(上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,上海 200444)

楊書(shū)嫻,胡星

四溴雙酚A(tetrabromobisphenol A,TBBPA)是一種人工合成的多溴化合物,因具有高化學(xué)惰性、高熱穩(wěn)定性和易于合成等特性,常作為阻燃劑被廣泛應(yīng)用于紡織產(chǎn)品、電子產(chǎn)品和塑料制品之中,其生產(chǎn)量一度占到了全部溴代阻燃劑的59%[1].然而,TBBPA一旦被釋放到環(huán)境中,又會(huì)因其具有高親脂性和難分解性而富集在水生生物體、沉積物和土壤之中,成為一種污染環(huán)境的持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants,POPs)[2-3].與此同時(shí),TBBPA已被證實(shí)對(duì)人體具有免疫毒性、細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性[4-5].因此,有效去除環(huán)境中的TBBPA,是降低其污染環(huán)境和危害人體健康風(fēng)險(xiǎn)的首要選擇.微生物技術(shù)因其經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好和效果顯著等特點(diǎn),已成為當(dāng)下TBBPA去除領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).

已有研究發(fā)現(xiàn),能夠降解雙酚A(bisphenol A,BPA)或多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls,PCBs)這類POPs的功能菌株也能轉(zhuǎn)化TBBPA,但這種轉(zhuǎn)化耗時(shí)長(zhǎng)且易導(dǎo)致大量甲基醚-TBBPA的富集,難以達(dá)到有效去除環(huán)境中TBBPA的目的[6-7].迄今已發(fā)現(xiàn)了幾種降解TBBPA的功能菌株,如假單胞菌(Pseudomonassp.)[8]、從毛單胞菌(Comamonassp.)[9]、紅球菌(Rhodococcussp.)[10]、甲基桿菌(Methylobacteriumsp.)[11]和鏈球菌(Streptococcussp.)[12]等.但因受到菌株是好氧降解菌還是厭氧降解菌這一基本特性的影響,這些菌株在降解效率、降解途徑、降解產(chǎn)物等方面存在很大差異.厭氧菌株對(duì)TBBPA的降解途徑主要為脫溴反應(yīng),耗時(shí)長(zhǎng)且易累積BPA之類毒性更高的中間產(chǎn)物[13-14].好氧菌株對(duì)TBBPA的降解更為迅速,且通過(guò)脫溴和β-斷裂兩種方式使降解更為徹底[15].由此可見(jiàn),利用具有降解TBBPA功能的好氧菌株,是高效去除環(huán)境中TBBPA的最佳技術(shù)途徑.例如,好氧菌株蒼白桿菌T(Ochrobactrumsp.T)在35°C、pH=7的條件下,3 d后對(duì)3 mg/L TBBPA有86.7%的降解率[15].另一株假單胞菌fz(Pseudomonassp.fz)可以在外加碳氮源牛肉膏和蛋白胨的條件下,對(duì)10 mg/L TBBPA有80%的降解率[16].

本研究以好氧活性污泥為菌源,以期通過(guò)長(zhǎng)期馴化篩選分離出一株可以在無(wú)其他碳源輔助條件下,仍具有高效降解TBBPA能力的好氧菌株.通過(guò)探究該菌株的基因類別、pH值、初始濃度、溫度以及轉(zhuǎn)速對(duì)降解特性的影響等,進(jìn)一步揭示了該菌株的生理、生化以及降解特性,并初步推斷了其實(shí)際應(yīng)用潛力.

1 材料和方法

1.1 試劑和培養(yǎng)基

TBBPA(CAS No.79-94-7)購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司.其余化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司,其中用于高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀器分析的甲醇為色譜級(jí).

TBBPA母液:將TBBPA用甲醇溶解,制備成質(zhì)量濃度為2 000 mg/L的母液,并置于4°C冰箱中黑暗密封儲(chǔ)存.

無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(MSL):K2HPO43.0 g,KH2PO41.5 g,(NH4)2SO41.0 g,NaCl 1.0 g,MgSO43.2 mg,CaCl20.8 mg,MnSO40.8 mg,FeSO40.8 mg,H2O 1 L,調(diào)節(jié)pH=7.無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基(MSS)需在MSL的基礎(chǔ)上添加15～20 g瓊脂粉.添加了TBBPA的MSL和MSS分別記為MSLT和MSST.

