李 燕，董經(jīng)茹，魏媛媛，張金艷

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

宮頸癌(cervical cancer，CC)在全球女性惡性腫瘤中發(fā)病率及死亡率均居第4位，是我國女性常見的癌癥之一[1]，但目前缺乏高度特異性和敏感性的生物標志物用于CC的診斷和預(yù)后監(jiān)測。近年來，大量研究利用微陣列生物信息學(xué)技術(shù)分析CC發(fā)生發(fā)展中的差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)及其分子機制[2]，為CC的早期診斷、療效觀察、預(yù)后監(jiān)測及基因治療提供了重要依據(jù)。通過人類宮頸癌組織的全基因組表達譜芯片比較CC組織與正常宮頸組織中的DEGs，運用多種生物信息學(xué)分析工具分析，極光激酶A(aurora kinase A，AURKA)在CC組織中高表達，隨著腫瘤分期的進展AURKA的表達水平升高。AURKA是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，對調(diào)節(jié)細胞有絲分裂進程，維持基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要[3]。有研究發(fā)現(xiàn)AURKA在多種腫瘤中普遍存在基因擴增和過表達，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后存在密切聯(lián)系[4]。宮頸鱗狀細胞癌(cervical squamous cell carcinoma，CSCC)是最常見的宮頸癌組織學(xué)類型，且?guī)缀蹙l(fā)生在已婚多產(chǎn)的婦女。本研究以CSCC、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和女性健康體檢者為研究對象，分別采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法定量檢測CSCC血清中AURKA mRNA及蛋白的表達，并分析其對CSCC的診斷價值及臨床意義，探尋以血清AURKA mRNA及蛋白作為無創(chuàng)分子標志物來預(yù)測宮頸癌的發(fā)生發(fā)展的可能性。

1 材料與方法

1.1 病例

2021年6—10月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院就診的96例患者，年齡25～79歲。其中宮頸鱗狀細胞癌患者48例，宮頸上皮內(nèi)瘤變患者28例，健康體檢者20例。所有患者治療前清晨空腹采集靜脈血5 mL于無抗凝劑的真空采血管。本研究已獲得河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會批準(2021KS038)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

納入標準：①患者均為首次就診，經(jīng)陰道鏡或手術(shù)活組織病理檢查確診，入院前未接受過手術(shù)及放射治療、化學(xué)治療等相關(guān)抗腫瘤治療措施；②無其他器官疾病或功能障礙；③患者各項臨床資料完整。健康體檢者性別為女性，超聲及血清腫瘤標志物等均未見異常。

排除標準：①合并有其他惡性腫瘤；②入院前接受過手術(shù)或放療、化療等其他抗腫瘤治療；③合并有其他器官功能障礙或自身免疫性疾病。

1.2 實驗試劑及儀器

1.2.1 試劑BIOG游離RNA提取試劑，購于常州百代生物科技股份有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit和TB Green?Premix Ex TaqTMII購于日本TaKaRa公司；人AURKA ELISA試劑盒購于河南百奧維克生物科技有限公司；DEPC水購于北京蘭杰柯科技有限公司。

1.2.2 儀器QunantStudioDx型PCR儀購于美國Applied Biosystems公司；NanoDrop型微量核酸蛋白濃度測定儀購于美國Thermo公司；PHOMO型酶標儀購于鄭州安圖生物工程有限公司。

1.2.3 引物設(shè)計AURKA為目的基因，GAPDH作為內(nèi)參基因，由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列為：AURKA基因，上游5′-GGAATATGCAC CACTTGGAACA-3′，下 游5′-TAAGACAGGGCATTT GCCAAT-3′；GAPDH基因，上游5′-AGAAGGCTGG GGCTCATTTG-3′，下游5′-AGGGGCCATCCACAGTC TTC-3′。

