王晶琴，石貴陽，楊松花，陳 竹，楊通黎，馬秀國

（貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

0 引言

【研究意義】大豆（Glycine maxL.）是食用油和植物蛋白的重要來源[1]，也是重要的保健食品和新型工業(yè)原料[2-3]。近年來，我國大豆在供需方面的矛盾日漸突出[4]，提高我國國內(nèi)大豆的產(chǎn)量以保障正常的供給具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[5]。磷在土壤中的生物有效性很低，缺磷是制約大豆增產(chǎn)的主要營養(yǎng)因素[6]。磷屬于非可再生資源，全球的磷礦資源預(yù)計(jì)僅能利用50～100年[7]。而且施用的磷肥極易被土壤固定，不能有效解決作物缺磷問題[8-9]，過量施磷還增加了農(nóng)業(yè)面源污染的風(fēng)險(xiǎn)。挖掘大豆自身活化和利用土壤磷庫的潛力、選育磷高效品種對減少磷肥用量、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】磷構(gòu)成核酸、磷脂、ATP等重要有機(jī)分子，因此缺磷會降低細(xì)胞磷濃度，削弱能量的固定和釋放，不利于養(yǎng)分和光合產(chǎn)物的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，并進(jìn)一步影響細(xì)胞分裂和植株生長，最終造成減產(chǎn)。對大豆、苦蕎、紫花苜蓿等作物的研究表明，不同基因型的品種對磷的利用效率存在顯著差異，從而為磷高效品種的篩選提供了材料。研究早期，主要選用生物量[10]、產(chǎn)量[11]、磷吸收量和磷利用效率[12]等單一指標(biāo)來篩選磷高效大豆品種。但大豆磷效率是受多基因控制的復(fù)合數(shù)量性狀[13]，大豆對磷的感知、截獲、活化、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用能力都會影響其磷效率，目前仍缺少統(tǒng)一的磷效率評價(jià)體系，難以準(zhǔn)確鑒定磷高效利用大豆品種及其控制基因。近年來，結(jié)合耐性指數(shù)、主成分分析、隸屬函數(shù)法和灰色關(guān)聯(lián)分析的綜合評價(jià)體系在作物抗逆和耐瘠性評價(jià)中得到廣泛運(yùn)用[14-18]。武兆云等[19]通過主成分分析將大豆耐低磷評價(jià)指標(biāo)歸納為地上部生物量因子、磷因子和根系因子。栗振義等[20]利用綜合評價(jià)體系發(fā)現(xiàn)，與耐低磷性最相關(guān)的指標(biāo)有莖葉干重、株高、根干重和根長，可用于紫花苜蓿耐低磷性的評價(jià)篩選。楊春婷等[21]利用綜合評價(jià)體系研究苦蕎耐低磷性，認(rèn)為根表面積、根長、株高、地上部干重等指標(biāo)可作為苦蕎苗期的耐低磷能力的快速鑒定指標(biāo)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在低磷脅迫生態(tài)環(huán)境中尋找有潛力的個體或群體是收集磷高效種質(zhì)的最有效方法。西南地區(qū)是典型的低磷環(huán)境，2019年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳提出《大豆振興計(jì)劃實(shí)施方案》，將西南地區(qū)列為確保大豆增產(chǎn)的重點(diǎn)區(qū)域。目前，還缺乏西南地區(qū)磷高效大豆品種篩選相關(guān)研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對西南地區(qū)5種不同大豆種質(zhì)材料和北方地區(qū)5種不同大豆種質(zhì)材料的19個指標(biāo)進(jìn)行主成分分析、隸屬函數(shù)分析、聚類分析及灰色關(guān)聯(lián)分析，構(gòu)建耐低磷評價(jià)體系，并篩選出耐低磷性種質(zhì)材料，為西南地區(qū)大豆耐低磷研究以及耐低磷品種的篩選、遺傳改良和品種培育提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試大豆品種包括北方地區(qū)選育且能在貴州省成功繁育的大豆品種：汾豆62號（Fd62）、冀豆12號（JD12）、晉豆 23號（Jd23）、鐵豆 40號（Td40）、鐵豐31號（Tf31）；西南地區(qū)自主選育的大豆品種：矮選（Ax）、黔豆11號（Qd11）、黔豆7號（Qd7）、川豆 14（Cd14）、滇 86-4（Dd86-4）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與植株培養(yǎng)

