耐受的特性有關(guān)，本研究利用基因編輯技術(shù)制備了IGF2R基因第36內(nèi)含子上的大片段缺失，并對(duì)基因編輯細(xì)胞進(jìn)行了初步研究，以期解析該片段的功能，進(jìn)一步研究該基因?qū)Σ刎i抗逆性能的影響，這對(duì)品種改良和育種有重要意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和載體

PK-15 細(xì)胞購自北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司，pX458-GFP[10]是實(shí)驗(yàn)室前期保存的質(zhì)粒載體，感受態(tài)細(xì)胞采購自北京擎科生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，12800082）、FBS（ExCell，F(xiàn)SP500）、Pen-strep（YEASEN，60162ES76）、胰酶（Gibco，25200072）培養(yǎng)；電轉(zhuǎn)化用Cell Line Nucleofector Kit V 轉(zhuǎn)染試劑盒（Lonza，VCA-1003）；質(zhì)粒用北京康為世紀(jì)無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒提?。–WBIO，CW2105S）；用高保真酶進(jìn)行PCR（Vazyme，P515），CCK-8 試劑（Vazyme，A311）檢測(cè)細(xì) 胞活力，ECL 發(fā)光液（Vazyme，E411）、RNA 提取用TRIZOL（Vazyme，R401）、反轉(zhuǎn)錄（Vazyme，R312）及熒光定量PCR（Vazyme，Q711）試劑均購自南京諾唯贊生物科技股份 有限公 司。IGF2R抗體（Abmart，T55516）、Actin（Abmart，M20011）、GAPDH（Abmart，M20050）、Caspase9（Abmart，T55049）、BAX（Abmart，T40051）、二抗（Abmart，M21003）均購自艾比瑪特公司。

1.3 IGF2R基因修飾載體構(gòu)建

在IGF2R基因第36 個(gè)內(nèi)含子處按照18-20N+NGG 規(guī)律選擇sgRNA 打靶序列，設(shè)計(jì)2條引物：sgRNA1和sgRNA2（表1）。將合成的2對(duì)寡聚核苷酸（oligo3nucleotide，oligo）退火后分別連接到線性化質(zhì)粒上得到重組質(zhì)粒[11]，分別命名為pX458-GFP-IGF2R1和pX458-GFP-IGF2R2，同 時(shí)由北京擎科生物科技有限公司從頭合成IGF2R基因274 bp修飾的同源序列。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度在90%左右時(shí)使用胰酶將其消化下來傳代或者凍存。傳代將細(xì)胞按所需比例傳到相應(yīng)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。細(xì)胞凍存時(shí)按基礎(chǔ)培養(yǎng)基∶血清∶DMSO=7∶2∶1 的比例配制好凍存液，細(xì)胞消化離心后用凍存液將細(xì)胞吹散轉(zhuǎn)移到凍存管中，在4 ℃中放置10 min，再轉(zhuǎn)移到-20℃冰箱放置20 min，隨后放到-80 ℃過夜，盡快將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中保存。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)將其消化離心，按照Cell Line Nucleofector Kit V 轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染10 h后更換培養(yǎng)液，48 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞分選。

1.6 重組質(zhì)粒突變效率檢測(cè)

轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行富集，收集產(chǎn)生明顯熒光的細(xì)胞1 萬顆，隨后與空白細(xì)胞一起提取DNA。PCR 后用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，分析經(jīng)重組質(zhì)粒切割后產(chǎn)生的突變條帶的灰度值，確定重組質(zhì)粒的突變效率。所用的引物如表1 所示。

1.7 單克隆細(xì)胞的培養(yǎng)及基因型鑒定

流式分選后的細(xì)胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)每3 d 換1 次，7 d 后在徠卡顯微鏡（DMI6000 B）明場(chǎng)下觀察每個(gè)孔是否長(zhǎng)出細(xì)胞，并及時(shí)傳代。當(dāng)傳到24 孔培養(yǎng)板時(shí)，取少量細(xì)胞（100μL 體積細(xì)胞液）提 取DNA進(jìn)行PCR，反應(yīng)體 系：2 × Phanta Max Master Mix 10μL，上、下游引物（表1）各0.5μL，無菌水8 μL，DNA 1 μL。反應(yīng)程序：95℃3 min；95 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.8 CCK-8實(shí)驗(yàn)

挑選出的單克隆細(xì)胞與野生型細(xì)胞以2 000 孔-1的數(shù)量鋪入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每24 h加入CCK-8 試劑，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)吸光度，分別檢測(cè)24、48、72、96 h細(xì)胞吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.9 RT-qPCR

