張海峰 韋 植

(1 中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東省廣州市 510080；2 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二三醫(yī)院心胸外科，廣西南寧市 530021)

近年來我國心血管疾病的患病率持續(xù)上升，《中國心血管健康與疾病報告2020》[1]數(shù)據(jù)顯示，2020年我國心血管疾病現(xiàn)患病人數(shù)約3.3億，居各類疾病之首。心血管疾病可造成心肌細胞缺血壞死、壞死區(qū)域瘢痕組織修復(fù)、心肌收縮功能下降、心律失常，最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)心力衰竭而死亡。目前，心肌缺血的主要治療方法有藥物治療、冠狀動脈介入或搭橋手術(shù)、心臟輔助裝置、心房分流、終末期的心臟移植等，前5種方法可在一定程度上延緩心力衰竭的進展，但不能使死亡心肌再生，而目前心臟移植的供體仍嚴重匱乏且費用高，手術(shù)要求和條件高，難以普及。干細胞在特定誘導(dǎo)條件下可定向分化成有收縮功能的心肌細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞，將其移植至缺血壞死的心肌區(qū)域，可通過肌電耦連和旁分泌作用，使心肌收縮增強、血管再生、心肌再生，從而改善心功能，因此干細胞一直是生物醫(yī)學(xué)研究的熱點之一。目前，治療心血管疾病的干細胞主要有誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)、間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)、心臟干細胞(cardiac stem cell，CSC)和胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)。其中，ESC為同種異體干細胞，其主要來源于早期發(fā)育的胚胎，但由于其存在倫理和免疫排斥等問題，限制了其在臨床上的應(yīng)用。本文就iPSC、MSC和CSC在心血管疾病治療方面的優(yōu)點和局限性進行總結(jié)，旨在為干細胞在心血管疾病治療中的應(yīng)用提供參考。

1 iPSC

iPSC是自體成熟體細胞經(jīng)過重編程后獲得的具有自我更新和多能分化能力的一種細胞。2006年，Takahashi等[2]將轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4轉(zhuǎn)染到小鼠的成纖維細胞中，首次獲得了類似ESC的多能干細胞。次年，該團隊對人皮膚成纖維細胞進行重編程，獲得了具有細胞再生及分化能力的細胞，這是首個誘導(dǎo)出的人源iPSC[3]。iPSC來源廣泛，且其不存在倫理和免疫排斥等方面的問題，因此極利于研究及臨床試驗的開展。但因c-Myc這一常見原癌基因的加入和病毒的參與，iPSC在分化過程中有向腫瘤細胞分化的風(fēng)險，且定向分化成心肌細胞的效率也比較低。因此，關(guān)于iPSC的主要研究方向是如何改進重編程技術(shù)，使其在誘導(dǎo)過程中去腫瘤細胞化，提高其向心臟祖細胞分化的純度，以及采用何種培養(yǎng)分化方法提高其分化成心肌細胞的數(shù)量、移植區(qū)的富集。2009年，Yu等[4]通過新的編程方法，去除病毒載體和原癌基因 c-Myc而獲得iPSC，解決了病毒載體和原癌基因 c-Myc導(dǎo)致癌變的難題。目前，制備iPSC的主要方法有細胞核移植、轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)及化學(xué)重編程?；瘜W(xué)重編程具有操作簡便、時空調(diào)控性強、作用可逆、細胞重編程過程高度可控等優(yōu)點。另外，小分子誘導(dǎo)體細胞重編程技術(shù)規(guī)避了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因操作引發(fā)的安全問題，使其應(yīng)用于臨床的可能性大大增加。促進iPSC分化成心肌細胞的方法有擬胚體生成法、與內(nèi)臟內(nèi)胚層樣細胞共培養(yǎng)、2D單層培養(yǎng)法、3D懸浮培養(yǎng)法等。其中3D懸浮培養(yǎng)法能產(chǎn)生大量心肌細胞，且生產(chǎn)成本低、效率相對較高。2014年，一例年齡相關(guān)性黃斑變性患者接受了iPSC衍生細胞移植，移植后第1年，該患者沒有出現(xiàn)畸胎瘤形成等移植后的免疫排斥跡象，且視力得到相應(yīng)改善[5]，該方法的安全性和有效性由此得到了初步認可。動物實驗結(jié)果顯示，把iPSC注入大鼠的缺血心肌區(qū)域，iPSC可分化為血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞和平滑肌細胞，并且可以增加心臟射血分數(shù)、減少纖維化[6-7]。另有研究結(jié)果顯示，通過心肌內(nèi)的微球移植術(shù)將iPSC衍生的心肌細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞整合到豬的缺血心肌內(nèi)，可以提高左室射血分數(shù)，改善心肌代謝及減少梗死面積[8]。移植定向分化的心肌干細胞不僅可與周圍正常心肌細胞建立電生理整合、增加心肌細胞收縮功能，還能分泌血管內(nèi)皮生長因子、血管緊張素-1、血管緊張素-2、成纖維細胞生長因子-2、趨化因子-1、白細胞介素-1β、白細胞介素-10、血小板衍化生長因子、肝細胞生長因子、基質(zhì)細胞衍生因子-1、胰島素樣生長因子-1、胸腺素-β4、Wnt5a和促紅細胞生成素等因子營養(yǎng)心肌，改善心臟的收縮功能[9]。2015 年，Menasché等[10]將人ESC來源的心肌祖細胞移植到晚期缺血性心力衰竭患者的心臟中，結(jié)果未見腫瘤生成，患者的心功能獲得改善。這使得iPSC在心血管疾病治療中的應(yīng)用前景更加廣闊。但不管采用何種編程方法，一次編程所產(chǎn)生的iPSC的效率仍較低，其定向分化成心肌細胞的數(shù)量尚少，且其潛在的致瘤風(fēng)險尚不能完全排除，這限制了iPSC在臨床上的廣泛應(yīng)用。如何攻克這一難點，將是今后重點研究的方向。值得注意的是，2018年日本批準了一項將iPSC衍生的心肌樣細胞用于治療心臟病的臨床試驗[11]，該研究主要觀察iPSC衍生的心肌樣細胞治療心臟病的安全性及其對心功能恢復(fù)情況的影響。這是該細胞首次被批準用于治療心臟病的臨床研究，研究的結(jié)果將會引起全球的廣泛關(guān)注。

