張軍軍，梁樂(lè)平

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院耳鼻喉科，陜西 西安 710038)

人類(lèi)第10號(hào)染色體缺失與磷酸酶和張力蛋白同源基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)作為一個(gè)重要的抑癌基因，其編碼的蛋白具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶活性[1]。PTEN具有多種突變形式：PTEN C124S是PTEN磷酸酶區(qū)域124位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變，使得半胱氨酸成為絲氨酸，從而導(dǎo)致編碼的PTEN蛋白缺失脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶活性；PTEN G129E為129位點(diǎn)的點(diǎn)突變，導(dǎo)致甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?，該突變體編碼蛋白的脂質(zhì)磷酸酶活性消失，僅保留蛋白磷酸酶活性；PTEN Y138L是138位點(diǎn)的突變導(dǎo)致絡(luò)氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼?，該突變體編碼蛋白僅具有脂質(zhì)磷酸酶而缺乏蛋白磷酸酶活性；PTEN 1-353是保留PTEN的雙重磷酸酶活性而缺乏C末端的突變體[2-3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PTEN蛋白可分為以下部分：PB區(qū)域(PIP2-binding domain，PBD)、磷酸酶區(qū)域(phosphatase domain，PD)、C2結(jié)構(gòu)域(C2 domain)以及C末端(C-tail)結(jié)構(gòu)。其中，PD區(qū)是PTEN蛋白的磷酸酶活性功能區(qū)，是發(fā)揮抑癌功能的重要部位。C2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)PTEN與質(zhì)膜的結(jié)合。C末端調(diào)節(jié)PTEN與其他蛋白的結(jié)合[4-5]。PTEN 1-353具有PTEN的PD區(qū)域，但因缺乏C末端，其對(duì)PTEN PD區(qū)的抑癌能力是否產(chǎn)生影響，鮮見(jiàn)報(bào)道。眾所周知，PTEN通過(guò)其PD區(qū)抑制鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖能力[6]，為了解PTEN C末端是否也參與鼻咽癌細(xì)胞上述功能的調(diào)節(jié)，本研究在鼻咽癌細(xì)胞5-8F和HONE1中轉(zhuǎn)染PTEN WT(野生型)和PTEN 1-353(突變體)，應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)及CCK-8(cell counting kit-8)法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，探討PTEN C末端對(duì)于鼻咽癌細(xì)胞遷移及增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

鼻咽癌細(xì)胞株HONE1、SUNE1、CNE1、CNE2、5-8F和鼻咽上皮細(xì)胞NP69來(lái)源于南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所。RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清、雙抗均購(gòu)自BI公司；胰酶、D-Hanks等試劑均自行配制。Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；TGF-β1購(gòu)自Proteintech公司；蛋白裂解液RIPA Lysis buffer(Strong)購(gòu)自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。陰性對(duì)照(NC)和PTEN WT、PTEN 1-353質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Addgene公司。CCK-8試劑盒購(gòu)于東仁化學(xué)科技(上海)有限公司。培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔板、24孔板以及96孔板、Transwell小室等來(lái)自美國(guó)Corning公司和Crystalgen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒來(lái)自于PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser、熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM均購(gòu)于TaKaRa公司。PCR引物應(yīng)用Primer 5軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，經(jīng)Oligo 7進(jìn)行比對(duì)評(píng)分后，由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成。Western blot、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司。內(nèi)參GAPDH抗體購(gòu)于Bio-world公司，PTEN抗體購(gòu)于CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將5種人鼻咽癌細(xì)胞系及NP69置于含有5 ng/mL TGF-β1(實(shí)驗(yàn)前按說(shuō)明書(shū)配制)的RPMI 1640培養(yǎng)基(6～8 mL，含10%胎牛血清)中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)箱條件設(shè)置為：37℃，CO2及濕度適宜。選擇細(xì)胞匯合度80%～90%及生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 熒光定量PCR檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞中PTEN mRNA的表達(dá)水平