試驗(yàn)設(shè)正常供磷的對照處理（0.5 mmol·L-1，KH2PO4， NP）和 低 磷 脅 迫 處 理 （0.02 mmol·L-1，KH2PO4，LP），每個品種每個處理設(shè)6次生物學(xué)重復(fù)。挑選大小一致且飽滿的大豆種子，1%次氯酸鈉滅菌，無菌水浸種后，恒溫避光培養(yǎng)。待子葉長出后，將幼苗移至1/2劑量營養(yǎng)液并逐步過渡到全量營養(yǎng)液[22]中培養(yǎng)至三葉展開后進(jìn)行缺素處理，12 d后收獲植株并測定相關(guān)性狀。

1.3 耐低磷指標(biāo)的測定

1.3.1 光合特征參數(shù)的測定 選取倒三葉，于上午9：00-11： 00采用LI-6400 XT型手持式光合儀測定凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）等光合特性參數(shù)。內(nèi)置光源光強(qiáng)設(shè)為 550 μmol·m-2·s-1、CO2濃度為 430 μmol·mol-1，室溫25 ℃。

1.3.2 光合色素含量的測定 采用乙醇浸提法，選取缺素處理12 d的大豆倒三葉，去除中脈后，測定葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。

1.3.3 形態(tài)指標(biāo)及生物量測定 株高用直尺測量；莖粗用游標(biāo)卡尺測量；使用S-120便攜式葉面積掃描儀測定葉面積；以子葉節(jié)為界，將植株分為莖葉和根系，分別稱量根及莖葉鮮重；用根系掃描儀和WinRHIZO軟件測定根長、根系平均直徑、根體積、根表面積、根尖數(shù)。最后105 ℃殺青30 min，并在75 ℃下烘干至恒重，分別稱量莖葉及根干重，并計(jì)算根冠比。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

1.4.1 各指標(biāo)耐低磷系數(shù)（Low phosphorus tolerance coefficients，LPTC）[23]

式中，LPTC1為低磷處理下的指標(biāo)測定值，LPTC2為正常供磷處理下的指標(biāo)測定值。

1.4.2 不同大豆基因型各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值[24]

式中，u(Xj)表示第j個綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，Xj表示第j個綜合指標(biāo)值；Xmax表示第j個綜合指標(biāo)的最大值，Xmin表示第j個綜合指標(biāo)的最小值。

1.4.3 各綜合指標(biāo)的權(quán)重[24]

式中，wj表示第j個綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度及權(quán)重；pj為各品種第j個綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

1.4.4 各大豆品種的綜合耐低磷能力的大小[24]

式中，D表示在低磷脅迫條件下各品種耐低磷能力的綜合評價(jià)值。

1.4.5 灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)及灰色關(guān)聯(lián)度[25]以各指標(biāo)LPTC值（比較序列）和D值（參考序列）計(jì)算各指標(biāo)間的關(guān)聯(lián)系數(shù)ξi(k)及關(guān)聯(lián)度(γi)。

數(shù)據(jù)整理及計(jì)算用WPS 2019表格，因子分析、相關(guān)性分析和主成分分析用SPSS20.0，聚類分析用Origin 2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 各單項(xiàng)指標(biāo)的耐低磷系數(shù)及其相關(guān)性分析

指標(biāo)相對值能夠消除品種間固有差異，較之絕對值更能準(zhǔn)確反映植物耐低磷能力的大小[20]。根據(jù)公式（1）計(jì)算各測定指標(biāo)的相對值，即耐低磷系數(shù)（LPTC）。由表1可知，低磷脅迫促進(jìn)光合產(chǎn)物向大豆的地下部分配，根系干重和根冠比除黔豆11號外，其余品種均呈增加趨勢。不同基因型之間，根系構(gòu)型的變化方向不同：汾豆62號、冀豆12號和晉豆23號主要通過延伸根長并增加根尖數(shù)量來響應(yīng)低磷環(huán)境；以鐵豐31號、滇86-4、鐵豆40號為代表的其余品種則通過擴(kuò)大根系直徑、增加根系與土壤接觸的面積來獲取更多的磷。值得注意的是，在低磷脅迫下，黔豆11號是唯一被檢測到根冠比和根系干重下降的品種，但其根系表面積、根系直徑升高，提示黔豆11號的根系獲取更多的磷是不以消耗更多光合產(chǎn)物為代價(jià)的。

