曹茜楠，楊麗軍，肖 萌，劉鑒峰

近年來，多藥耐藥細(xì)菌感染已成為威脅全球公共衛(wèi)生的嚴(yán)重問題[1，2]，單一療法的效果往往不如人意，因此亟需開發(fā)一種療效好、耐藥率低及全身毒性小的廣譜性聯(lián)合療法，以實現(xiàn)在傷口感染處的特異性毒性激活，而不對正常組織造成損傷。由于具有特異性的藥物遞送、病灶處選擇性精準(zhǔn)釋放藥物及較低的全身毒性，外源刺激響應(yīng)性聚合物膠束體系在對抗耐藥細(xì)菌感染方面受到廣泛的關(guān)注[3～6]。

吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）已被美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于臨床[7]。在近紅外光（near infrared rad，NIR）照射下，ICG 吸收的光能主要轉(zhuǎn)化為光熱治療的熱量，還有一部分能量則被傳遞給鄰近的水和氧氣產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）[8，9]。姜黃素（curcumin，Cur）具有廣泛的生物活性，如抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌等[10，11]。但由于其較差的水溶性和較低的生物利用率，Cur 的臨床發(fā)展受到嚴(yán)重制約[12]。而兩親性聚合物膠束作為合適的藥物遞送載體為Cur 的體內(nèi)應(yīng)用創(chuàng)造了有力的平臺。

據(jù)此，筆者所在課題組通過在強生物相容性親水聚合物聚乙二醇[poly（ethyleneglycol），PEG]上鍵合疏水性ICG，并在所形成的兩親性聚合物自組裝的過程中負(fù)載Cur，構(gòu)建了一種具有NIR 響應(yīng)性的ROS敏感型納米聚合物膠束[姜黃素@聚乙二醇-硫代縮酮-吲哚菁綠[curcumin@poly（ethyleneglycol）-thioketal-indocyanine green polymeric micelles，Cur@PEG-TK-ICG PMs]，用于化學(xué)-光熱聯(lián)合治療耐藥細(xì)菌感染。當(dāng)暴露于NIR 激光照射下，包裹Cur 的聚合物膠束Cur@PEG-TK-ICG PMs 首先通過ICG 將吸收的光能一部分轉(zhuǎn)化為熱量，使傷口感染處迅速升溫實現(xiàn)光熱殺菌，另一部分生成高水平ROS，切割聚合物的TK鍵使膠束分解，實現(xiàn)Cur 的快速釋放。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗材料

甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺[methoxy-poly（ethylene glycol）-succinimide，PEG-NHS；相對分子質(zhì)量2 000]、吲哚菁綠N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯（indocyanine green N-hydroxysulfo-succinimide ester，ICGSulfo-OSu）、2，2-丙烷-2，2-二基雙（磺胺二基）二乙胺[2，2’-（propane-2，2-diylbis（sulfanediyl））diethanamine，NH2-TK-NH2]（西安瑞希生物技術(shù)有限公司，中國）；三乙胺 （trimethylamine，TEA）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、二乙醚（北京J&K 化學(xué)技術(shù)公司，中國）；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、瓊脂（北京索萊寶科技有限公司，中國）；9，10-蒽二基-雙（亞甲基）-二甲酸[9，10-anthracenediyl-bis(methylene)-dimalonic acid，ABDA]（上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，中國）；透析袋（1 000 u）（天津天南科技有限公司，中國）；RPMI 1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Gibco，美國）；Cur（上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，中國）；酵母提取物、胰蛋白胨（OXOID，英國）；細(xì)胞計數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒（碧云天生物科技有限公司，中國）；96 孔板（Corning，美國）。所有的商業(yè)試劑都是直接使用。

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3 和小鼠成纖維細(xì)胞L929 均來自于實驗室冷凍保存。

1.1.2 主要儀器

動態(tài)光散射粒度儀（Zetasizer Nano ZS）（Malvern Instruments，英國）；紫外分光光度計（UV-2550）（Shimadzu，日本）；透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）（Tecnai G2 F20 系統(tǒng)）（FEI，美國）；核磁共振波譜儀（300 MHz）（Bruker，德國）；純水儀（Millipore，美國）；電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，中國）；全波長酶標(biāo)儀（Varios-kan Flash）（Thermo Scientific，美國）；化學(xué)發(fā)光成像儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，中國]；808 nm 激光器（LIP20W）（Laserwave，中國）；紅外熱成像儀（ST20 MAX）（Fluke，美國）。

