彭瀟 饒杰 吳慧華 項(xiàng)已桉

惡性膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，患者預(yù)后不良，中位生存期僅14.6個(gè)月，3年生存率僅為10%[1]。外科手術(shù)聯(lián)合術(shù)后同步放化療是惡性膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。替莫唑胺（temozolomide,TMZ）是惡性膠質(zhì)瘤常用的化療藥物，但隨著化療進(jìn)行，大部分患者最終會(huì)對TMZ耐藥[2]。TMZ的耐藥機(jī)制復(fù)雜，是不同機(jī)制相互作用的結(jié)果。除了DNA損傷修復(fù)，腫瘤微環(huán)境重塑、表觀遺傳學(xué)改變、信號通路持續(xù)活化等均可導(dǎo)致惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對TMZ耐藥[2-3]。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）及其突變體在惡性膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中呈異常高表達(dá)，可促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和耐藥[4]。EGFR介導(dǎo)的惡性膠質(zhì)瘤耐藥與其持續(xù)激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）信號通路有關(guān)[5]。達(dá)托利司（dactolisib,DAC）是一種能夠干擾PI3K和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)復(fù)合物活性的小分子抑制劑，研究表明DAC能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖[6-8]，但對TMZ耐藥的影響及機(jī)制尚未完全明確。本研究探討DAC抑制TMZ耐藥惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 DAC（純度：＞98%，分子量：400.4648，批號：S117968）購自上海阿拉丁公司，杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗、FBS、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，EGFR（批號：ab52894）、B細(xì)胞淋巴瘤（B cell lymphoma 2,Bcl-2，批號：ab241548）、切割半胱氨酸蛋白酶 3（Cleaved-Caspase 3，批號：ab214430）和β-actin（批號：ab6276）抗體均購自上海Abcam公司。細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測試劑盒（批號：C2015S）、赫斯特染料（批號：C1011）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，Prime Script RT Master Mix試劑盒（批號：RR36A）、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（批號：RR820A）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。U251細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批準(zhǔn)文號：科研倫審（2020）第（232）號]。

1.2 方法

1.2.1 耐藥細(xì)胞模型的建立 采用濃度梯度遞增法，將1×105個(gè)U251細(xì)胞接種于含有10%FBS的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基，置于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后更換含有1 μmol/L TMZ的培養(yǎng)基，24 h后更換無TMZ培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞恢復(fù)生長且狀態(tài)良好后，重復(fù)上述操作繼續(xù)增加TMZ藥物濃度，直至細(xì)胞能在含有10 μmol/L TMZ的培養(yǎng)基正常生長時(shí)，停止誘導(dǎo)，獲得穩(wěn)定耐藥細(xì)胞株，即TMZ耐藥U251細(xì)胞（U251R）。

1.2.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將U251R細(xì)胞接種于無雙抗、無血清培養(yǎng)基，置于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞融合度為60%～80%時(shí)，將U251R細(xì)胞分為DAC組、DAC干預(yù)的EGFR低表達(dá)組（KD組）、DAC干預(yù)的EGFR過表達(dá)組（OE組）和對照組；DAC組、KD組、OE組分別用陰性對照載體、EGFRKD載體、EGFR-OE載體轉(zhuǎn)染48 h后，加入DAC；對照組為未經(jīng)任何干預(yù)的U251R細(xì)胞。經(jīng)上述處理后，將4組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 細(xì)胞死亡比例測定 采用鈣黃綠素和碘化丙啶雙染色法，用1 ml PBS洗滌4組細(xì)胞3次后，按照細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書，加入1 ml含有鈣黃綠素和碘化丙啶的工作液，室溫下孵育30 min。測定細(xì)胞死亡比例，并用德國徠卡DMi8熒光顯微鏡觀察細(xì)胞死亡情況。

1.2.4 細(xì)胞凋亡比例測定 采用赫斯特染色法。用1ml PBS洗滌4組細(xì)胞3次后，加入1 ml含有赫斯特染料的工作液，置于室溫下孵育30 min。測定細(xì)胞凋亡比例，并用德國徠卡DMi8熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法，用1 ml PBS洗滌4組細(xì)胞3次后，每孔加入150 μl細(xì)胞裂解液，冰上裂解15 min，收集細(xì)胞裂解液，置于4℃離心機(jī)，12 000r/min，離心15 min，收集上清液進(jìn)行蛋白定量。將20 μg總蛋白加入聚丙烯酰胺梯度凝膠進(jìn)行電泳分離后，用全濕轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯膜，隨后用3%脫脂奶粉封閉1 h，加入適量比例的EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase 3抗體，置于4℃冰箱過夜。用洗滌液洗膜3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（稀釋比例為1∶20 000）室溫下孵育2 h；再次洗膜后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影，采用Image J分析軟件對蛋白條帶進(jìn)行半定量分析，比較4組細(xì)胞EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 EGFR mRNA相對表達(dá)水平檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法，用1 ml PBS洗滌4組細(xì)胞3次后，加入1 ml Trizol試劑，提取總RNA。按照Prime Script RT Master Mix試劑盒說明書合成cDNA，用ABI 7500 PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。EGFR的引物系列為：上游 5'-GCCCTCTGGAGCACCTCTACT-3'，下游5'-CATCTTGCACTGTTTGAGGTTGTAC-3'；GAPDH作為內(nèi)參，引物系列為:上游5'-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3'，下 游 5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'。應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算EGFR mRNA相對表達(dá)水平，比較4組細(xì)胞EGFR mRNA相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞死亡比例比較 4組細(xì)胞死亡比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=58.48，P＜0.01）。DAC組和KD組的細(xì)胞死亡比例為（53.11±7.96）%和（61.98±9.10）%，均高于對照組的（7.41±4.53）%，OE組細(xì)胞死亡比例為（6.70±3.22）%，低于DAC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。顯微鏡下可見死細(xì)胞被碘化丙啶染色，呈紅色，活細(xì)胞被鈣黃綠素染色，呈綠色，見圖1（插頁）。