表1 不同基因型大豆苗期各單項(xiàng)指標(biāo)的耐低磷系數(shù)Table 1 Low-phosphorus tolerance coefficients of soybean varieties at seedling stage

對光合特征參數(shù)的分析表明，低磷脅迫降低多數(shù)大豆基因型的光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率，這不利于光合產(chǎn)物的累積，且削弱了養(yǎng)分向地上部的運(yùn)輸。因此低磷脅迫下養(yǎng)分和光合產(chǎn)物的供應(yīng)減弱，而且植株將更多的養(yǎng)分和光合產(chǎn)物分配到地下部，使得地上部株高、莖粗和葉面積降低，最終導(dǎo)致地上部鮮重和干重下降。低磷脅迫總體提高葉綠素含量，但不同基因型之間類胡蘿卜素的變化趨勢不同。

通過地上地下形態(tài)、生物量以及生理生化指標(biāo)間存在的相關(guān)性可表明各指標(biāo)間是否存在依存關(guān)系及相關(guān)關(guān)系的方向與強(qiáng)度[26]。從單項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)矩陣（表2）來看，各指標(biāo)間的相關(guān)性導(dǎo)致信息冗余。如株高與地上部鮮重、地上部干重和根尖數(shù)存在相關(guān)性且差異極顯著，與根體積、根表面積和蒸騰速率存在相關(guān)性且差異顯著；地上部鮮重與地上部干重、根表面積和根體積存在顯著或極顯著相關(guān)；地下部鮮重與根長存在極顯著相關(guān)性；地下部干重與根長存在顯著相關(guān)性，與根冠比極顯著相關(guān)。各單項(xiàng)指標(biāo)在大豆耐低磷中所起的作用不盡相同，表明大豆耐低磷性是一個復(fù)雜的綜合性狀，直接利用各單項(xiàng)指標(biāo)不能準(zhǔn)確、直觀地進(jìn)行大豆耐低磷性評價(jià)。因此，為彌補(bǔ)單項(xiàng)指標(biāo)耐低磷性評價(jià)的不足，需在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用其他多元統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析和評價(jià)。

表2 各單項(xiàng)指標(biāo)耐低磷系數(shù)的相關(guān)系數(shù)矩陣Table 2 Correlation coefficient matrix of low-phosphorus tolerance coefficients on individual indices

2.2 主成分分析

將生理、形態(tài)以及根系等19個指標(biāo)的耐低磷系數(shù)進(jìn)行主成分分析，前5個綜合評價(jià)指標(biāo)CI1～CI5的特征值均大于1，且累積貢獻(xiàn)率達(dá) 91.12%（表3）。因此將19個單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)換為5個新的相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)。第1主成分中，根體積、根平均直徑、根尖數(shù)、根冠比、光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率有較高載荷量；第2主成分中，葉面積及葉綠素含量具有較高載荷；第3主成分中，地下部鮮重、類胡蘿卜素含量具有較高載荷；第 4 主成分中，地上部鮮重、地下部干重和根長具有較高載荷；第5主成分中，地上部干重和根表面積具有較高載荷。

表3 各綜合指標(biāo)主成分的特征向量及貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvectors and contribution rates of principal components of individual comprehensive index

2.3 不同基因型大豆綜合評價(jià)

2.3.1 隸屬函數(shù)分析 根據(jù)公式（2）計(jì)算10個不同大豆基因型5個綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值u(Xj)（表4）。由表4可知：鐵豐31號的隸屬函數(shù)值最大[u(X1)=1]，表明此品種在CI1表現(xiàn)為耐低磷性最強(qiáng)，而晉豆23號隸屬函數(shù)值最小[u(X1)=0]，表明此品種在這一綜合指標(biāo)上表現(xiàn)為耐低磷性最差。

2.3.2 權(quán)重確定 根據(jù)公式（3）計(jì)算各綜合指標(biāo)的權(quán)重。經(jīng)計(jì)算，得到5個綜合指標(biāo)的權(quán)重分別為0.394、0.274、0.156、0.104 和 0.072（表4）。

