于曉猛，馮仁蕊，王 宏，康 利，江 茜，王鄭辛夷，黃 琳，張 川，王 蕾

腹膜透析是終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD）患者的有效替代療法，其成功取決于結(jié)構(gòu)和腹膜的功能完整性[1]。盡管腹膜透析極大程度改善了ESRD 患者的生存質(zhì)量，但長期暴露于生物不相容的腹膜透析液會造成間皮細胞的損失、基質(zhì)蛋白的積累和間皮下層的厚度增加，大約50%腹膜透析患者容易發(fā)展為進行性纖維化，血管生成和血管變性導(dǎo)致擴散和對流清除不足，因此透析液中高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的腹膜纖維化（peritoneal fibrosis，PF）是導(dǎo)致超濾失敗的主要原因，限制了腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）的長期有效性[2]。研究發(fā)現(xiàn)，由于Wnt/β-catenin 和轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）途徑之間的串?dāng)_能夠誘導(dǎo)纖維化和血管生成，Wnt/βcatenin 信號通路的激活在很多器官，如腎、肝臟、肺、皮膚纖維化的發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3，4]。另外，Wnt/β-catenin 信號通路與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation，EMT） 的發(fā)生有關(guān)，EMT 在PF 和隨后的功能惡化過程中起主要作用。筆者采用5/6 腎切除法+ 高糖腹膜透析液+ 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）法建立大鼠PF 模型，探討Wnt/β-catenin 信號通路在EMT 及纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

選擇SPF 級雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量180～200 g。由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)環(huán)境：5只/籠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，溫度22 ℃～25 ℃，濕度40%～60%，12 h 光照/12 h 黑暗。實驗動物使用許可證號SYXK（津）2016-0007。大鼠自由攝食及飲水，飲水為實驗單位自制的純凈水，飼料購自北京科澳協(xié)力有限公司，飼料生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2014-0010。

1.1.2 藥品與試劑

低鈣腹膜透析液 （乳酸鹽-G 4.25 %）（批號G19072412。廣州百特醫(yī)療用品有限公司，中國）；脂多糖（批號039M4004V。Sigma，美國）；二辛可寧酸（bicin choninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（增強型）（批號abs9233。愛必信生物科技有限公司，中國）；5 ×蛋白上樣緩沖溶液（批號20200115。北京索萊寶科技有限公司，中國）；E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌動蛋白（alpha sarcomeric actin，α-SMA）、βcatenin、淋巴增強因子1（lymphoid enhancer factor 1，LEF1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和Anti-Rabbit IgG（ 批號分別為202003、202003、202002、202003、201910 和201909。CST，美國）；Collagen-Ⅰ和Wnt-1（批號分別為NC04、MC26）、超敏增強型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL） 試劑盒 （批號EL2001001）（愛必信生物科技有限公司，中國）；TRIzon Reagent、HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit、UltraSYBR Mixture（批號分別為03877、CW2582M、40222?？禐槭兰o，中國）。

1.1.3 儀器與設(shè)備

EG1150H 自動生物組織包埋機、RM2255 切片機、UC7 超薄切片機（Leica，德國）；單級微手術(shù)電凝器（武漢春光醫(yī)療美容儀器有限公司，中國）；ST16R高速冷凍離心機（Thermo Fisher，德國）；HT7700 透射電子顯微鏡（HITACHI，日本）；Mini PROTEAN Tetra電泳儀（Bio-Rad，美國）；ECL 凝膠成像系統(tǒng)（Life，美國）；Ci-L 顯微鏡（Nikon，日本）；GET96-PLUS 聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（杭州柏恒科技有限公司，中國）；ME203E 電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司，中國）；LightCycler 480Ⅱreal-time PCR 儀（Roche，瑞士）；日立7080 全自動生化儀（積水醫(yī)療科技有限公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備與分組

雄性Wistar 大鼠20 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后隨機分為對照組、模型組，各10 只/組。