2.2 4組細(xì)胞凋亡比例比較 4組細(xì)胞凋亡比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.67，P＜0.01）。DAC組、KD組細(xì)胞凋亡比例為（15.23±1.56）%和（18.36±5.96）%，均高于對照組的（2.96±1.54）%，OE組細(xì)胞凋亡比例為（1.63±1.30%），低于DAC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。顯微鏡下可見凋亡的細(xì)胞核被赫斯特染料致密濃染，顯微鏡下呈亮藍(lán)色，見圖2（插頁）。

2.3 4組細(xì)胞EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)水平比較 4組細(xì)胞EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。DAC組和KD組細(xì)胞EGFR、Bcl-2蛋白表達(dá)水平均低于對照組，Cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。OE組細(xì)胞EGFR、Bcl-2蛋白表達(dá)水平高于DAC組，Cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)水平低于DAC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。4組細(xì)胞EGFR、Cleaved-Caspase 3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的電泳圖見圖3。

圖3 4組細(xì)胞EGFR、Cleaved-Caspase 3和Bcl-2蛋白表達(dá)的電泳圖（a：EGFR蛋白表達(dá)的電泳圖，b：Bcl-2和Cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)的電泳圖）

表1 4組細(xì)胞EGFR、Bcl-2和Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)水平比較

2.4 4組細(xì)胞EGFR mRNA相對表達(dá)水平比較 4組細(xì)胞EGFR mRNA相對表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=434.80，P＜0.01）。DAC組、KD組細(xì)胞EGFR mRNA相對表達(dá)水平為0.22±0.05和0.12±0.04，低于對照組的1.00±0.03，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；OE組細(xì)胞EGFR mRNA相對表達(dá)水平為2.40±0.16，高于DAC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

DAC是一種咪唑喹啉衍生物，可有效地抑制細(xì)胞增殖，對腫瘤生長、轉(zhuǎn)移有抑制作用，常用于輔助增加抗癌藥物的靈敏度[9]。近年來，報(bào)道稱DAC能誘發(fā)化療藥物耐藥細(xì)胞死亡，還能抑制酪氨酸受體抑制劑耐藥腫瘤細(xì)胞增殖[6，10-11]。Durrant等[6]發(fā)現(xiàn) DAC 能逆轉(zhuǎn)卵巢癌和胰腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥性。Yu等[11]研究表明DAC可誘發(fā)奧沙利鉑耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞死亡；Sano等[10]證實(shí)DAC能抑制埃羅替尼耐藥肺癌細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，DAC組和KD組的細(xì)胞死亡比例高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Yu等[9]結(jié)果一致，說明DAC能夠誘發(fā)U251R細(xì)胞死亡，可用于緩解TMZ耐藥。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，激活細(xì)胞凋亡途徑是DAC發(fā)揮抗腫瘤活性重要機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)，DAC干預(yù)后Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡比例增加，但這種效應(yīng)可被細(xì)胞凋亡抑制劑阻斷[12]。DAC還可損害細(xì)胞線粒體功能，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧含量，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示，DAC組和KD組的細(xì)胞凋亡比例、Cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)水平均高于對照組，DAC組、KD組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此說明，DAC能夠打破凋亡相關(guān)蛋白之間的平衡關(guān)系，誘發(fā)U251R細(xì)胞凋亡，與Zhu等[14]的研究結(jié)果一致。

EGFR是一種酪氨酸激酶型受體，與配體結(jié)合后可發(fā)生構(gòu)象變化，暴露磷酸化位點(diǎn)，發(fā)生自身磷酸化。隨后，磷酸化的EGFR能夠募集并激活PI3K，從而激活蛋白激酶B和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)復(fù)合物，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、存活，抵抗藥物損傷[15-17]。研究表明TMZ耐藥的細(xì)胞中，EGFR磷酸化水平增加，能持續(xù)激活PI3K-蛋白激酶B信號通路[5]。報(bào)道稱PI3K或蛋白激酶B抑制劑能夠抑制EGFR及其突變體表達(dá)，緩解EGFR抑制劑耐藥[18]。也有報(bào)道稱哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)復(fù)合物抑制劑與TMZ聯(lián)合應(yīng)用能夠發(fā)揮協(xié)同抗惡性膠質(zhì)瘤的作用[19]。

本研究中DAC組細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)水平和mRNA相對表達(dá)水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Wu等[8]結(jié)果一致。OE組細(xì)胞死亡比例、細(xì)胞凋亡比例低于DAC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此說明DAC能夠通過降低EGFR表達(dá)，緩解TMZ耐藥，但EGFR持續(xù)過表達(dá)能夠阻斷DAC誘導(dǎo)U251R細(xì)胞死亡和凋亡。EGFR藥理學(xué)抑制劑可作為增敏劑用于提高TMZ抗惡性膠質(zhì)瘤靈敏度，為后續(xù)研究提供了科學(xué)依據(jù)。