李超 李俊 盛曉生 余晗俏

原發(fā)性高血壓（essential hypertension,EH）是心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，具有發(fā)病率高、致殘率高、致死率高等特點(diǎn)，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]。近年來，越來越多的證據(jù)支持遺傳和環(huán)境因素相互作用參與EH的發(fā)生、發(fā)展[2]。此外，單個(gè)基因的堿基缺失/插入、置換/易位等不同的遺傳變異也與EH的易感性有關(guān)[3-4]。NF-κB是廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)炎癥基因如TNF-α、IL-6啟動(dòng)子區(qū)表達(dá)的調(diào)控[5]，參與動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、高血壓、腫瘤等多種疾病的病理過程。有研究表明，TNF-α通過NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，引起血管收縮，導(dǎo)致血壓升高[6]。NFKB1基因位于人類染色體 4q24，編碼NF-κB亞單位p105與p50，影響NF-κB表達(dá)[7]。NFKB1啟動(dòng)子單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）位點(diǎn)由插入/缺失（-94ins/del-ATTG）組成（rs28362491），可以誘導(dǎo)NFKB1基因的調(diào)節(jié)作用，與各種炎癥性疾病、自身免疫性疾病和癌癥有關(guān)[8]，但NFKB1-rs28362491基因多態(tài)性與EH的相關(guān)性及具體分子機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究探討NFKB1-rs28362491基因多態(tài)性與EH及TNF-α水平的相關(guān)性，為預(yù)測(cè)EH發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提供一定的科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2017年6月至2020年6月就診于金華市人民醫(yī)院EH患者275例（EH組）和血壓正常的健康體檢者138名（NT組）。EH組男154例，女121例，年齡 55～88（64.37±9.82）歲；NT組男81例，女57例，年齡41～73（62.73±5.83）歲，兩組對(duì)象性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)：在未使用抗高血壓藥物的情況下，非同日3次測(cè)量，收縮壓≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒張壓≥90 mmHg；患者既往有高血壓史，目前正在服用抗高血壓藥物，血壓雖＜140/90 mmHg，也診斷為高血壓[9]。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有睡眠呼吸暫停低通氣綜合征、腎實(shí)質(zhì)性高血壓、腎血管性高血壓、原發(fā)性醛固酮增多癥、嗜鉻細(xì)胞瘤或皮質(zhì)醇增多癥，長(zhǎng)期服用激素類、中樞神經(jīng)類、非類固醇類抗炎藥物者。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過（批準(zhǔn)文號(hào)：IBR-2017005-R），受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集所有受試者空腹肘靜脈全血5 ml，置于紫色抗凝管，再按順序編號(hào)放入EP管。按照血液基因組DNA提取試劑盒配套說明書（上海生工生物工程有限公司，批號(hào)：B518253-0050，規(guī)格：50 PREPS）進(jìn)行DNA提取。使用美國(guó)Thermo公司Nano Drop 2000C型紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度，DNA濃度50 ng/L，放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 NFKB1基因上游啟動(dòng)子區(qū)域-94位點(diǎn)基因型檢測(cè) 設(shè)計(jì)PCR引物，上游引物：5'-TGGGCACAAGTCGTTTATGAT-3'；下 游 引 物 ：5'-CTGGAGCCGGTAGGGAAG-3'，由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)條件：模板 DNA 1.5 μl，PCR mix 12.5 μl，上下游引物 0.4 μl，滅菌超純水10.2 μl，將PCR反應(yīng)體系的總體積加至25 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，共 45個(gè)循環(huán)，最后70℃總延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化已錠染色，凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光成像并拍照。

1.2.3 血清指標(biāo)檢測(cè) 抽取受試者清晨空腹肘靜脈血5 ml，EDTA抗凝管收集，使用ALLEGRAX-15R醫(yī)用低速離心機(jī)，1 000 r/min，離心15 min，將血清置于-80℃冰箱保存。采用全自動(dòng)生化分析儀（日本日立，型號(hào)：7180）檢測(cè)血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平,試劑盒購(gòu)自美康生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為180409101、180319201、180601114、180613115。采用全自動(dòng)酶免分析儀（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，型號(hào)：BIOBASE2000）、ELISA法檢測(cè)血清TNF-α水平，試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：ZN2460。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用二元logistic回歸分析EH的危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組對(duì)象一般資料比較 兩組對(duì)象BMI、吸煙史、飲酒史、LDL-C、TC比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），余指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 兩組對(duì)象一般資料比較

2.2 NFKB1基因rs28362491位點(diǎn)電泳及測(cè)序結(jié)果NFKB1基因rs28362491位點(diǎn)其PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為326 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因型：野生純合（ins/ins,Ⅱ）基因型者，只含240 bp 1個(gè)條帶；雜合突變（ind/del,ID）基因型者，含有281 bp及240 bp 2個(gè)條帶；純合突變（del/del,DD）基因型者，只含281 bp 1個(gè)條帶。見圖1。

圖1 NFKB1基因rs28362491位點(diǎn)酶切產(chǎn)物電泳圖

2.3 兩組對(duì)象基因多態(tài)性分布比較 NFKB1基因rs2836249位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率在EH組和NT組的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=1.472、1.185，均P＞0.05）。EH組NFKB1基因rs28362491位點(diǎn)DD基因型頻率高于NT組，Ⅱ、ID基因型頻率低于NT組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。兩組D、I等位基因頻率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。兩組隱性模型（DD比ID+Ⅱ）分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但兩組顯性模型（ID+DD比Ⅱ）分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 兩組NFKB1基因rs28362491位點(diǎn)基因多態(tài)性分布[例（%）]