1.2 方法

1.2.1 高分子化合物的合成

將溶解在1 mL DMSO 的PEG-NHS（212.5 mg）溶液緩慢滴加到含有NH2-TK-NH2（29.2 mg）和TEA（10.2 mg）的DMSO（1 mL）中，在室溫下避光攪拌反應(yīng)24 h。之后，在攪拌下將所得混合物逐滴加入冷的二乙醚（100 mL）中，通過離心（3 500 r/min，5 min）和真空干燥，得到淺黃色沉淀物，即中間聚合物PEG-TKNH2（192.5 mg；產(chǎn)率87.3%）。隨后，將PEG-TK-NH2（44.0 mg）、ICG-Sulfo-OSu（37.2 mg）和TEA（2.0 mg）加入到2 mL DMSO 中室溫避光攪拌20 h，經(jīng)過72 h的透析和48 h 的冷凍干燥后，收集到純的深綠色PEG-TK-ICG 粉末（49.8 mg；產(chǎn)率85.4%）。

1.2.2 聚合物膠束的合成

空白膠束的制備：稱取10.0 mg PEG-TK-ICG 于0.5 mL DMSO 中充分溶解，以1 滴/20 秒的速度加入到劇烈攪拌的9 mL PBS（濃度1 mmol/L，pH 7.4）中，室溫攪拌10 h 以穩(wěn)定膠束。隨后將液體置于透析袋中透析72 h 后得到空白聚合物膠束——聚乙二醇-硫代縮酮-吲哚菁綠[poly（ethyleneglycol）-thioketal-indocyanine green polymeric micelles，PEG -TK -ICG PMs]。

負(fù)載Cur 的聚合物膠束的制備：按照同樣的方法稱取10.0 mg PEG-TK-ICG 和2.0 mg Cur 于0.5 mL DMSO 中充分溶解，以1 滴/20 秒的速度加入到劇烈攪拌的9 mL PBS（濃度1 mmol/L，pH 7.4）中，室溫攪拌10 h 以穩(wěn)定膠束。隨后將液體置于1 000 u 透析袋中透析72 h 后得到載有Cur 的聚合物膠束——Cur@PEG-TK-ICG PMs。

聚合物膠束的藥物包載效率（drug loading efficiency，DLE）和藥物包載含量（drug loading content，DLC）通過以下公式確定。DLE（%）=（Cur 的包載質(zhì)量/Cur的投料質(zhì)量）×100%；DLC（%）= （Cur 的包載質(zhì)量/聚合物膠束的質(zhì)量）×100%。

1.2.3 聚合物膠束的表征

使用TEM 考察納米膠束的形貌和尺寸；使用動態(tài)光散射（dynamic laser scattering，DLS）收集納米膠束的動力學(xué)尺寸；利用紫外-可見分光光度計（ultravio let-visible spectrophotometer，UV-vis） 記錄納米膠束在300～900 nm 波長范圍內(nèi)的紫外-可見吸收光譜。

1.2.4 聚合物膠束的ROS 生成能力

分別量取2 mL PBS、ICG 和PEG-TK-ICG PMs溶液與溶解有50 μL ABDA 的DMSO 溶液混合均勻，得到相同ICG 質(zhì)量濃度（0.5 mg/mL） 和ABDA 質(zhì)量濃度（0.1mg/mL） 的一系列體系，使用808 nm 激光照射（0.8 W/cm2，10 min）后，通過酶標(biāo)儀記錄400 nm 處的光密度（optical density，OD）來監(jiān)測納米膠束的ROS產(chǎn)生情況。

1.2.5 姜黃素的釋放

將1mLCur@PEG-TK-ICGPMs 溶液與9mLDMSO混合以分散聚合物膠束。然后，檢測混合物在425 nm的OD，并根據(jù)濃度-OD 標(biāo)準(zhǔn)曲線確定Cur 的濃度。為了研究Cur 的釋放情況，將1 mL Cur@PEG-TK-ICG PMs 溶液加入到透析袋中，隨后將透析袋浸泡在9 mL PBS 中，在使用或不使用808nm 激光照射（0.8W/cm2，10 min）后，將體系放置于37 ℃恒溫水??；分別在預(yù)設(shè)時間點從體系中取出1 mL 溶液收集425 nm 處的OD值，同時向體系中補加1 mL PBS，重復(fù)操作直至結(jié)束。