采用5/6 腎切除法+ 高糖腹膜透析液+LPS 行PF 造模。首先行右側(cè)2/3 腎切除手術(shù)。術(shù)前2 h 肌內(nèi)注射青霉素鈉，預(yù)防感染。腹腔注射45 mg/kg 戊巴比妥鈉對實驗動物進行麻醉，右腎外部剃毛，待手術(shù)區(qū)以碘伏-75%乙醇溶液消毒。觸摸腎區(qū)，手術(shù)刀切開皮膚，然后用剪刀剪開肌層，提拉出右腎，剝離腎膜。用止血鉗夾住右側(cè)腎臟腎蒂，剪去右腎上下各1/3 區(qū)域，以電凝器、明膠海綿將切面止血，然后腎臟放回腹腔，逐層縫合。1 周后，行左腎全切術(shù)，以3-0 手術(shù)線結(jié)扎，切去左側(cè)腎臟。對照組大鼠只分離腎臟并不切除。手術(shù)造模1 周后開始每天腹腔注射4.25%葡萄糖腹膜透析液30 mL/kg，1 次/天，連續(xù)28 d；同時于第8、10、12、22、24、26 天腹腔注射LPS（0.6 mg/kg）。腹腔注射腹膜透析液同時，對照組和模型組灌胃給予等體積的純凈水，連續(xù)28 d。

1.2.2 標(biāo)本采集

末次給藥后，用代謝籠收集大鼠24 h 尿液并記錄尿液總量，用以檢測24 h 尿蛋白定量 （24 h-Upro）。把動物麻醉后，從腹主動脈取血，靜置1～2 h后，于3 000 r/min 條件下離心10 min，分離血清，取上清液，于-20 ℃條件下凍存，用以檢測肌酐（serum creatinine，SCr）水平。剖取腹膜，取部分用10%甲醛溶液固定，進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色；取部分于-80 ℃條件下凍存，用于Western blot和real-time PCR 檢測；取部分用2.5%戊二醛溶液固定，用于透射電子顯微鏡觀察。

1.2.3 血清肌酐的檢測

按上述方法獲得血清后檢測SCr 水平。

1.2.4 24 h-尿蛋白的檢測

大鼠置于代謝籠內(nèi)，禁食不禁水，記錄24 h 尿液總量，離心后去上清液，并以中點法檢測24 h-Upro 水平。

1.2.5 腹膜組織病理形態(tài)的觀察

將固定好的腹膜組織脫水，透明后用石蠟包埋制成蠟塊，切成厚度約為3～5 μm 的切片。脫蠟-水化，用蘇木精浸染5 min 后，再用伊紅浸染8 min；脫水-透明-封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并測量腹膜厚度。每張切片取典型病變視野，每個視野隨機測量3 個腹膜厚度，取平均值。

1.2.6 透射電子顯微鏡觀察腹膜組織超微結(jié)構(gòu)

取出固定于2.5%戊二醛溶液中的腹膜組織，用磷酸鹽緩沖溶液浸洗3 次，于室溫下固定2 h，用乙醇和丙酮梯度逐級脫水，使用丙酮樹脂浸透、包埋、聚合，超薄切片60～80 nm，再用乙酸雙氧鈾、酸鉛雙重染色；于透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

1.2.7 Western blot 檢測

測定腹膜組織E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅰ、

β-catenin、Wnt-1 和LEF1 蛋白表達水平。

取出存儲于-80 ℃冰箱的腹膜組織，研磨、離心，吸取上清液，按照BCA 試劑盒說明書檢測蛋白濃度，按比例將5× 蛋白上樣緩沖溶液、0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）和樣品加入到無菌離心管中，置于99 ℃水浴鍋中10 min，進行蛋白變性；制備濃縮膠，分離，加入樣品后，設(shè)置濃縮膠電壓60 V，分離膠電壓120 V，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），恒流轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉；稀釋一抗：Ecadherin、α-SMA、Collagen-Ⅰ、β-catenin、Wnt-1、LEF1 和GADPH 的稀釋比例均為1 ∶1 000；樣品封閉后于4 ℃條件下孵育過夜；二抗按稀釋2 000 倍處理，室溫孵育1 h；孵育后洗膜3 次，發(fā)光并采集圖片保存。使用Image J 測定目標(biāo)條帶與內(nèi)參灰度值的比值，該比值代表檢測蛋白的表達水平。