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉浸膏5 g,NaCl 5 g,H2O 1 L,調(diào)節(jié)pH=7.

1.2 菌株的獲得

作為菌源的好氧活性污泥取自上海石洞口污水處理廠.取100 mL含10 mg/L TBBPA的MSLT及10 mL活性污泥置于250 mL錐形瓶中,于30°C、150 r/min的振蕩箱里避光培育.7 d后,移取10 mL培養(yǎng)液至新鮮的含20 mg/L TBBPA的MSLT中,并在相同條件下培養(yǎng)馴化.之后,以每7 d增加10 mg/L TBBPA的速率逐步將MSLT中TBBPA的質(zhì)量濃度增至50 mg/L.

菌株在含50 mg/L TBBPA的MSLT中繼續(xù)馴化3周后,取100μL稀釋了105倍的培養(yǎng)液均勻涂布在含50 mg/L TBBPA的MSST上,并在28°C下避光培養(yǎng)4 d.挑選生長(zhǎng)形態(tài)明顯的單菌落,在上述MSST上反復(fù)純化5次,選出生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)良好的菌落避光保存在4°C的斜面上.最后,將OD600=1.0的菌液接種入含或不含20 mg/L TBBPA的MSLT中,考察菌株的生物量,以確定最終的實(shí)驗(yàn)菌株.

1.3 菌株的鑒定

提取菌株的基因組DNA,并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR),其中16S rDNA的引物為27f(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’).反應(yīng)條件如下:95°C預(yù)變性5 min;95°C變性30 s,55°C退火30 s,72°C延伸1 min,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72°C延伸10 min.所得的菌株基因序列利用NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)以確定種屬,再通過(guò)MEGA 6.0軟件與已知的和相關(guān)的菌株采用鄰位相連(neighbor-joining)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).

1.4 菌株的降解

將菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中,在30°C、150 r/min的條件下培養(yǎng)24 h.培養(yǎng)液經(jīng)6 000 r/min離心6 min,收集菌體并用無(wú)菌水清洗3次,最后配制成菌懸液(OD600=1.0)[17].

菌懸液以10%的量接種于20 mL含20 mg/L TBBPA的MSLT(編號(hào)R1)中,同時(shí)制備不含菌株(無(wú)菌水替代,編號(hào)R2)和添加熱處理菌株(121°C、100 kPa條件下滅活20 min,編號(hào)R3)的實(shí)驗(yàn)組作為對(duì)照,并在30°C、150 r/min條件下培養(yǎng),以期確定菌株對(duì)TBBPA的降解模式.

分別改變單一條件,如TBBPA初始質(zhì)量濃度(0、15、20、30 mg/L)、pH值(5、6、7、8、9)、溫度(25、30、35°C)和轉(zhuǎn)速(0、100、150、200 r/min),進(jìn)行菌株降解TBBPA的實(shí)驗(yàn)(默認(rèn)條件均為20 mg/L TBBPA、pH=7、30°C、150 r/min),研究菌株對(duì)TBBPA的降解特性.

以上每組實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次.

1.5 HPLC分析

在HPLC檢測(cè)前將樣品的pH值統(tǒng)一調(diào)至9,以確保完全溶解殘余TBBPA,從而提高檢測(cè)準(zhǔn)確度[15].溶液離心后所得上清液用0.22μm的濾膜過(guò)濾,之后進(jìn)行HPLC(LC-20A,日本島津公司)檢測(cè).檢測(cè)條件如下:290 nm;C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流動(dòng)相組分比為甲醇∶水=80%∶20%;流速為1 mL/min;柱溫為35°C;進(jìn)樣量為10μL.