1.3 實驗方法

1.3.1 篩選差異表達基因GEO2R是基因表達綜合(Gene Expression Omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫自帶的基于R語言的在線分析工具，允許用戶對GEO數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換和復(fù)雜分析，以幫助識別和可視化差異基因表達[5]。通 過GEO2R對GSE63514、GSE52903、GSE39001、GSE27678和GSE9750共5個微陣列數(shù)據(jù)集中癌組織和癌旁正常組織樣本進行分組，以調(diào)整后的P＜0.05和|log2(FC)|＞1為標準，篩選兩組樣本的DEGs。FC(fold change)為基因表達的差異倍數(shù)變化，log2(FC)＞1的基因定義為上調(diào)基因，log2(FC)＜-1的基因定義為下調(diào)基因。通過在線分析網(wǎng)站繪制Venn圖，獲得5個GEO數(shù)據(jù)芯片上調(diào)基因的交集與下調(diào)基因的交集。

1.3.2 功能富集分析在DAVID數(shù)據(jù)庫中選擇“Functional Annotation”分析工具，批量輸入通過Venn圖獲得的DEGs，“Select species”輸入“Homo sapiens”，提交數(shù)據(jù)后進行基因本體(gene ontology，GO)功能注釋分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。以P＜0.05為標準篩選重要的功能注釋及通路富集結(jié)果。

1.3.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析利用STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建DEGs介導(dǎo)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，以揭示它們之間的復(fù)雜相互作用。設(shè)置最低關(guān)聯(lián)度為0.7，并隱藏網(wǎng)絡(luò)中孤立的和部分連接的節(jié)點。將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape[3]軟件進行可視化，應(yīng)用Cytohubba[6]插件進行關(guān)聯(lián)度分析，取關(guān)聯(lián)度排名前10的差異表達基因節(jié)點作為關(guān)鍵基因。

1.3.4 生存預(yù)后分析Kaplan-Meier plotter是常用的檢測基因與腫瘤患者預(yù)后相關(guān)性的在線分析網(wǎng)站[7]，對10個關(guān)鍵基因進行生存分析，篩選出與宮頸癌預(yù)后相關(guān)的分子標志物。選擇“RNA-seq Start KM plotter for pan-cancer”，將篩選出的樞紐基因輸入，限定條件為總體生存期(OS)，生存時間統(tǒng)計最長為120個月。腫瘤樣本為304例宮頸癌患者，腫瘤病理類型、分期及其病人性別等其他條件不做限制，進行Kaplan-Meier生存分析。以P＜0.05作為條件篩選出與宮頸癌預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因。

1.3.5 關(guān)鍵基因mRNA水平的表達基因表達譜交互式分析(gene expression profiling interactive analysis，GEPIA)可對基于癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)和基因型-組織表達(the genotype-tissue expression，GTEx)數(shù)據(jù)庫的腫瘤和正常組織進行基因表達分析[8]。在GEPIA2表達分析模塊選擇Box Plot，數(shù)據(jù)來源選擇CC，得到關(guān)鍵基因在宮頸癌及正常宮頸組織中的表達情況，選擇Stage Plot分析關(guān)鍵基因與腫瘤病理分期的關(guān)系。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3.6 關(guān)鍵基因蛋白水平的表達人類蛋白質(zhì)圖譜(the human protein atlas，HPA)可對編碼的蛋白質(zhì)進行免疫組織化學(xué)染色研究。利用HPA數(shù)據(jù)庫進一步驗證與宮頸癌患者生存相關(guān)的4個關(guān)鍵基因在組織中蛋白水平的表達情況。組織圖譜模塊獲得關(guān)鍵基因在正常宮頸組織的免疫組織化學(xué)染色，病理圖譜模塊獲得其在宮頸癌組織的免疫組織化學(xué)染色，比較這些關(guān)鍵基因的抗體在宮頸癌組織和正常組織中免疫組織化學(xué)染色的差異。