1.2.8 聚合酶鏈式反應(yīng)法

檢測腹膜組織E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅰ、β-catenin、Wnt-1 和LEF1 mRNA 的表達水平。

用trizol 試劑提取腹膜組織總RNA，測定每份樣品RNA 的濃度，并稀釋到質(zhì)量濃度250 mg/L；設(shè)定總RNA 質(zhì)量濃度為500 ng/L，分別取稀釋后樣品，每份2 μL，加入水和逆轉(zhuǎn)錄試劑后，進行RNA 逆轉(zhuǎn)錄；逆轉(zhuǎn)錄后檢測DNA 濃度，合格后加入DNA 1 μL 及混合物，加蓋，混勻。PCR 反應(yīng)體系：20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，10 min 預(yù)變性；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min 擴增40 個循環(huán)；95 ℃15 s、60 ℃1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s 熔解。采用2-△△Ct法表示各組mRNA 的表達量。

PCR 引物由生工生物工程股份有限公司合成，引物序列：E-cadherin 上游CCCTCCAATGCCTGCTCTTGATG，下游 ATCTGACTGCCTCTGCCTCCTG，長度150 bp；α-SMA 上游TGCTGGACTCTGGAGATGGTGTG，下游CGGCAGTAGTCACGAAGGAATAGC，長度159 bp；Collagen-Ⅰ上游GCTCTGGACCTCCTGGACTACG，下游ACCTGTACTGCCACGGCTACC，長度134 bp；β-catenin 上游CCAGATCGGAAAGCAGCAGTCAG，下游CTGTGGTGGTCGCTCCAGAATG，長度82 bp；Wnt-1 上游ACAGCAACCACAGTCGTCAGAAC，下游AGAGCGGTCAGTGCCAGTAGC，長度120 bp；LEF1 上游GCTGTCCTGCTGCACGAACC，下游CTGTAATCTCCGCTCCGCTGTG，長度113 bp；GADPH 上游ACGGCAAGTTCAACGGCACAG，下游CGACATACTCAGCACCAGCATCAC，長度129 bp。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 19.1 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)± 標(biāo)準差表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠腎功能指標(biāo)SCr 和24 h-Upro 水平比較

與對照組相比，模型組大鼠SCr、24 h-Upro 水平顯著升高（P<0.01）。見表1。

表1 兩組大鼠SCr 和24 h-Upro 水平比較Tab.1 Comparison of SCr and 24-hour-Upro levels between 2 groups

2.2 兩組大鼠腹膜病理形態(tài)、超微組織和腹膜組織厚度比較

HE 染色顯示，對照組大鼠腹膜較薄，表面覆蓋一層連續(xù)的扁平間皮細胞，未見明顯炎性細胞浸潤及組織水腫；模型組大鼠腹膜厚度較對照組增加，組織排列較紊亂，間皮細胞變成圓形或柱形，炎性細胞浸潤明顯，伴水腫，纖維組織增生。透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組腹膜間皮細胞損傷嚴重，細胞膜溶解，細胞器消失、游離，基質(zhì)濃縮，大面積基底膜消失，間皮細胞脫落，細胞崩解、壞死；測量腹膜厚度發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組大鼠腹膜明顯增厚（P ＜0.01）。見圖1。

2.3 兩組腹膜組織E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅰ、β-catenin、Wnt-1 和LEF1 蛋白表達比較

