江 丹，伍淑文，陳志元，*，田 輝，孫代華，樊柏林

(1．勁牌持正堂藥業(yè)有限公司，湖北 黃石 435100；2．陽新縣疾病預防控制中心，湖北 黃石 435200；3．湖北省疾病預防控制中心應用毒理湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079)

板栗殼藥性甘、澀、平，主要富含黃酮(或皂苷)類、酚類[1]、多糖(或苷)類和有機酸類等多種化合物[2-4]。從板栗殼中可提取出來天然的棕色素，主要為黃酮類化合物[5-7]，對清除自由基、抑菌和抗氧化均有較強的作用，還可以防止油脂氧化變質(zhì)[8-9]，雖然板栗殼棕色素的功效研究報道不少，但未見板栗殼棕色素的致畸作用和相關的毒理學研究報道，因此本文報道了采用經(jīng)濟發(fā)展與合作組織(Organisation for Economic Co-operation and Develpment，OECD)和食品安全國家標準[10]規(guī)定的方法對板栗殼提取物開展的致畸作用研究結(jié)果，為板栗殼提取物作為天然色素的開發(fā)利用提供安全性評價依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

板栗殼提取物(20倍量，40%乙醇75℃下提取-陶瓷膜過濾-酸沉-離心-堿溶-濃縮干燥制備而成，總黃酮含量≥45%，總多糖含量≥20%)，由勁牌持正堂藥業(yè)有限公司提供，為棕褐色粉末，易溶于水，主要成分為黃酮類化合物，干燥、防潮、避光保存；陰性對照組為蒸餾水；陽性對照組給予含維生素A的食用植物油。

SPF級SD大鼠210只，其中雌性140只，體質(zhì)量240～330 g；雄性70只，體質(zhì)量360～500 g。由湖北省實驗動物研究中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(鄂)2015-0018。大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室中，使用許可證號為SYXK(鄂)2017-0065，環(huán)境溫度20～26℃，濕度40%～70%。飼料為顆粒飼料，飼料許可證號為SCXK(鄂)2016-0011，大鼠經(jīng)檢疫3 d無異常后用于實驗。本實驗經(jīng)湖北省預防醫(yī)學科學院湖北省疾病預防控制中心實驗動物管理與使用委員會審查通過(201921346)。

1.2 儀器與試劑

本研究使用的主要儀器包括：CX41型生物顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)；Motic SMZ168-BL型體視顯微鏡(中國廈門市麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)。主要試劑包括：甲醛、2,4,6-三硝基苯酚、氫氧化鉀、冰乙酸、丙三醇、茜素紅、水合氯醇，均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 劑量設計參考《食品安全國家標準 致畸試驗》中的劑量設置[10]，我們的前期研究結(jié)果顯示，板栗殼提取物對小鼠急性經(jīng)口LD50＞15 g/kg，對雌性大鼠90天經(jīng)口毒性試驗未觀察到有害作用劑量(no observed adverse effect level，NOAEL)為3.33 g/kg。將此劑量設置為高劑量，采用等比組間設置，等比系數(shù)為3倍，設中、低劑量分別為1.11和0.37 g/kg。分別稱取板栗殼提取物3.70、11.10、33.30 g，溶于100 mL蒸餾水，混合均勻，配制低、中、高劑量組受試物；陰性對照組按10 mL/kg的體積灌胃給予蒸餾水；陽性對照組給予13 mg/kg維生素A，準確量取125萬IU的維生素A內(nèi)容物(每1萬IU維生素A相當于3 000μg結(jié)晶視黃醇)，用適量植物油充分混勻并定容至115 mL。