1.2.6 聚合物膠束的光熱升溫行為

在石英比色皿中分別加入2 mL PBS、Cur@PEGTK-ICG PMs、PEG-TK-ICG PMs 和ICG 溶液（各體系中ICG 質(zhì)量濃度均為50 μg/mL），隨后使用808 nm激光照射（0.8 W/cm2，10 min），每隔30 s 通過紅外熱成像儀記錄溶液的溫度。

1.2.7 體外細(xì)胞毒性實驗

膠束的細(xì)胞毒性實驗以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3 和小鼠成纖維細(xì)胞L929 為模型。將生長狀態(tài)良好的兩種細(xì)胞以8 000 個/孔的密度分別接種于96 孔板中，在細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)24 h 使細(xì)胞貼壁。將Cur@PEG-TK-ICG PMs 溶液用RPMI 1640 完全培養(yǎng)液稀釋成一系列濃度梯度，向每孔加入100 μL 包含不同濃度膠束的培養(yǎng)液，每個濃度設(shè)置6 個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后通過CCK-8 評估聚合物膠束對細(xì)胞的毒性。

1.2.8 聚合物膠束的抗菌能力檢測

1.2.8.1 細(xì)菌培養(yǎng) 在超凈工作臺內(nèi)，取一個15 mL離心管，加入5 mL 溶菌肉湯培養(yǎng)液，用滅菌槍頭輕輕挑取一個單克隆菌落，將槍頭打入培養(yǎng)液中，再將離心管放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中于130 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。

1.2.8.2 平板克隆法 細(xì)菌在600 nm 處會產(chǎn)生特定吸收，因此常用其在600 nm 處的OD 值（OD600）來衡量菌液中的細(xì)菌數(shù)量。將預(yù)先培養(yǎng)好的菌液濃度調(diào)整為OD600=4 左右待用。在超凈臺中準(zhǔn)備4 個1.5 mL 的EP（eppendorf）管，分別向每個EP 管中加入100 μL菌液+300 μL PBS、100 μL 菌液+300 μL Cur、100 μL 菌液+300 μL PEG-TK-ICG PMs、100 μL 菌液+300 μL Cur@PEG-TK-ICG PMs，分別記為空白對照組、Cur組、PEG-TK-ICG PMs+NIR 組、Cur@PEG-TK-ICG PMs+NIR 組，使得最終Cur 的含量為0.12 mg/mL，膠束的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。未照射組在37 ℃條件下共孵育120 min；照射組在37 ℃共孵育30 min 后用808 nm 激光（功率密度0.8 W/cm2，10 min）照射后繼續(xù)共孵育90 min。將三角形涂布棒在酒精燈上充分滅菌后靜置冷卻到室溫待用，將不同處理后的混合液用溶菌肉湯培養(yǎng)液稀釋4 萬倍，分別取100 μL 稀釋液滴到不同的固體培養(yǎng)基中心位置，用三角形涂布棒將稀釋后的混合液涂勻，最后將培養(yǎng)皿倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后用化學(xué)發(fā)光成像儀拍照記錄。

1.2.8.3 OD600法 將菌液濃度調(diào)整為OD600=1 左右待用，在超凈工作臺中準(zhǔn)備1 個96 孔板，分別向不同孔中加入50 μL 菌液+ 150 μL PBS、50 μL 菌液+150 μL Cur、50 μL 菌液+150 μL PEG-TK-ICG PMs、50 μL 菌液+150 μL Cur@PEG-TK-ICG PMs，分別記為空白對照組、Cur 組、PEG-TK-ICG PMs+NIR 組、Cur@PEG-TK-ICG PMs + NIR 組，每組設(shè)置3個復(fù)孔，各材料濃度及處理細(xì)菌方法同上，孵育完成后使用酶標(biāo)儀檢測600 nm 處的OD600。

2 結(jié)果

2.1 聚合物的合成與表征

通過PEG-NHS、NH2-TK-NH2、ICG-Sulfo-OSu的兩步酰胺化反應(yīng)制備得到兩親性聚合物PEG-TKICG，具體的合成路線如圖1所示。采用核磁共振氫譜對聚合物PEG-TK-ICG 進行結(jié)構(gòu)表征（圖2），其部分各峰歸屬如下所示：1.53（—CH3，c），1.89（—CH3，d），3.37（—OCH3，a），3.63（—CH2O—，b）。此外，根據(jù)對核磁氫譜圖的綜合分析，PEG-TK-NH2的TK 接枝率及聚合物PEG-TK-ICG 的ICG 接枝率均接近100%。