當(dāng)各鼻咽癌細(xì)胞及永生化鼻咽部上皮細(xì)胞的匯合度達(dá)90%左右時(shí)，提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。具體過(guò)程如下：按SYBR?Premix Ex TaqTM說(shuō)明書(shū)，以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得的cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參。檢測(cè)上述細(xì)胞中PTEN mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，引物序列如下：GAPDH，正向5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG A-3′，反向5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGG-3′；PTEN，正向5'-TGACCAGGGATGAGACCAAC-3′，反向5′-CAGCACATCCTTGGTATGGC-3′。配制如下反應(yīng)液：在10μL SYBR?Premix Ex TaqTM中加入0.4μL正向引物、0.4μL反向引物、1μL總RNA，再加入ddH2O，調(diào)整反應(yīng)液總體積為20μL。在避光條件下配制上述PCR反應(yīng)液，注意須在冰上進(jìn)行，輕輕混勻離心后，使用PCR反應(yīng)儀(Bio-Rad)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。根據(jù)引物的退火溫度及產(chǎn)物長(zhǎng)度設(shè)置反應(yīng)條件如下：95℃、30 s，95℃、5 s，55℃、30 s，72℃、1 min，共40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)各反應(yīng)孔的CT值，重復(fù)3次，無(wú)模板對(duì)照以DEPC水為模板。應(yīng)用2-ΔΔCT法計(jì)算數(shù)據(jù)。

1.4 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

為驗(yàn)證PTEN C末端對(duì)鼻咽癌細(xì)胞遷移及增殖能力的影響，需將NC、具有C末端的PTEN WT及不具有C末端PTEN 1-353質(zhì)粒轉(zhuǎn)染5-8F和HONE1細(xì)胞。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過(guò)程如下：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5-8F和HONE1細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70%左右時(shí)，按Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)分別將質(zhì)粒NC、PTEN WT和PTEN 1-353轉(zhuǎn)染至上述兩種細(xì)胞，待轉(zhuǎn)染48 h后，利用Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，并進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)及CCK-8法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)質(zhì)粒在鼻咽癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的5-8F和HONE1細(xì)胞，用胰酶消化約3 min后，進(jìn)行離心、計(jì)數(shù)、鋪板，待48～72 h后提取細(xì)胞總蛋白。利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，算出各蛋白樣品的濃度。將5×加樣緩沖液及RIPA裂解液加入蛋白抽提物中，配成等體積樣品以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)各蛋白上樣量相同，95℃以上變性5 min。常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育抗體(包括一抗、二抗)后，按照GAPDH和PTEN蛋白相對(duì)分子質(zhì)量裁剪不同的條帶在曝光儀中顯影。利用ImageJ測(cè)定不同條帶灰度值，重復(fù)3次并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTEN C末端對(duì)鼻咽癌細(xì)胞遷移的影響

收集轉(zhuǎn)染質(zhì)粒NC、PTEN WT及PTEN 1-353的5-8F和HONE1細(xì)胞，制備成1×106個(gè)/mL的重懸液接種于Transwell小室，待24 h后，將小室用甲醇固定10 min，按照Giemsa染色試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)染色，清洗小室后封片，并在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 CCK-8法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTEN C末端對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響

收集轉(zhuǎn)染質(zhì)粒NC、PTEN WT及PTEN 1-353的5-8F和HONE1細(xì)胞，配制成單細(xì)胞懸液，用計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，按1.5×104個(gè)/mL的濃度加入96孔板中，每株細(xì)胞設(shè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為陰性對(duì)照組(NC)，轉(zhuǎn)染PTEN WT及PTEN 1-353組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔(分別于第0、1、2、3、4天各測(cè)1次吸光度值)，并設(shè)1個(gè)僅有細(xì)胞培養(yǎng)液的空白對(duì)照組。按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)，每孔加入CCK-8試劑10μL，孵育4 h后終止培養(yǎng)，避光振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀，選擇450 nm波長(zhǎng)，檢測(cè)各孔D(450)值，并以此繪制各組細(xì)胞的增殖曲線。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。PTEN mRNA的表達(dá)水平、Western blot條帶采用ImageJ測(cè)定灰度值、Transwell實(shí)驗(yàn)的計(jì)數(shù)結(jié)果，均采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用One-way ANOVA檢驗(yàn)分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN WT及PTEN 1-353在鼻咽癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)

我們采用熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了鼻咽癌細(xì)胞系HONE1、SUNE1、CNE1、CNE2、5-8F以及鼻咽上皮細(xì)胞NP69中PTEN mRNA的表達(dá)水平，如圖1所示，可見(jiàn)上述5種鼻咽癌細(xì)胞株中PTEN mRNA表達(dá)明顯低于NP69細(xì)胞(P＜0.01)。