1.3.7 血清游離AURKA mRNA及蛋白檢測血液離體后立即分離血清，提取血清循環(huán)游離RNA，使用微量核酸蛋白濃度測定儀檢測血清RNA的濃度和純度，以DEPC水作為空白對照，吸取2μL提取的RNA溶液進行檢測。血清RNA濃度為40～160 ng/μL，260 nm和280 nm波長下的吸光度之比在1.8～2.1之間，提示RNA濃度和純度符合后續(xù)實驗要求，利用qPCR檢測血清AURKA mRNA的表達，反應(yīng)結(jié)束后確認qPCR的擴增曲線和熔解曲線，利用2-ΔΔCT計算樣本目的基因的相對表達量，即ΔCT＝CT，目的基因-CT，對照基因，ΔΔCT＝ΔCT，實驗組-ΔCT，對照組。ΔΔCT值越高，表示基因表達水平越低。采用ELISA檢測血清AURKA蛋白水平的表達，以標準品濃度為橫坐標，對應(yīng)吸光度值為縱坐標，繪制標準品線性回歸曲線，根據(jù)曲線方程計算各樣本中AURKA的濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以α=0.05為檢驗水準。計量資料進行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗和Levene方差齊性檢驗，正態(tài)分布資料以±s表示，偏態(tài)分布以M(Q)表示。正態(tài)分布且方差齊時多組比較采用方差分析，否則采用Kruskal-WallisH檢驗。采用Spearman秩檢驗分析血清AURKA mRNA及蛋白的相關(guān)性。利用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)及曲線下面積(area under curve，AUC)評估血清AURKA對CC的診斷價值。采用χ2檢驗分析血清AURKA mRNA表達與CC患者臨床病理特征間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 CC相關(guān)差異表達基因

通過GEO2R在線分析5個微陣列數(shù)據(jù)集中187例宮頸癌組織和80例正常宮頸組織基因測序結(jié)果?；鹕綀D顯示了每個數(shù)據(jù)集中DEGs分布(見圖1)。Venn圖對數(shù)據(jù)取交集得到60個共同的差異表達基因(見表1)，包括41個上調(diào)和19個下調(diào)基因(見圖2)。

圖1 5個數(shù)據(jù)集差異基因的火山圖

表1 60個共表達的差異表達基因

圖2 Venn圖顯示5個數(shù)據(jù)集共有差異表達基因的交集

2.2 GO和KEGG富集分析

GO富集分析結(jié)果顯示，差異表達基因主要參與的生物過程(biological process，BP)為細胞分裂、DNA復(fù)制、有絲分裂的G1/S期轉(zhuǎn)換、有絲核分裂、細胞增殖轉(zhuǎn)錄的負調(diào)控、p53類介體對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控、有絲分裂的G2/M期轉(zhuǎn)換、DNA修復(fù)、細胞周期等；主要參與的細胞成分(cell component，CC)為核質(zhì)、細胞質(zhì)、膜、主軸、微管、中心體、蛋白質(zhì)復(fù)合物、著絲粒、染色體、MCM復(fù)合體等；主要參與的分子功能(molecular function，MF)為蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、DNA結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、蛋白激酶結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、微管結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、DNA解旋酶活性等(見圖3A)。KEGG通路富集結(jié)果顯示，差異表達基因主要富集在DNA復(fù)制、細胞周期、p53信號通路、錯配修復(fù)、嘧啶代謝、卵母細胞減數(shù)分裂、鉑耐藥、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、病毒致癌等信號通路(見圖3B)。

圖3 差異表達基因功能富集可視化結(jié)果

2.3 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

通過STRING在線分析構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)中總共包含60個節(jié)點和660個邊(見圖4A)。通過Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化處理，利用Cytohubba插件計算出關(guān)聯(lián)度前10的節(jié)點基因作為宮頸癌的重要關(guān)鍵基因，分別為CDK1、NCAPG、TOP2A、AURKA、UBE2C、RRM2、TTK、CDC20、MCM2、RFC4(見圖4B)。

圖4 差異表達基因的PPI網(wǎng)絡(luò)和樞紐基因

2.4 AURKA基因表達與CC患者的生存分析

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，10個關(guān)鍵基因中篩選出4個基因與TCGA數(shù)據(jù)庫中宮頸癌患者生存相關(guān)，且4個關(guān)鍵基因均為表達上調(diào)基因，分別為AURKA、CDK1、MCM2、RFC4。其中AURKA基因的表達水平與宮頸癌患者10年總體生存率呈負相關(guān)，即AURKA基因高表達的宮頸癌患者生存時間更短(見圖5)。