2.4 EH危險(xiǎn)因素的logistic回歸分析 將是否患有EH作為因變量，EH相關(guān)危險(xiǎn)因素如年齡、吸煙、飲酒、BMI、糖尿病、TG、TC及NFKB1基因 rs28362491位點(diǎn)DD基因型作為自變量。在校正吸煙、飲酒、BMI、高血壓等因素后，DD基因型仍是EH的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=1.729，95%CI：1.135～3.926，P＜0.05），見表3。

表3 EH危險(xiǎn)因素的logistic回歸分析

2.5 兩組對(duì)象及不同基因型者TNF-α水平比較 ET組血清TNF-α水平為（3.22±0.83）pg/ml，高于NT組的（2.75±0.84）pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。DD基因型對(duì)象血清TNF-α水平為（3.51±0.91）pg/ml，高于Ⅱ+ID基因型對(duì)象的（3.24±0.78）pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

EH是常見的慢性疾病之一，中國(guó)18歲及以上的居民發(fā)病率約27.9%，且患病率仍呈升高趨勢(shì)[9]。長(zhǎng)期EH易并發(fā)心、腦、腎等血管疾病，且EH目前無法治愈，已成為影響人類健康的公共衛(wèi)生問題。因此，對(duì)高血壓發(fā)病機(jī)制的研究并制定相應(yīng)的治療對(duì)策是近年來研究熱點(diǎn)[10]。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，炎癥與EH的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[11]。NF-κB是一種重要的多功能核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其介導(dǎo)信號(hào)通路是炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)中樞[12]。激活的NF-κB能使下游炎癥相關(guān)因子如TNF-α、IL-8過度表達(dá)，一方面，這些炎癥因子誘導(dǎo)血管壁產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，刺激血管平滑肌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而生血管重塑，最終促進(jìn)血壓升[13]；另一方面，這些細(xì)胞因子對(duì)NF-κB的正反饋，可進(jìn)一步活化NF-κB，造成持續(xù)或放大的炎癥反應(yīng)來調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)[14]。

NF-κB是由 p65（RelA）、c-Rel、RelB、NFKB1（p50/p105）、NFkB2（p52/p100）組成，其中 NFKB1基因編碼的p50蛋白常以p50/p65異源二聚體和p50/p50同源二聚體兩種結(jié)合形式發(fā)揮功能[15]，影響NF-κB信號(hào)通道表達(dá)。p50/p65異源二聚體是人體內(nèi)最常見且含量最豐富的二聚體，可通過增加炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄而具有促炎癥性質(zhì)，例如TNF-α和IL-12，而p50/p50同型二聚體通過刺激抗炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄具有抗炎作用，例如IL-10[16]。rs28362491位點(diǎn)是NFKB1基因中唯一具有表達(dá)功能的SNP，表現(xiàn)為ATTG堿基的插入/缺失，編碼Ⅱ、ID、DD 3種基因。既往研究表明，在不同人群中，攜帶NFKB1基因rs28362491 D等位基因或DD基因型的攜帶者體更易患慢性炎癥性疾病，如冠心病、腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[17-18]，但與EH相關(guān)性研究不多。本研究探討NFKB1-94ins/del ATTG基因多態(tài)性在EH人群的分布，結(jié)果顯示EH組NFKB1基因rs28362491位點(diǎn)DD基因型和D等位基因分布頻率顯著高于NT組；在校正其它危險(xiǎn)因素后，攜帶DD基因型人群EH發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加1.729倍，提示D等位基因可能是EH發(fā)生的遺傳易感基因，但具體發(fā)病機(jī)制仍不明確。

TNF-α是重要的促炎因子，通過內(nèi)皮功能破壞和平滑肌細(xì)胞增殖，產(chǎn)生的氧自由基可直接使平滑肌收縮或間接使內(nèi)皮依賴性舒張因子失活，增加收縮血管效應(yīng)，與高血壓病的發(fā)生、發(fā)展密切[19]。NFKB1作為NF-κB蛋白家族組成部分，與炎癥反應(yīng)介質(zhì)關(guān)系密切。本研究結(jié)果證明，EH組患者血清TNF-α水平明顯高于NT組，此外，NFKB1-94ins/del ATTG DD基因型攜帶者的血清TNF-α水平高于ID基因型和Ⅱ基因型。筆者推測(cè)，NFKB1-rs28362491位點(diǎn)ATTG缺失（等位基因D），影響NF-κB轉(zhuǎn)錄效率，p50蛋白合成減少，引起p50/p65異源二聚體和p50/p50同源二聚體失衡，刺激TNF-α的產(chǎn)生，最終使機(jī)體處于炎癥過度表達(dá)的狀態(tài)。

綜上所述，NFKB1基因rs28362491位點(diǎn)多態(tài)性是EH的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，D等位基因可能通過調(diào)節(jié)血清TNF-α的水平成為易感等位基因，影響EH的發(fā)生、發(fā)展。本研究存在一定的局限性：EH是一種多基因疾病，需進(jìn)行基因-基因交互作用以及基因-環(huán)境交互作用方面的研究；本研究樣本量少，為橫斷面研究，不能像隊(duì)列研究一樣預(yù)測(cè)因果關(guān)系；NFKB1基因調(diào)節(jié)多種炎性細(xì)胞因子，本研究?jī)H觀察TNF-α，今后還需進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥因子范圍深入研究。