圖1 熒光定量PCR法檢測(cè)鼻咽癌各細(xì)胞株中PTEN mRNA的表達(dá)情況

由此可見(jiàn)，PTEN mRNA在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)水平較低。因此，我們將PTEN WT和PTEN 1-353質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染5-8F和HONE1細(xì)胞，擬獲得PTEN高表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞采用Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖2，可見(jiàn)與陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染PTEN WT和PTEN 1-353質(zhì)粒的兩種鼻咽癌細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P＜0.01)。

圖2 Western blot法驗(yàn)證在5-8F和HONE1細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PTEN WT及PTEN 1-353的效率

2.2 PTEN C末端不能調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力

為了明確PTEN C末端是否參與鼻咽癌細(xì)胞的遷移過(guò)程，我們?cè)?-8F和HONE1細(xì)胞中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NC、PTEN 1-353和PTEN WT質(zhì)粒48 h后，在5 ng/mL的TGF-β1刺激下，進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖3所示，PTEN 1-353、PTEN WT組與NC組相比，可以明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力(P＜0.01)，但缺乏C末端的PTEN 1-353和具備C末端的PTEN WT的抑制能力并無(wú)明顯差異(P＞0.05)。因此，我們認(rèn)為PTEN C末端結(jié)構(gòu)可能未參與鼻咽癌細(xì)胞的遷移過(guò)程。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分別在5-8F和HONE1細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒NC、PTEN WT和PTEN 1-353后鼻咽癌細(xì)胞的遷移情況

2.3 PTEN C末端可能參與鼻咽癌細(xì)胞的增殖過(guò)程

為了明確PTEN C末端是否參與鼻咽癌細(xì)胞的增殖過(guò)程，我們?cè)贖ONE1和5-8F細(xì)胞中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NC、PTEN 1-353和PTEN WT質(zhì)粒48 h后，在5 ng/mL的TGF-β1刺激下，進(jìn)行CCK-8法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4所示，相比于NC組，缺乏C末端的PTEN 1-353突變體和具有C末端的PTEN WT均可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖(P＜0.05)。但PTEN 1-353組與PTEN WT組相比較，PTEN 1-353抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的能力比PTEN WT減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。因此，PTEN C末端可能影響了鼻咽癌細(xì)胞的增殖過(guò)程。

圖4 CCK-8法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒NC、PTEN WT和PTEN 1-353后鼻咽癌細(xì)胞的增殖情況

3 討論

鼻咽癌是我國(guó)常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一[7]，而PTEN蛋白依賴(lài)于PD區(qū)域可以調(diào)控PI3K/AKT等信號(hào)通路，影響鼻咽癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等細(xì)胞功能[8-12]。有報(bào)道稱(chēng)，鼻咽癌組織中PTEN蛋白的表達(dá)與腫瘤分期相關(guān)。Ⅰ期、Ⅱ期鼻咽癌患者的PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為55%，而Ⅲ期、Ⅳ期患者的陽(yáng)性率僅為25.5%，這表明鼻咽癌的分期可能與PTEN蛋白的表達(dá)缺失有關(guān)[13]。另有報(bào)道稱(chēng)，PTEN基因突變所編碼的蛋白，也與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展具有非常密切的關(guān)系[14]。相比于PTEN PD區(qū)，關(guān)于PTEN C末端的報(bào)道并不多，主要集中在PTEN C末端可以調(diào)控PTEN蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、活性以及細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)[15-16]。也有研究發(fā)現(xiàn)，PTEN C末端的多位點(diǎn)(Ser380、Thr382、Thr383和Ser385)磷酸化可能調(diào)節(jié)PTEN的功能[17]。而PTEN C末端對(duì)于鼻咽癌細(xì)胞功能的影響鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PTEN蛋白C末端可能不影響鼻咽癌細(xì)胞的遷移過(guò)程。通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，我們將缺失C末端的PTEN 1-353與NC、PTEN WT分別比較，發(fā)現(xiàn)PTEN 1-353可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖，但抑制能力明顯弱于PTEN WT。換言之，PTEN C末端可能具有增強(qiáng)PTEN PD區(qū)域?qū)τ诒茄拾┘?xì)胞增殖的抑制能力。因此，我們推測(cè)，PTEN C末端或許影響了PTEN蛋白的活性，但是具體的機(jī)制如何，仍未可知?；蛟S，PTEN C末端本身可能對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力具有一定的抑制作用；又或許，PTEN C末端可能通過(guò)調(diào)控自身蛋白的穩(wěn)定性而發(fā)揮抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖作用，我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中完善。