將細(xì)胞鋪到12 孔板中，48 h 后收取細(xì)胞，用傳統(tǒng)氯仿法提取RNA，再將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為熒光定量的模板，按照諾唯贊熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.10 Western-blot

細(xì)胞用蛋白裂解液提取總蛋白后使用5×Loading buffer變性（100 ℃，10 min），經(jīng)電泳（120 V，15 min；200 V，45 min）后轉(zhuǎn)膜（200 mA，2 h），再將轉(zhuǎn)完膜后的PVDF 膜放入5%的脫脂奶粉中，在室溫?fù)u床上孵育1 h，按照抗體說明書稀釋后將含有目的條帶的膜放入抗體稀釋液中，4 ℃搖床中孵育過夜，等滲緩沖鹽溶液（TBS with Tween-20，TBST）洗3 次后進(jìn)行二抗孵育，室溫?fù)u床孵育40 min，最后使用ECL 發(fā)光顯色液進(jìn)行顯色。

1.11 免疫熒光

24孔盤中的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min,透膜液通透20 min 后經(jīng)5%奶粉封閉1 h，一抗孵育2 h，二抗孵育40 min，2 ug∕mL DAPI 復(fù)染5 min后用熒光顯微鏡拍照用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)。

1.12 數(shù)據(jù)分析

采用Image J 軟件分析凝膠電泳條帶灰度值并計(jì)算敲除效率；RT-qPCR 以及CCK-8 結(jié)果使用GraphPad prism 8.0分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒突變效率檢測(cè)

基因缺失的目的序列在野生型PK-15 細(xì)胞基因組上存在，而在基因修飾后的細(xì)胞基因組上缺失。將構(gòu)建好的pX458-GFP-IGF2R1和pX458-GFP-IGF2R2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，24 h 后在熒光顯微鏡下能看到綠色熒光（圖1A 和B），說明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。PCR擴(kuò)增后凝膠電泳結(jié)果顯示(圖1C)，野生型細(xì)胞只有1條帶（593 bp），而經(jīng)2 個(gè)重組質(zhì)粒切割后的細(xì)胞產(chǎn)生了2 條帶（593、450 bp），說明本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的重組質(zhì)粒能對(duì)目的序列進(jìn)行有效切割。Image J分析電泳條帶灰度值后發(fā)現(xiàn)切割效率為30%。

圖1 質(zhì)粒構(gòu)建及效率檢測(cè)Fig.1 Plasmid construction and efficiency detection

2.2 單克隆細(xì)胞基因型分析

共挑出了418 株細(xì)胞，提取DNA 后進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證。其中共鑒定到雙等位基因修飾細(xì)胞株37 個(gè)，效率為8.85%。流式分選圖如圖2A所示，方框圈出部分為發(fā)綠色熒光并進(jìn)行流式分選的細(xì)胞，這部分細(xì)胞占所有細(xì)胞的5.15%，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率較低。圖2B展示了部分細(xì)胞株P(guān)CR鑒定結(jié)果，產(chǎn)生了不同基因型的細(xì)胞，說明編輯有效。

圖2 單克隆細(xì)胞基因型分析Fig.2 Genotype analysis of monoclonal cells

2.3 IGF2R基因修飾細(xì)胞特征分析

利用RT-qPCR、蛋白免疫印跡技術(shù)和免疫熒光技術(shù)對(duì)挑選出的野生型細(xì)胞以及雙等位基因修飾細(xì)胞進(jìn)行mRNA 和蛋白水平上的分子特征鑒定。結(jié)果顯示，與野生型細(xì)胞（WT）相比，IGF2R雙等位基因修飾細(xì)胞（IGF2R-∕-）mRNA 表達(dá)極顯著下調(diào)（P＜0.01）（圖3B），并且蛋白表達(dá)水平也顯著下調(diào)（P＜0.05）（圖3A和C）。

圖3 IGF2R基因修飾細(xì)胞分子特征鑒定Fig.3 Molecular characterization of the IGF2R gene deletion cell

2.4 IGF2R基因修飾對(duì)細(xì)胞活力的影響

為了探究IGF2R基因的修飾對(duì)細(xì)胞活力的影響，利用CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IGF2R基因修飾細(xì)胞與野生型細(xì)胞的活力差異。結(jié)果（圖4）顯示，IGF2R基因274 bp修飾細(xì)胞的活力在72 h時(shí)極顯著高于WT 組（P＜0.01），說明IGF2R基因修飾細(xì)胞的狀態(tài)良好。

圖4 IGF2R基因的修飾對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.4 Effect of IGF2R gene deletion on cell viability