2.2 聚合物膠束的制備與藥物包載表征

采用經(jīng)典的溶劑交換法，通過親疏水作用使得兩親性聚合物在水溶液中自組裝形成具有疏水性核心與親水性外殼的聚合物膠束納米粒。疏水性藥物Cur通過疏水相互作用被包裹在膠束的疏水核心部位，得到載藥聚合物膠束Cur@PEG-TK-ICG PMs（圖3a）。聚合物載藥膠束形成了大小均一的球形納米粒，平均尺寸約為90 nm，通過DLS 測量得到的平均流體動力學(xué)粒徑約為95 nm，且粒徑分布較窄，說明納米粒尺寸均勻，與TEM 結(jié)果相吻合。如圖3b 所示，在Cur@PEGTK-ICG PMs 的紫外-可見光吸收光譜中可以分別觀察到ICG 的特征吸收峰（720 nm 和780 nm）和Cur 的特征吸收峰（425 nm），證明了ICG 成功共價連接且實現(xiàn)了姜黃素的有效負(fù)載。通過載藥聚合物膠束離散后收集Cur 的紫外-可見光吸收光譜，根據(jù)Cur OD-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線及投料比計算，得到聚合物膠束的藥物包載效率和膠束的藥物包載含量分別為93.75 %和18.75%。

2.3 ROS 的產(chǎn)生

NIR 照射聚合物膠束產(chǎn)生ROS 使TK 鍵斷裂是藥物釋放的前提。ABDA 作為檢測單線態(tài)氧的探針，與ROS 反應(yīng)后400 nm 處的特征OD400降低，通過監(jiān)測溶液中ABDA 的含量可以對體系中ROS 的產(chǎn)生量進行定量分析。在808 nm 激光照射后ICG 溶液和PEG-TK-ICG PMs 均消耗了一定量的ABDA，證明二者在照射后均可有效產(chǎn)生單線態(tài)氧。值得注意的是，相比于ICG 溶液中產(chǎn)生的ROS 對ABDA 的消耗量（55%），PEG-TK-ICG 聚合物膠束體系中消耗ABDA的量有所下降（30%）。這主要歸因于TK 鍵對部分ROS 的爭奪消耗，導(dǎo)致體系中與ABDA 反應(yīng)的ROS減少。見圖4。

2.4 聚合物膠束NIR 響應(yīng)性藥物釋放性能研究

為了評估載藥聚合物膠束對NIR 響應(yīng)性藥物釋放能力，進行了808 nm 激光照射（0.8 W/cm2，10 min）條件下的藥物釋放實驗。通過記錄NIR 照射后體系在425 nm 處的OD425，進而考察其NIR 響應(yīng)性的藥物釋放行為，從而驗證載藥聚合物膠束的NIR 響應(yīng)性。在無NIR 照射條件下，隨著時間變化藥物釋放速率緩慢且累積釋藥量較小，即使在60 min 后累積藥物釋放率仍低于20%；而在NIR 照射條件下，Cur@PEGTK-ICG PMs 能夠快速響應(yīng)，在30 min 內(nèi)即實現(xiàn)了負(fù)載藥物的完全釋放，證明了所設(shè)計的聚合物載藥膠束具有優(yōu)異的NIR 觸發(fā)的釋藥能力。見圖5。

2.5 聚合物膠束的光熱行為研究

通過比較PBS、PEG-TK-ICG PMs、Cur@PEG-TKICG PMs 及游離的ICG 的溫度變化來評估聚合物膠束的光熱性能。在NIR 照射下，相同ICG 濃度的PEG-TK-ICG PMs 溶液、Cur@PEG-TK-ICG PMs 溶液和游離ICG 溶液均能快速升溫，且隨著時間的延長溫度持續(xù)升高。在光照10 min 后，游離的ICG 溶液溫度從20 ℃升高至49 ℃；值得注意的是，PEG-TKICG PMs 溶液和Cur@PEG-TK-ICG PMs 溶液溫度均從20 ℃升至約53 ℃，且升溫趨勢類似。以上實驗結(jié)果表明Cur@PEG-TK-ICG PMs 可被NIR 激活以實現(xiàn)快速的藥物釋放及溫度的升高，優(yōu)異的NIR 響應(yīng)特性使其有望獲得理想的抗菌效果。見圖6。