圖5 宮頸癌患者的生存曲線

2.5 AURKA基因表達驗證

2.5.1 AURKA基因轉(zhuǎn)錄水平的差異GEPIA2表達分析模塊分析結(jié)果顯示與正常組織相比，AURKA mRNA在宮頸癌組織中高表達(P＜0.05)，且與GEO數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果一致(見圖6)。進一步分析關(guān)鍵基因與宮頸癌分期的關(guān)系，結(jié)果顯示AURKA mRNA在宮頸癌不同階段的表達水平存在顯著差異(P＜0.05)，隨著腫瘤分期的進展AURKA mRNA的表達升高(見圖7)。

圖6 GEPIA2在線工具分析結(jié)果

圖7 AURKA mRNA在宮頸癌不同分期的表達

2.5.2 AURKA蛋白水平差異HPA數(shù)據(jù)庫的免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示，與正常宮頸組織相比，宮頸癌組織中AURKA的抗體特異性著色程度均加深，即在宮頸癌組織中表達較高。

2.6 CSCC患者血清AURKA mRNA及蛋白的表達

AURKA mRNA擴增曲線為平滑的S型曲線，閾值循環(huán)數(shù)(CT)值在20～30之間，提示擴增結(jié)果可靠。熔解曲線為單一峰，沒有引物二聚體的產(chǎn)生，表示特異性較好(見圖8)。CSCC和CIN患者血清AURKA mRNA的相對表達水平明顯高于健康體檢者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。CSCC與CIN患者血清AURKA mRNA的相對表達水平無顯著差異。CSCC患者血清AURKA蛋白的表達水平明顯高于CIN及健康體檢者(P＜0.05)，與血清AURKA mRNA相對表達不同的是，CIN患者與健康體檢者血清AURKA蛋白表達水平無顯著差異(見圖9)。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，血清AURKA mRNA與蛋白表達水平呈正相關(guān)關(guān)系，但關(guān)聯(lián)性較弱(r＝0.237，P＝0.020)。

圖8 AURKA mRNA擴增曲線及熔解曲線

圖9 宮頸鱗狀細胞癌患者血清AURKA mRNA及蛋白的表達

2.7 血清AURKA的表達對CSCC的臨床診斷價值

根據(jù)ROC曲線，血清AURKA mRNA和蛋白預(yù)測CSCC最佳截斷值分別為2.028和3.239，此時曲線下面積(AUC)分別為0.869(敏感度75%，特異度90%)和0.699(敏感度85.4%，特異度60%)(見圖10)。根據(jù)ROC曲線的截斷值，將AURKA mRNA表達水平分為高表達組和低表達組。經(jīng)χ2檢驗發(fā)現(xiàn)，血清中高表達與低表達AURKA mRNA的CSCC患者年齡、分化程度均無明顯差異(P＞0.05)，而患者FIGO分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及肌層浸潤深度差異明顯(P＜0.05)。血清中高表達AURKA mRNA的CSCC患者往往臨床分期較晚、瘤組織較大、肌層浸潤更深、更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(見表2)。

表2 血清AURKA mRNA表達與宮頸鱗狀細胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系

圖10 AURKA mRNA及蛋白預(yù)測宮頸鱗狀細胞癌患者的ROC曲線

3 討論

本研究比較了5個微陣列數(shù)據(jù)集中宮頸癌組織與正常宮頸組織的mRNA表達譜，篩選出共同的DEGs，并通過多種生物信息學(xué)工具綜合分析它們的潛在功能。GO功能注釋結(jié)果顯示，DGEs在細胞有絲分裂、核質(zhì)、染色體和DNA解旋酶活性中顯著富集，表明其中一些DEGs可能定位于細胞核中，通過增強宮頸癌中的DNA解旋酶活性參與細胞分裂周期過程以促進細胞增殖。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，DEGs在DNA復(fù)制、細胞周期、p53信號通路、卵母細胞減數(shù)分裂和病毒致癌等信號通路中顯著富集。Mine等[9]研究發(fā)現(xiàn)，基因染色體畸變直接或間接驅(qū)動細胞周期失調(diào)和抗病毒基因活性，導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展。構(gòu)建共同DEGs的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，確定了關(guān)聯(lián)度較高的10個重要關(guān)鍵基因。通過Kaplan-Meier分析樞紐基因的表達與TCGA數(shù)據(jù)庫中宮頸癌患者生存預(yù)后之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)與CC預(yù)后相關(guān)的4個關(guān)鍵基因，即AURKA、CDK1、MCM2和RFC4。

