張華允，于志強(qiáng)，陽志禹，馬中春

(寧波海關(guān)技術(shù)中心/寧波中盛產(chǎn)品檢測有限公司，浙江 寧波 315012)

甘油肌肉注射誘導(dǎo)的腎損傷作為最常用的急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)模型被廣泛應(yīng)用于各項(xiàng)研究中[1-3]。高滲性的甘油溶液能夠造成注射部位肌肉組織的變性壞死并且可造成局部組織的紅細(xì)胞溶解，使機(jī)體產(chǎn)生肌紅蛋白尿，其特征是急性腎小管壞死和腎皮質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤[4]。

本研究采用肌肉注射甘油制備急性腎損傷模型，并觀察甘油對不同性別大鼠生化、血常規(guī)、尿常規(guī)、血凝及腎、肝、脾等臟器的病理變化。探討在肌肉注射甘油制備急性腎損傷模型中的性別差異及其他臟器的損傷程度，為建立和完善甘油致SD大鼠急性腎臟損傷模型積累相關(guān)研究資料。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級SD大鼠24只，體質(zhì)量(200±20)g，由杭州醫(yī)學(xué)院提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2019-0002，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK(浙)2018-0003。屏障環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室溫度控制在20～24℃，相對濕度控制在40%～70%。

1.2 試劑及配制

甘油、生理鹽水及病理檢查試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行50%甘油生理鹽水的配制[5]。取25 mL甘油與25 mL生理鹽水混合后混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 主要儀器

電子天平購自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，ST 16R高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)，AU480全自動生化分析系統(tǒng)(貝克曼庫爾特商貿(mào)中國有限公司)，XT-1800i全自動血液分析儀(希森美康醫(yī)用電子上海有限公司)，AX-4030尿液分析儀(日本愛科來公司)，CA-1500血液凝固測定儀(威士達(dá)醫(yī)療器械上海有限公司)，CKX53顯微鏡(日本Olympus公司)，實(shí)驗(yàn)動物安樂死儀(上海至遠(yuǎn)生物科技有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

試驗(yàn)前禁水24 h，大鼠兩側(cè)后肢肌肉剃毛消毒后，試驗(yàn)組按10 mL/kg[6]注射50%甘油生理鹽水，對照組注射等量的生理鹽水，24 h內(nèi)自由進(jìn)食與飲水。試驗(yàn)24 h后，放置于代謝籠中，禁食不禁水，并開始收集24 h尿液。試驗(yàn)后48 h后安樂死動物，采血管收集腹主動脈血液并采集肝、腎、脾等器官。進(jìn)行血生化(總蛋白、白蛋白、肌酐、尿素氮、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)，血常規(guī)(白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板)，尿常規(guī)(酮體、潛血、尿蛋白、尿比重、尿酸堿性)，血凝(凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間)指標(biāo)檢測及組織病理制片觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算平均值及方差，各組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 血清生化指標(biāo)

血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果見表1，可見與同性別對照組比較，甘油試驗(yàn)組動物白蛋白(ALB)數(shù)值明顯降低，肌酐(Crea)、尿素氮(Urea)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)數(shù)值明顯升高(P＜0.05)；雌性甘油試驗(yàn)組動物的總蛋白(TP)數(shù)值明顯降低，門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)數(shù)值明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 甘油對大鼠生化指標(biāo)的影響(n=6)

2.2 血常規(guī)及血凝指標(biāo)

血常規(guī)指標(biāo)檢測結(jié)果見表2，與同性別對照組比較，甘油試驗(yàn)組動物紅細(xì)胞(RBC)數(shù)值明顯降低，血小板(PLT)數(shù)值明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。血凝結(jié)果顯示，與對照組比較，甘油試驗(yàn)組各項(xiàng)數(shù)值未見明顯變化，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 甘油對大鼠血常規(guī)和血凝指標(biāo)的影響(n=6)

2.3 尿常規(guī)指標(biāo)

尿常規(guī)檢測結(jié)果見表3，與同性別對照組比較，雌性試驗(yàn)組動物尿比重(SG)數(shù)值明顯著降低，甘油試驗(yàn)組動物在酮體(KET)、潛血(BLD)及尿蛋白(PRO)出現(xiàn)陽性指標(biāo)增加，其他指標(biāo)基本正常。