2.6 聚合物膠束的細(xì)胞毒性測試

良好的生物相容性是聚合物膠束應(yīng)用的前提。即使在Cur@PEG-TK-ICG PMs 的質(zhì)量濃度達(dá)800 μg/mL時，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3 和小鼠成纖維細(xì)胞L929 的存活率依舊在90%以上，證明載藥聚合物膠束具有良好的生物相容性，保證了進一步生物應(yīng)用的安全性。見圖7。

2.7 聚合物膠束的抗菌性能

為了進一步研究Cur@PEG-TK-ICG PMs 的抗菌活性，選取耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistant staphylococcus aureus，MRSA）作為模型菌。將MRSA 分別與PBS、PEG-TK-ICG PMs、姜黃素和Cur@PEG-TK-ICG PMs 共孵育，并對其進行激光照射或不照射處理后，采用菌落的平板克隆法和OD600法對納米載藥聚合物膠束的抗菌效果進行評估。Cur@PEG-TK-ICG+NIR 組形成的細(xì)菌菌落最少，對細(xì)菌的殺傷率達(dá)到90%以上，顯示出最強的殺菌作用，PEG-TK-ICG+NIR 組和Cur 組對細(xì)菌僅顯示出一定的損傷作用，說明Cur@PEG-TK-ICG PMs 可通過光熱和抗菌藥物的協(xié)同作用實現(xiàn)增強抗菌的效果。見圖8、9。

3 討論

為了抗菌，尤其是抗多藥耐藥細(xì)菌，越來越多的研究人員致力于探索非抗生素的抗細(xì)菌感染方法。生理環(huán)境的復(fù)雜性致使刺激響應(yīng)性藥物遞送系統(tǒng)應(yīng)對傷口感染處的內(nèi)源性信號作出響應(yīng)時存在選擇性差、易脫靶等問題[13]。相比而言，NIR[14]、X 射線[15]、超聲[16]等外源性刺激則能夠以精準(zhǔn)的位點選擇性實現(xiàn)藥物按需釋放，從而獲得研究人員的青睞。

在筆者研究中，成功構(gòu)建了一種能夠?qū)IR 刺激快速做出響應(yīng)的ROS 自敏感型聚合物膠束（圖10）。該聚合物在疏水相互作用下以93.75 %的藥物包載效率負(fù)載抗菌藥物Cur，并通過自組裝策略形成尺寸約為90 nm 的均一球形聚合物膠束納米粒。這一結(jié)果表明，通過兩親性聚合物自組裝成為納米膠束的策略能夠?qū)崿F(xiàn)疏水小分子藥物的高效負(fù)載，拓寬了疏水藥物在生物體中的應(yīng)用。對比空白聚合物膠束PEGTK-ICG PMs 和載藥聚合物膠束Cur@PEG-TK-ICG PMs 的吸收光譜，發(fā)現(xiàn)Cur 的包載并不會影響聚合物膠束的光學(xué)特性，這也證明了載藥聚合物膠束對NIR的吸收能力不因藥物的包載而受影響。相比于無NIR輻照的對照組，NIR 輻照能夠激活聚合物膠束解聚使Cur 響應(yīng)性地在30 min 內(nèi)完全釋放，同時ICG 在NIR輻照下引起的局部升溫也將進一步加速藥物的釋放，這種NIR 智能響應(yīng)激活的設(shè)計能夠避免藥物在正常組織器官處泄露造成的全身毒性，同時實現(xiàn)在傷口感染處特異性按需釋放抗菌藥物達(dá)到快速殺菌的目的。

與現(xiàn)有抗生素相比，該策略中所使用的藥物對細(xì)菌種類并無特異性，NIR 這一外源性刺激的引入則賦予了抗菌以精準(zhǔn)的位點選擇性，化學(xué)-光熱協(xié)同抗菌更展現(xiàn)出了增強的抗細(xì)菌感染能力。因此，筆者相信這種通過NIR 激活的化學(xué)-光熱聯(lián)合治療的策略可以為耐藥細(xì)菌感染的精準(zhǔn)治療提供新的途徑，并有望在未來的臨床試驗中得到廣泛的應(yīng)用。