為進一步探究4個關(guān)鍵基因與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系及相關(guān)的分子機制，將其導(dǎo)入STRING在線分析網(wǎng)站，結(jié)果顯示關(guān)鍵基因主要富集在細胞有絲分裂過程中，包括DNA復(fù)制、細胞分裂周期相變。Espinosa等[10]研究發(fā)現(xiàn)，有絲分裂是宮頸癌篩查、生存和治療靶標的潛在標志物來源，而抑制有絲分裂是重要的抗癌策略。由此推斷，4個關(guān)鍵基因作為促癌基因可能通過加速細胞周期轉(zhuǎn)換，促進腫瘤細胞增殖分化，從而導(dǎo)致人類宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。PPI網(wǎng)絡(luò)和生存分析結(jié)果顯示AURKA基因是和CC分期及預(yù)后相關(guān)的潛在生物標志物。

本研究基于生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，與正常宮頸組織相比，CC組織中AURKA mRNA及蛋白表達較高。通過qPCR及ELISA技術(shù)檢測CSCC患者血清AURKA mRNA及蛋白的表達，結(jié)果顯示CSCC和CIN患者血清AURKA mRNA的表達明顯高于健康體檢者，CSCC血清AURKA蛋白的表達明顯高于CIN及健康體檢者。CSCC血清AURKA mRNA高表達組患者FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及肌層浸潤深度均分別高于AURKA mRNA低表達組(P＜0.05)，這提示血清中高表達AURKA mRNA可能具有預(yù)測CSCC患者臨床進展和預(yù)后的作用。本研究結(jié)果及文獻報道相似，Twu等[11]通過免疫組織化學(xué)染色檢測正常宮頸、CIN和浸潤性宮頸癌(鱗癌和腺癌)組織中AURKA的表達，結(jié)果顯示其在浸潤性宮頸癌和CIN組織中的表達顯著高于正常宮頸組織。與腺癌相比，鱗癌中AURKA的表達更高。Zhang等[7]采用qPCR檢測宮頸癌細胞系及74例宮頸癌患者配對癌組織和相應(yīng)非癌組織中AURKA mRNA的表達，通過蛋白質(zhì)印跡和免疫組織化學(xué)測定細胞懸液和組織中AURKA蛋白的表達，結(jié)果顯示AURKA mRNA和蛋白在宮頸癌細胞系和組織中的表達顯著高于正常宮頸上皮細胞和非癌組織，AURKA mRNA表達與FIGO分期、腫瘤分化、宮旁浸潤、淋巴結(jié)或血行轉(zhuǎn)移相關(guān)，高表達患者的OS和無病生存率更差，提示其可能在原發(fā)腫瘤的進展和侵襲中發(fā)揮重要促癌作用，并有潛力成為宮頸癌早期診斷和預(yù)后監(jiān)測的指標。有學(xué)者提出AURKA表達可能預(yù)測宮頸癌患者的結(jié)局，但其在宮頸癌發(fā)病機制中的確切功能和分子機制尚不明確[12]。AURKA是細胞周期調(diào)節(jié)激酶，對維持基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要[3]。先前的一項研究發(fā)現(xiàn)，抑制AURKA可作為HPV E7癌基因的合成致死靶點，用小分子抑制劑Alisertib抑制AURKA可選擇性地靶向體內(nèi)表達HPV E7的細胞，AURKA的過度表達對HPV轉(zhuǎn)化的宮頸癌細胞的存活至關(guān)重要[13]。研究發(fā)現(xiàn)AURKA過表達可增強G1/S細胞周期過渡，促進細胞增殖，并保護細胞免受凋亡，產(chǎn)生抗腫瘤藥的化學(xué)耐受性[14]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CC患者血清中AURKA mRNA及蛋白的表達水平升高且與CSCC患者臨床進展有關(guān)，二者聯(lián)合檢測對于CSCC診斷及監(jiān)測預(yù)后具有一定意義。