2.3.3 綜合評價(jià) 根據(jù)公式（4）計(jì)算大豆耐低磷評價(jià)值（D值），并根據(jù) D 值對其耐低磷性進(jìn)行強(qiáng)弱排序（表4）。耐低磷大小排序?yàn)椋鸿F豐31號＞滇86-4＞鐵豆40號＞冀豆12號＞黔豆11號＞黔豆7號＞川豆14＞晉豆23號＞矮選＞汾豆62號。根據(jù)D值大小用最大距離法進(jìn)行聚類分析（圖1），可將10個基因型大豆劃分為3類：鐵豐31號和滇86-4為第Ⅰ類，屬耐低磷型；黔豆11號、鐵豆40號和冀豆12號為第Ⅱ類，屬中度耐低磷型；黔豆7 號、川豆14、晉豆23號、矮選和汾豆62號為第Ⅲ類，屬弱耐低磷型。

表4 各基因型大豆的綜合指標(biāo)值、權(quán)重、u( Xj)值及綜合評價(jià)(D)Table 4 Comprehensive index, index weight, u( Xj), and comprehensive evaluation value (D) of soybean cultivars

2.4 灰色關(guān)聯(lián)分析

本研究通過灰色關(guān)聯(lián)分析法，對各形態(tài)以及生理生化等19個指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)，旨在揭示比較序列（LPTC值）與參考序列（D值）的關(guān)聯(lián)關(guān)系，從而評價(jià)各指標(biāo)在耐低磷特性評定中的作用強(qiáng)弱。各指標(biāo)LPTC值與D值間的關(guān)聯(lián)度大小依次為地上部鮮重＞蒸騰速率＞地上部干重＞氣孔導(dǎo)度＞葉面積＞株高＞莖粗＞根體積＞胞間CO2濃度＞根平均直徑＞類胡蘿卜素含量＞光合速率＞根長＞根尖數(shù)＞根表面積＞葉綠素含量＞地下部鮮重＞地下部干重＞根冠比（表5）。

表5 各指標(biāo)與耐低磷系數(shù)的關(guān)聯(lián)度及位次Table 5 Correlation and rank on low-phosphorus tolerance coefficients of individual indices

3 討論

缺磷限制了43%的陸地生產(chǎn)力[27]。西南地區(qū)土壤全磷和有效磷含量低，供磷能力弱[28]。而苗期根系弱小，極大地限制了磷的獲取，因此苗期是西南地區(qū)大豆需磷的臨界期，也是評價(jià)大豆耐低磷能力的關(guān)鍵期[29-30]。室內(nèi)試驗(yàn)營養(yǎng)液水培法不僅可以消除土壤異質(zhì)性帶來的影響，還能提高試驗(yàn)的重復(fù)性，一般將 0.5 mmol·L-1KH2PO4作為大豆[31-32]正常磷水平。本研究以0.5 mmol·L-1KH2PO4作為大豆的正常供磷水平，以0.02 mmol·L-1的KH2PO4作為低磷脅迫處理來篩選耐低磷大豆。由于KH2PO4是易溶性磷，而且培養(yǎng)過程中持續(xù)通氣增加了溶液的均勻性，因此水培能準(zhǔn)確鑒定大豆對磷的吸收和利用能力。

為了克服土壤供磷不足，植物進(jìn)化出了一系列適應(yīng)機(jī)制來維持磷穩(wěn)態(tài)。其中，改變自身形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高根系吸收磷的能力是主要機(jī)制之一。磷高效基因型主要表現(xiàn)出側(cè)根數(shù)量、根系平均直徑、根體積和根系質(zhì)量呈增加趨勢[33]，但不同磷效率基因型之間存在顯著差異[34]。低磷脅迫會抑制葉片光合作用的暗反應(yīng)，減少光合產(chǎn)物的累積。由于光合產(chǎn)物的合成及向地下部轉(zhuǎn)運(yùn)的效率不同，導(dǎo)致低磷脅迫時(shí)不同基因型地上部生物量表現(xiàn)出極大的差異。低磷脅迫使植物地上部生物量[35]和葉面積[36]等降低；根冠比[37]、根系表面積[38]、總根長[39]等增加；使光合速率、氣孔導(dǎo)度與蒸騰速率等光合指標(biāo)下降[40-41]。本研究結(jié)果表明，低磷脅迫下大多數(shù)大豆品種的株高、莖粗和葉面積降低；地上部干鮮重降低，地下部干鮮重升高；根冠比除黔豆11號外，其余均增加；根長和根表面積也增加；光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率降低等。研究結(jié)果與前人的結(jié)果類似。目前已有相關(guān)文章報(bào)道了大豆耐低磷品種的篩選與評價(jià)[42-44]，但還未有關(guān)于西南地區(qū)耐低磷大豆的評價(jià)體系。本研究先將各指標(biāo)轉(zhuǎn)化為耐低磷系數(shù)，消除遺傳學(xué)差異，之后用主成分分析、隸屬函數(shù)、聚類分析和灰色關(guān)聯(lián)分析等方法綜合篩選耐低磷大豆及指標(biāo)，進(jìn)而建立了能快速篩選西南地區(qū)耐低磷大豆的評價(jià)體系。