2.5 IGF2R基因修飾對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

抑制凋亡基因BCL-2mRNA 水平極顯著上升（P＜0.05），但BAX基因mRNA 水平無顯著變化（圖5A），說明IGF2R基因的修飾抑制了細(xì)胞的凋亡。利用Western-blot 檢測(cè)了IGF2R基因修飾對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果（圖5B）發(fā)現(xiàn)，與野生型細(xì)胞相比，IGF2R基因修飾細(xì)胞促凋亡蛋白Caspase9和BAX水平顯著下調(diào)（P＜0.05），抑制凋亡基因蛋白BCL-2水平無顯著變化。

圖5 IGF2R基因的修飾對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of IGF2R gene deletion on apoptosis

3 討論

CRISPR-Cas9 基因編輯工具是一項(xiàng)突破性的技術(shù)，可以精確地引起目標(biāo)基因組上的突變，并且速度快、成本低，這加速了動(dòng)物模型的建立，提高了研究效率[12]。目前已經(jīng)通過建立動(dòng)物疾病模型來研究人類疾病，證明基因治療是可行的[13-14]，這是基因編輯技術(shù)的一大應(yīng)用。我國(guó)是畜禽消費(fèi)大國(guó)，豬在畜禽消費(fèi)中占了舉足輕重的地位，但是近幾年因?yàn)榉侵挢i瘟以及其他豬流行性疾病導(dǎo)致生豬資源大幅度減少，市場(chǎng)上豬肉價(jià)格大幅度上升，這不僅擾亂了市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)，更是對(duì)我國(guó)豬業(yè)的重創(chuàng)，影響豬業(yè)發(fā)展。但是目前的技術(shù)難以解決畜禽疾病帶來的危害或者進(jìn)行品種改良，CRISPR-Cas9技術(shù)是解決這些問題的新手段。目前，詹群美等[15]已通過CRISPR-Cas9 技術(shù)制備了肌肉生成抑制素(myostatin,MSTN)基因編輯巴馬香豬，顯著提高了巴馬香豬的瘦肉率。在研究豬疾病方面，姜元[16]將CRISPR-Cas9 和RNAi 技術(shù)相結(jié)合，制備出了抗豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）的豬；本團(tuán)隊(duì)前期通過CRISPR-Cas9制備出了同時(shí)抗豬繁殖與呼吸綜合征、豬傳染性胃腸炎病毒、豬德爾塔冠狀病毒等3 種重大疫病的基因豬[17]，最近建立了一種高效的基因編輯技術(shù)[18]，該技術(shù)無需進(jìn)行單克隆細(xì)胞分選并且不引入質(zhì)粒DNA，提高了基因編輯動(dòng)物制備效率。

Igf2r基因缺陷會(huì)引起胎兒過度增長(zhǎng)，甚至在圍產(chǎn)期死亡[19-21]。在畜禽育種中，IGF2R作為重要經(jīng)濟(jì)性狀的候選基因被廣泛研究，有報(bào)道指出IGF2R影響鴨脂肪的形成[22]；埃及水牛IGF2R基因單核苷酸突變會(huì)引起犢牛日增重增加，這種變化可能是通過IGF2的表達(dá)增加實(shí)現(xiàn)的[23]。本研究通過CCK-8 和RT-qPCR、Westernblot 發(fā)現(xiàn)，IGF2R基因修飾細(xì)胞株在培養(yǎng)72 h 時(shí)活力顯著升高，凋亡蛋白表達(dá)降低，抑制凋亡基因的mRNA 水平上升，可能是因?yàn)镮GF2R表達(dá)的降低減少了負(fù)性生長(zhǎng)因子（transforming growth factor β1，TGFβ1）的活性，使細(xì)胞繼續(xù)增殖。在多個(gè)研究中都發(fā)現(xiàn)IGF2R基因與腫瘤相關(guān)[24-25]，劉世博等[26]發(fā)現(xiàn)沉默IGF2R基因可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。IGF2基因能促進(jìn)由IGF1R缺乏所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞的凋亡，并且這種凋亡是線粒體依賴性的，抑制IGF2R的表達(dá)可以阻斷由IGF2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡[27]，這些結(jié)果都表明IGF2R基因與細(xì)胞增殖有關(guān)。

IGF2R基因?qū)?xì)胞和個(gè)體的生長(zhǎng)、增殖、凋亡有重要影響，本實(shí)驗(yàn)通過基因編輯技術(shù)對(duì)IGF2R基因進(jìn)行了精準(zhǔn)修飾，這對(duì)后續(xù)研究其功能有重要作用。本研究還成功構(gòu)建了IGF2R基因精確修飾的PK-15細(xì)胞系，并初步進(jìn)行了功能研究，為研究IGF2R基因功能提供細(xì)胞模型，并為后續(xù)基因編輯豬的制備奠定基礎(chǔ)。