1.3.2 動物分組及體質(zhì)量測定雌雄大鼠按2∶1的比例同籠交配，每天清晨陰道涂片檢查雌性大鼠，以發(fā)現(xiàn)精子確認為妊娠的第0天，并稱量體質(zhì)量，將檢出的孕鼠隨機分為5組，即低、中、高3個劑量組，陰性對照組和陽性對照組，每組孕鼠數(shù)不少于16只。在妊娠的第6～15天，低、中、高劑量板栗殼提取物組和陽性對照組分別灌胃給予受試物，陰性對照組灌胃給予同等體積的蒸餾水，陽性對照組給予13 mg/kg維生素A，連續(xù)10 d。3個劑量組及陰性對照組按10 mL/kg，陽性對照組按4 mL/kg計算灌胃體積，并在妊娠第0、6、9、12、15、20天稱量孕鼠體質(zhì)量[8]。

1.3.3 觀察指標于妊娠第20天對孕鼠進行頸椎脫臼處死，迅速取出子宮，稱量子宮連胎質(zhì)量，計算妊娠大鼠的體質(zhì)量增量，記錄黃體數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)和著床數(shù)，并逐個記錄胎鼠的性別、體質(zhì)量、身長，檢查胎鼠有無外觀異常。將一半胎鼠放于Bouins液中固定2周后，進行內(nèi)臟檢查，另一半胎鼠，放入95%乙醇固定，流水沖洗后放入15 g/L的氫氧化鉀溶液內(nèi)，透明后放入茜素紅應用液染色，再放入透明液A及透明液B中，待骨骼染紅而軟組織退色后檢查骨骼發(fā)育情況。胎鼠內(nèi)臟檢查：腦室發(fā)育異常、眼缺失及大小不一、腭裂、腎積水或單腎缺失、吐舌等；胎鼠骨骼檢查：頭頂間骨及后頭骨、胸骨缺失和鈣化不全、肋骨異常、脊柱骨異常等的檢查。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，孕鼠體質(zhì)量、體質(zhì)量增量、子宮連胎質(zhì)量、著床數(shù)、黃體數(shù)、胎仔體質(zhì)量、身長、吸收胎數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、胎仔各畸形數(shù)等多組間計量資料用單因素方差分析的最小顯著性差異法檢驗，兩組之間計數(shù)資料采用χ2檢驗[9]。胎仔的數(shù)據(jù)以窩為單位進行統(tǒng)計，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果應能得出受試物是否有母體毒性和胚胎毒性、致畸性，最好能得出最小致畸劑量。按下式計算致畸指數(shù)和致畸危害指數(shù)，致畸指數(shù)10以下為不致畸，10～100為致畸，100以上為強致畸。致畸危害指數(shù)大于300說明該受試物對人危害小，100～300危害中等，小于100對人危害大。

致畸指數(shù)=雌鼠LD50/最小致畸劑量

致畸危害指數(shù)=最大不致畸劑量/最大可能攝入量

2 結(jié)果

2.1 板栗殼提取物對孕鼠一般狀況及其體質(zhì)量的影響

實驗期間各組大鼠飲水進食正常，行動靈活，反應敏捷，眼鼻口無分泌物，生長發(fā)育良好，均未見流產(chǎn)及其他明顯中毒癥狀，無死亡。試驗期間板栗殼提取物各劑量組孕鼠體質(zhì)量與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；與陰性對照組比較，陽性對照組孕鼠第9～20天體質(zhì)量、體質(zhì)量增量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，結(jié)果如圖1。

圖1 板栗殼提取物對孕鼠體質(zhì)量的影響

2.2 板栗殼提取物對孕鼠胚胎形成的影響

各組孕鼠胚胎形成情況見表1。與陰性對照組比較，0.37、1.11、3.33 g/kg板栗殼提取物組大鼠黃體數(shù)、著床數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、死胎百分率、吸收胎數(shù)，吸收胎百分率差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與陰性對照組比較，陽性對照組大鼠黃體數(shù)、著床數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、死胎百分率、吸收胎數(shù)，吸收胎百分率差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 各組孕鼠胚胎形成情況