性狀指標(biāo)的合理選擇是作物耐低磷性鑒定的關(guān)鍵，但關(guān)于植物耐低磷鑒定的指標(biāo)選擇還沒有統(tǒng)一的定論[45]。目前，地上部干重、株高、莖粗、根長、根冠比、根表面積、根系直徑、葉綠素含量、光合指標(biāo)等都可作為篩選磷高效基因型的指標(biāo)[46-49]。本研究將19個指標(biāo)的耐低磷系數(shù)（比較數(shù)列）和綜合評價(jià)D值（參照數(shù)列）作為一個整體，進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析。結(jié)果顯示，與D值關(guān)系最為密切的指標(biāo)依次為地上部鮮重、蒸騰速率、地上部干重、氣孔導(dǎo)度、葉面積、株高、莖粗和根體積，包含了生物量、形態(tài)指標(biāo)以及生理指標(biāo)。這表明作物低磷耐性體現(xiàn)在外部形態(tài)的建成和內(nèi)部生理生化的變化上。因此在大豆苗期耐低磷性鑒定中，要有針對性地選取與D值密切相關(guān)的指標(biāo)，尤其是像蒸騰速率以及氣孔導(dǎo)度光合參數(shù)指標(biāo)和相關(guān)地上以及根系形態(tài)指標(biāo)，這樣既能使鑒定的結(jié)果具有可靠性也能節(jié)約時(shí)間與成本。

根據(jù)D值進(jìn)行聚類分析將10種不同基因型大豆劃分成3大類：耐低磷型、中間型、弱耐低磷型，其中：鐵豐31號和滇86-4為耐低磷品種，兩個品種的地上部鮮重和干重、葉面積、根表面積和根體積的耐低磷系數(shù)較高，表明鐵豐31號和滇86-4具有很強(qiáng)的磷吸收和利用效率，可作為大豆耐低磷育種及耐低磷機(jī)理研究材料。鐵豆40號、冀豆12號和黔豆11號為中度耐低磷品種，3個品種的地上部干重耐低磷系數(shù)為0.842～0.904，根系表面積為耐低磷系數(shù)0.925～1.16，次于鐵豐31號和滇86-4，是中等耐低磷品種；黔豆7 號、川豆14、晉豆23號、矮選和汾豆62號為弱耐低磷品種，其中晉豆23號的劃分和劉淵等[43]的研究結(jié)果一致，其他幾個品種暫未發(fā)現(xiàn)進(jìn)行耐低磷篩選的相關(guān)研究。劉靈等[50]的研究表明，大豆的耐低磷能力與其生長區(qū)域土壤有效磷顯著相關(guān)，西南地區(qū)土壤嚴(yán)重缺磷，而且由于氣候多變，生物多樣性高，因此西南地區(qū)可能蘊(yùn)藏著大量的磷高效大豆種質(zhì)資源。另一方面，不同基因型耐低磷的策略也存在差異，比如黔豆11號通過提高根系表面積來吸收更多的磷，而增加根系長度是冀豆12號的主要耐低磷策略。在下一步研究中，應(yīng)結(jié)合盆栽試驗(yàn)，鑒定各品種對磷的活化及通過與微生物共生獲取磷的能力，完善大豆耐低磷評價(jià)體系。

4 結(jié)論

低磷脅迫對不同基因型大豆苗期各指標(biāo)均有顯著影響。苗期耐低磷性強(qiáng)的大豆品種有鐵豐31號、滇86-4、黔豆11號、鐵豆40號等，可作為大豆耐低磷育種及耐低磷機(jī)理研究材料。地上部鮮重、蒸騰速率、地上部干重、氣孔導(dǎo)度、葉面積、株高、莖粗和根體積可作為評價(jià)大豆苗期耐低磷性的指標(biāo)。