1.6 降解率的計(jì)算

菌株對(duì)TBBPA降解率的計(jì)算公式為

式中:C0(mg/L)為初始(t=0)質(zhì)量濃度;Ct(mg/L)為t時(shí)刻的質(zhì)量濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的理化特征

2.1.1 TBBPA降解菌株的獲得

經(jīng)TBBPA為唯一碳源和能源的馴化后,分離純化得到了多株能在含50 mg/L TBBPA的MSST中生長(zhǎng)的菌株,并將其中長(zhǎng)勢(shì)最好的一株菌株命名為W1-2.由圖1可見(jiàn),該菌株在含20 mg/L TBBPA的MSLT中好氧培養(yǎng)5 d后,其溶液濁度(見(jiàn)圖1(d))明顯高于無(wú)TBBPA(見(jiàn)圖1(c))和無(wú)菌株(見(jiàn)圖1(b))的對(duì)照組.這表明W1-2菌株可以利用TBBPA為唯一碳源生長(zhǎng).同時(shí),在MSST平板上菌株為乳白色(見(jiàn)圖1(a)),而在MSLT中則為粉紅色(見(jiàn)圖1(d)).這表明該菌株的外觀會(huì)隨培養(yǎng)條件的不同而發(fā)生色彩上的明顯變化.

圖1 有或無(wú)TBBPA環(huán)境下W1-2菌株的生長(zhǎng)Fig.1 Images of strain W1-2 cultured in the medium with or without TBBPA

2.1.2 W1-2菌株的鑒定

通過(guò)比對(duì)W1-2菌株的16S rDNA序列,選取了比對(duì)結(jié)果近似的菌株序列,以及已知TBBPA降解菌株的序列,構(gòu)建了系統(tǒng)樹(shù)(見(jiàn)圖2).

圖2 W1-2菌株與近似菌株及其他TBBPA降解菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic analysis of strain W1-2 with its related strains and other TBBPAdegrading strains

如圖2所示,W1-2菌株與Pseudomonassp.JM1-3和Pseudomonassp.WAS2有99.3%的相似度,因此,W1-2菌株屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.).同時(shí),革蘭氏染色結(jié)果表明,W1-2是一株革蘭氏陰性菌株.Xie等[18]認(rèn)為在TBBPA污染環(huán)境下,TBBPA只會(huì)抑制土壤中革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng).這一結(jié)論有力地支持了本研究獲得的革蘭氏陰性TBBPA降解菌的可靠性.同時(shí),假單胞菌屬的其他菌株也在環(huán)境修復(fù)過(guò)程中,對(duì)POPs(PCBs[19]、菲[20-21]、2-對(duì)溴硝基苯[22])的生物降解起到重要作用.

雖然已知的具有降解TBBPA功能的好氧菌株fz和NY3,以及厭氧菌株J-F-01和J-F-02也都屬于假單胞菌屬,但它們與W1-2菌株序列的相似度分別為95.8%、95.6%、96.3%和96.0%[12,23-24].通常,當(dāng)16s rDNA序列的相似度低于97.0%時(shí),該菌株可以確定屬于一個(gè)新的種類.基于以上分析,Pseudomonassp.W1-2應(yīng)是一株具有TBBPA降解功能的新型菌株.

2.1.3 W1-2菌株降解TBBPA的模式

本研究以R1和R2兩組實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照,探討了W1-2菌株降解TBBPA的模式,結(jié)果如圖3所示,其中折線數(shù)據(jù)標(biāo)注相同字母的兩個(gè)數(shù)據(jù)不存在顯著差異(p＞0.05);標(biāo)注不同字母的兩個(gè)數(shù)據(jù)存在顯著差異(p＜0.05),下同.可見(jiàn),5 d內(nèi)TBBPA質(zhì)量濃度的變化順序?yàn)镽1＞R3＞R2.由于R2中TBBPA的質(zhì)量濃度基本沒(méi)有變化,表明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各種已知和未知的因素并不會(huì)影響TBBPA的質(zhì)量濃度.