2.3 板栗殼提取物對胎鼠外觀和發(fā)育的影響

各組胎鼠外觀和發(fā)育指標見表2。與陰性對照組比較，0.37、1.11、3.33 g/kg板栗殼提取物組胎鼠體質(zhì)量、母鼠子宮連胎質(zhì)量、身長、外觀畸形數(shù)、外觀畸形窩數(shù)率的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；陽性對照組與陰性對照組比較，陽性組母鼠子宮連胎質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，陽性組的胎仔體質(zhì)量、身長降低、外觀畸形率、外觀畸形窩率升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。

表2 胎鼠外觀和發(fā)育指標

2.4 板栗殼提取物對胎鼠內(nèi)臟的影響

各組胎鼠內(nèi)臟指標見表3。與陰性對照組比較，0.37、1.11、3.33 g/kg板栗殼提取物組胎鼠組內(nèi)臟異常例數(shù)和異常窩數(shù)率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，胎鼠內(nèi)臟畸形主要表現(xiàn)為腎積水。陽性對照組胎鼠內(nèi)臟畸形主要腦室異常、眼瞼缺失、腎積水。陽性對照組與陰性對照組比較，胎仔只數(shù)和胎仔窩數(shù)內(nèi)臟畸形率升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P＜0.01)。

表3 板栗殼提取物對胎鼠內(nèi)臟的影響

2.5 板栗殼提取物對胎鼠骨胳發(fā)育的影響

胎鼠骨骼畸形主要表現(xiàn)為頭頂間骨及后頭骨缺失、第五和第六胸骨缺失及肋骨異常等。各組胎鼠骨骼發(fā)育指標見表4，與陰性對照組比較，0.37、1.11、3.33 g/kg板栗殼提取物組的骨骼畸形率、骨骼畸形窩率差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，陽性對照組與陰性對照組比較，陽性組的骨骼畸形率、骨骼畸形窩數(shù)率升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P＜0.01)。

表4 板栗殼提取物對胎鼠骨骼發(fā)育的影響

3 討論

在致畸試驗中，經(jīng)常存在母體毒性和胎兒毒性兩項觀察指標。母體毒性是指外源性理化因素對孕母體產(chǎn)生的損害作用，包括體質(zhì)量減輕、中毒癥狀和體征甚至死亡；胚胎毒性通常指外源性理化因素造成孕體著床前后直到器官形成期結(jié)束所有的毒性[11]。

本實驗采用SD大鼠，設置0.37、1.11、3.33 g/kg共3個劑量組，同時設立陰性對照和維生素A陽性對照組，于妊娠的第6～15天連續(xù)給予受試物或?qū)φ掌?。結(jié)果表明陽性對照物維生素A可導致孕鼠體質(zhì)量、體質(zhì)量增量降低，胎鼠體質(zhì)量降低、身長偏短，胎鼠外觀、內(nèi)臟和骨骼發(fā)育異常，畸形胎仔窩數(shù)增加，具有對大鼠明顯的致畸作用，與文獻報道是一致的，也表明本實驗體系的可靠性。板栗殼提取物高劑量為可灌胃給予的樣品配制最高濃度和最高灌胃體積，在該劑量條件下，板栗殼提取物對孕鼠一般狀況及體質(zhì)量、子宮連胎質(zhì)量等無明顯影響(P＞0.05)，對母鼠生殖能力包括黃體數(shù)、著床數(shù)、活胎總數(shù)、吸收胎數(shù)、吸收胎率、死胎數(shù)、死胎率等指標均無明顯影響(P＞0.05)，對胎鼠外觀和發(fā)育，以及內(nèi)臟和骨骼發(fā)育均無影響，未觀察到畸形發(fā)生。因此，可以認為在本試驗條件下，板栗殼提取物對大鼠母體、母鼠的生殖及胎鼠發(fā)育均未觀察到有害作用，NOAEL大于3.33 g/kg，未觀察到致畸性，本研究為板栗殼提取物作為食品用色素提供了生殖毒性方面的安全依據(jù)。