與對照組相比，模型組大鼠腹膜組織中E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅰ、β-catenin、Wnt-1 和LEF1蛋白表達水平明顯升高（P<0.01）。見表2。

表2 兩組大鼠腹膜組織E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅰ、β-catenin、Wnt-1 和LEF1 蛋白表達比較Tab.2 Comparison of protein expression of E-cadherin,α-SMA,Collagen-Ⅰ,β-catenin,Wnt-1 and LEF1 in peritoneal tissue between 2 groups

2.4 兩組腹膜組織E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅰ、β-catenin、Wnt-1 和LEF1 mRNA 表達比較

與對照組相比，模型組大鼠腹膜組織E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅰ、β-catenin、Wnt-1 和LEF1 mRNA 表達水平明顯升高（P<0.01）。見表3。

表3 兩組大鼠腹膜組織E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅰ、β-catenin、Wnt-1 和LEF1 mRNA 表達比較Tab.3 Comparison of E-cadherin,α-SMA,Collagen-Ⅰ,β-catenin,Wnt-1 and LEF1 mRNA expression in peritoneal tissue between 2 groups

3 討論

PF 是PD 患者最嚴重的并發(fā)癥之一，腹膜結(jié)構(gòu)改變、超濾功能衰竭，最終導(dǎo)致患者無法繼續(xù)進行PD[5]。隨著中國PD 患者人數(shù)的不斷增長[6]，如何控制PD 所致PF 的發(fā)生和發(fā)展成為亟需解決的重要問題。

腹膜間皮細胞EMT 在PF 早期的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，且由于該過程具有可逆性，對這一過程的干預(yù)具有積極的臨床作用。腎臟早期發(fā)育過程中Wnt/β-catenin 信號發(fā)揮著關(guān)鍵作用，在腎臟后期發(fā)育中該信號相對沉默，然而在多種腎臟病動物模型和人類腎臟疾病中，它又被重新激活[7]。Wnt-1 和TGF-β 兩種因子共同作用，與細胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，引發(fā)目標(biāo)基因表達的上調(diào)，并增強了膠原蛋白質(zhì)、纖維連接蛋白質(zhì)等細胞外基質(zhì) （extracellular matrix，ECM）的產(chǎn)生和分泌。伴隨ECM 的沉積，基體結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化并最終形成纖維化[8]。在Wnt 信號通路中，Wnt/β-catenin 是最為經(jīng)典的通路，β-聯(lián)蛋白會在胞漿中不斷地積累，并轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)，成為T 細胞因子轉(zhuǎn)錄的共激活因子，進一步促使促纖維化基因大量表達，加速成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化過程[9]。盡管PF 的病因是多種多樣的，但其共同特征是病變組織處存在大量活化的成纖維細胞或肌成纖維細胞，α-SMA 表達的增加促進了Ⅰ型、Ⅲ型膠原的生成，使ECM 顯著增多，而PF 的組織學(xué)特征就是ECM 的過度累積，以及腹膜間皮細胞中成纖維細胞的增殖[10]。

為了探討Wnt/β-catenin 信號通路在PF EMT 進程中發(fā)揮的作用，筆者實驗采用5/6 腎切除法+ 高糖腹膜透析液+LPS 法建立大鼠PF 模型，模型組大鼠腹膜組織炎性細胞浸潤、腹膜基質(zhì)層膠原堆積、腹膜組織明顯增厚。同時，PCR、Western 印跡和免疫組織化學(xué)檢測證實，與對照組相比，模型組大鼠腹膜組織中E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅰ、β-catenin、Wnt-1 和LEF1 蛋白和mRNA 表達水平明顯升高，證實了Wnt 通路相關(guān)靶點蛋白的變化。

綜上，筆者認為，Wnt/β-catenin 信號通路在PFEMT 的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著十分重要的作用，相關(guān)靶點蛋白的研究為日后PF 藥物篩選提供了研究方向和依據(jù)。