圖3 20 mg/L TBBPA在R1、R2和R3實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)量濃度變化Fig.3 Concentration variations of 20 mg/L TBBPA in the R1,R2 and R3 experiments

R1和R3的對(duì)比結(jié)果表明,在121°C、100 kPa條件下加熱20 min,會(huì)嚴(yán)重破壞W1-2菌株降解酶蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu),導(dǎo)致酶活性喪失,因此R3中TBBPA質(zhì)量濃度的變化顯著小于R1(p＜0.05).在黃孢原毛平革菌降解TBBPA的過(guò)程中,蛋白質(zhì)分析結(jié)果顯示其氧化還原酶、細(xì)胞色素單加氧酶P450等酶也出現(xiàn)了顯著上調(diào)的情況[25].

R2和R3的對(duì)比結(jié)果表明,R3中TBBPA質(zhì)量濃度的變化要大于R2.這是因?yàn)門BBPA具有很高的親脂性,會(huì)被熱處理過(guò)的菌株細(xì)胞少量吸附,使得R3中TBBPA的質(zhì)量濃度有所降低.

綜上可見(jiàn),W1-2菌株主要以酶降解的模式去除TBBPA.

2.2 W1-2菌株的降解特性

為了解W1-2菌株在不同條件下的降解特性,以期尋求更適合未來(lái)實(shí)際應(yīng)用的降解環(huán)境條件,提高降解效率和縮短降解周期,本研究通過(guò)改變單一條件進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn).

2.2.1 轉(zhuǎn)速的影響

由圖4可知,0 r/min條件下W1-2菌株對(duì)TBBPA的降解率顯著低于其他轉(zhuǎn)速條件(p＜0.05).這表明W1-2菌株是一株好氧降解菌,高氧環(huán)境有利于降解的進(jìn)行.不過(guò),本實(shí)驗(yàn)中的降解率并未完全隨轉(zhuǎn)速的增加而增大.這表明當(dāng)轉(zhuǎn)速過(guò)大、剪切力過(guò)高時(shí)反而不利于菌株與TBBPA的結(jié)合,會(huì)使降解率下降,因此150 r/min是最佳降解條件.而在第5天,菌株生物量的多少與降解率的變化基本一致.

由圖4還可知,0 r/min條件下W1-2菌株對(duì)TBBPA的降解率仍有63.9%.這表明W1-2菌株在低氧環(huán)境下仍具有較高的降解能力.

圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)TBBPA降解率和第5天W1-2菌株生物量的影響Fig.4 Effects of rotation speed on TBBPA degradation rate and the biomass on the fifth day of strain W1-2

2.2.2 溫度的影響

由圖5可知,在30和35°C條件下,W1-2菌株的TBBPA降解率及生物量均明顯高于25°C時(shí)(p＜0.05).這表明,30～35°C是W1-2菌株生長(zhǎng)以及降解TBBPA相關(guān)酶活性的最適宜條件.與W1-2菌株相似,Ochrobactrumsp.T菌株降解TBBPA的最佳溫度為35°C[15];其在30和35°C條件下第5天的生物量也顯著高于25°C.這說(shuō)明在適宜的溫度下,菌株的相關(guān)酶活性越強(qiáng),對(duì)TBBPA的降解率和生物量就越高.在溫度的影響下,生物量與降解率之間存在一定的相關(guān)性.

圖5 溫度對(duì)TBBPA降解率和第5天W1-2菌株生物量的影響Fig.5 Effects of incubation temperature on TBBPA degradation rate and the biomass on the fifth day of strain W1-2

2.2.3 初始質(zhì)量濃度的影響

由圖6可知,在無(wú)其他碳源輔助的條件下,W1-2菌株對(duì)初始質(zhì)量濃度為10 mg/L的TBBPA的降解率最高,第5天時(shí)達(dá)到了91.4%.因此,TBBPA的初始質(zhì)量濃度為10 mg/L是W1-2菌株的最佳降解條件.這與大多數(shù)TBBPA降解菌株需要添加除TBBPA以外的其他碳源(如酵母提取物、鼠李糖脂、葡萄糖和甲酸鹽等)來(lái)增強(qiáng)菌株活性,以獲得高降解率有著很大的不同[7,12,26-27].特別是假單胞好氧降解菌Pseudomonassp.fz,其只有在加入輔助碳源的條件下才能生長(zhǎng)和起到降解作用[16].在初始質(zhì)量濃度變化的條件下,生物量與降解率無(wú)相關(guān)性.