表3 甘油對大鼠尿常規(guī)指標(biāo)的影響

2.4 組織病理變化

試驗(yàn)組大鼠腎小管擴(kuò)張明顯，可見腎小管中透明管型與血紅蛋白管型。試驗(yàn)組大鼠肝血竇略微擴(kuò)張，存在輕度空泡變性。對照組與試驗(yàn)組大鼠脾臟正常，未觀察到明顯的損傷(圖1)。

圖1 甘油染毒48 h后SD大鼠腎、肝和脾臟組織切片HE染色觀察病理學(xué)變化(×400倍)

3 討論

甘油肌肉注射造?？赡M過度訓(xùn)練導(dǎo)致的橫紋肌溶解和急性腎損傷，其造模效果確定、方法簡單、可重復(fù)性高，因此被廣泛應(yīng)用[7]。在以往的研究中我們發(fā)現(xiàn)，甘油注射的SD大鼠產(chǎn)生血尿，這表明有紅細(xì)胞的溶解。作為紅細(xì)胞較多的組織，肝與脾臟是否也會受到不同程度的損傷還有待進(jìn)一步研究。在進(jìn)行動物性別選擇時(shí)，發(fā)現(xiàn)雖然均采用了甘油肌肉注射模型，但對于不同甘油肌肉注射模型動物性別的選擇也千差萬別，有采用單一性別進(jìn)行試驗(yàn)[5-6]，也有雌雄混合進(jìn)行試驗(yàn)[8]，但是并未說明選擇相應(yīng)性別的理由。由于激素分泌及基因不同造成了不同性別動物對某些模型的表現(xiàn)不同[9-11]，為了降低試驗(yàn)因素的干擾，因此本文對雌性和雄性動物分別進(jìn)行試驗(yàn)，在臟器損傷的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對性別的選擇進(jìn)行研究和探討。

作為常用的急性腎損傷造模方法，大鼠采用50%甘油生理鹽水按照10 mL/kg劑量兩側(cè)后肢注射造模的效果已被證實(shí)，并有較多文獻(xiàn)支持[2，12-13]。因此在本次研究中選用50%的甘油按照10 mL/kg的劑量注射大鼠后肢肌肉的方式建立腎損傷模型。肌肉注射甘油后可見血尿的形成，由于觀察時(shí)間間隔長，未能記錄準(zhǔn)確時(shí)間，會在后續(xù)的研究中準(zhǔn)確記錄。其中血尿的發(fā)生與甘油對橫紋肌溶解的致病機(jī)制有關(guān)[14]，這表明在該模型中也存在其他組織或器官的損傷，儲存有大量血液的器官如肝、脾等可能會受到較大的影響。從本文檢測結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)肝臟產(chǎn)生了輕微的損傷，但是不如腎臟損傷明顯，這可能是因?yàn)楦视蛯ψ⑸渚植考∪猱a(chǎn)生的紅細(xì)胞溶解只是因?yàn)楦视偷母邼B性，這也導(dǎo)致了血小板濃度的增高并且48 h的試驗(yàn)時(shí)間還不足以引起其他臟器的廣泛損傷，其中血生化及尿常規(guī)中肌酐、尿素氮及尿蛋白的顯著提高也表明了腎功能損傷嚴(yán)重。對于甘油肌肉注射模型，從本次試驗(yàn)的生理指標(biāo)及病理變化中可以看出雌性比雄性會產(chǎn)生更明顯的病理變化，這可能是因?yàn)樾坌苑置诘男奂に啬軐δI損傷產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。有證據(jù)表面，睪丸切除術(shù)加重了甘油引起的腎臟損傷，而睪酮降低了腎小管的壞死，減輕了腎損傷[15]，表明雄激素有一定的腎保護(hù)作用，因此特定的病理模型中選擇雌性動物會有更好的表現(xiàn)。

綜合以上結(jié)果，我們得出甘油注射大鼠后肢肌肉模型中，腎損傷明顯，肝也發(fā)生了輕微的損傷。同時(shí)我們推測雄激素對甘油致急性腎損傷有一定保護(hù)作用，但具體的保護(hù)作用及機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。現(xiàn)采用的注射劑量是常用劑量，該模型產(chǎn)生的損傷程度是否隨著使用甘油濃度不同而有所改變；隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)動物的恢復(fù)時(shí)間還需要確定，這些問題會在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探究。