圖6 初始質(zhì)量濃度對(duì)TBBPA降解率和第5天W1-2菌株生物量的影響Fig.6 Effects of initial TBBPA concentration on TBBPA degradation rate and the biomass on the fifth day of strain W1-2

由圖6還可知,雖然W1-2菌株對(duì)初始質(zhì)量濃度為30 mg/L的TBBPA的降解率最低,但仍達(dá)到了68.9%.這一結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于已報(bào)道的好氧菌株[11,15].因此,W1-2菌株在耐受高質(zhì)量濃度TBBPA的毒性時(shí),仍具較高的降解能力.

2.2.4 pH值的影響

由圖7可知,pH=5條件下TBBPA的降解率僅為57.2%,顯著低于pH=6條件下的69.6%和pH=7條件下的81.6%,更是遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于pH=8和pH=9條件下近乎100%的降解率(p＜0.05).這表明W1-2菌株在堿性或酸性環(huán)境中,降解率存在巨大差異.該差異是所有影響因素中最大的.由于過(guò)堿環(huán)境不利于生物生長(zhǎng),因此pH=8被認(rèn)為是W1-2菌株的最佳降解條件.

圖7 pH值對(duì)TBBPA降解率和第5天W1-2菌株生物量的影響Fig.7 Effects of pH value on TBBPA degradation rate and the biomass on the fifth day of strain W1-2

究其原因,一種可能的解釋是由TBBPA溶解度的變化導(dǎo)致.當(dāng)pH=7.5時(shí),TBBPA的溶解度接近0%;而當(dāng)pH=8和8.5時(shí),溶解度由24%急劇上升為90%以上(100 mg/mL TBBPA).由此可知,環(huán)境中TBBPA的溶解度越高,會(huì)導(dǎo)致生物利用度升高、降解率增大,同時(shí)也解釋了pH=8和pH=9條件下OD600數(shù)值偏低的原因.因?yàn)榇藭r(shí)溶液的濁度受到了TBBPA溶解度的影響,比中性和酸性環(huán)境更清澈,從而使得OD600的數(shù)值偏低.

另一種可能的解釋是由酶活性的變化導(dǎo)致.W1-2菌株中用于脫溴或氧化斷裂TBBPA的酶更適合在堿性條件下發(fā)揮作用.特別是脫鹵酶,其最適pH值在7.6～8.0之間[28].

綜上所述,pH值、轉(zhuǎn)速、溫度和TBBPA初始質(zhì)量濃度對(duì)W1-2菌株的降解結(jié)果都有影響,其中pH值是影響最大的因素.菌株降解TBBPA的適宜環(huán)境條件為10 mg/L初始質(zhì)量濃度、pH=8、150 r/min、30～35°C.在較寬泛的環(huán)境范圍內(nèi),微氧和高質(zhì)量濃度TBBPA條件下,W1-2菌株也都有著較高的降解能力.

3 結(jié)論

以TBBPA為唯一碳源,從活性污泥中篩選出一株具有TBBPA降解能力的好氧菌株W1-2,并經(jīng)過(guò)研究得到以下結(jié)論.

(1)W1-2菌株屬于假單胞菌屬,主要以酶降解的模式去除TBBPA.

(2)W1-2菌株能以TBBPA為唯一碳源和能源生長(zhǎng),并進(jìn)行好氧降解.在30°C、pH=7和150 r/min下,5 d內(nèi)對(duì)10 mg/L TBBPA的降解率為91.4%.

(3)W1-2菌株的適宜環(huán)境降解條件為10 mg/L TBBPA初始質(zhì)量濃度、pH=8、150 r/min、30～35°C,其中pH值是影響降解率的最大因素.

(4)W1-2菌株是為數(shù)不多的可以在較寬泛的環(huán)境范圍內(nèi),包括微氧和高質(zhì)量濃度TBBPA條件下仍能保持較高降解率的好氧菌株,可應(yīng)用于更廣泛的TBBPA污染環(huán)境修復(fù)工作,減少TBBPA對(duì)環(huán)境和人體健康的危害.