2 MSC

MSC是非終末分化細胞的一種，主要存在于骨髓、脂肪組織、臍帶血和胎盤等多種組織中，其主要表達典型標志物如CD146、CD90、CD105、CD73等，具有極強的多向分化潛能和自我更新能力。在體外特定的誘導(dǎo)條件下，MSC可以分化為心肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞等，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后其仍具有多向分化潛能[12]。研究顯示，不論是自體還是同種異源的MSC，一般都不會引起宿主免疫反應(yīng)，因此其應(yīng)用較為廣泛。通過富含多種生長因子培養(yǎng)基的定向誘導(dǎo)，可以使MSC分化成不同類型的心肌細胞用于心臟的修復(fù)[13]。臨床中，用于治療心血管疾病的MSC主要來自骨髓和脂肪組織，取材容易，來源方便。MSC主要通過以下幾種機制治療缺血性心血管疾?。?1)通過MSC刺激心臟細胞的增殖和分化，以及血管的生成。有研究人員在豬的心肌缺血模型中驗證了MSC可以刺激心臟細胞的增殖和分化這一結(jié)論，同時還發(fā)現(xiàn)MSC可以分化成心肌細胞和血管，并且具有調(diào)節(jié)心肌細胞生長發(fā)育的功能[14]。(2)通過分泌生長因子及旁分泌作用促進心臟修復(fù)，減少心肌細胞凋亡。MSC可以促進外泌體和細胞外囊泡以可溶性形式分泌、釋放出多種細胞因子和生長因子。Zhang等[15]將MSC分泌的細胞因子、生長因子與CSC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可增強血管內(nèi)皮細胞的分化能力，促進血管新生，減少纖維化，這提示含有這些細胞因子、生長因子的外泌體是MSC的關(guān)鍵活性成分。此外，通過旁分泌機制也可刺激內(nèi)源性心臟祖細胞釋放血管內(nèi)皮生長因子、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1等因子，使其向心肌缺血區(qū)遷移和增殖，進而分化成心肌細胞，增強心肌功能[16]。有研究表明，MSC可釋放出富含miR-22的外泌體，這些外泌體進入心肌細胞內(nèi)與甲基CpG結(jié)合蛋白2 (Mecp2) 相互作用，可阻止心肌細胞凋亡[17]。(3)免疫調(diào)節(jié)。Krampera等[18]研究發(fā)現(xiàn)MSC能夠抑制梗死心肌細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，減少炎癥細胞與炎癥因子對心肌造成的急性損傷。Luger等[19]發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注時，靜脈輸注MSC能抑制自然殺傷細胞與中性粒細胞的活性，緩解左心室功能減弱和逆轉(zhuǎn)心肌重塑。在動物模型中，將同種異體的骨髓 MSC 注入心肌梗死后的綿羊冠狀動脈內(nèi)，可使其左心室射血分數(shù)增加，并使心肌梗死面積減少約40%[20]。免疫組化分析和心臟核磁成像結(jié)果顯示，在異位心臟移植大鼠術(shù)后48 h靜脈注射骨髓 MSC，治療28 d后可觀察到大鼠移植心臟的心功能增強、心肌纖維化減少、心肌細胞凋亡受到抑制，此外該法還可以促進心室重構(gòu)和新血管生成[21]。多種動物模型實驗都表明MSC治療缺血性心臟病可獲得良好的效果。例如，2004年Chen等[22]將69例發(fā)病12 h內(nèi)的急性ST段抬高型心肌梗死患者隨機分成兩組，予冠狀動脈分別注射自體骨髓MSC和生理鹽水，隨訪6個月顯示干細胞治療組患者的心肌功能較對照組改善。骨髓MSC治療急性心肌梗死的多中心隨機臨床試驗[23]結(jié)果顯示，經(jīng)冠狀動脈移植骨髓MSC治療急性心肌梗死可提高患者的心肌血流灌注和左室射血分數(shù)，且治療的可行性和安全性均較高，未見發(fā)生相關(guān)的室性心律失?；蚱渌饕涣夹呐K事件。為了更大規(guī)模地評估MSC在臨床應(yīng)用中的安全性和有效性，2018年Lalu等[24]對MSC治療心肌缺血的23個臨床研究(包含1 148例患者)進行了一項薈萃分析，結(jié)果顯示，MSC治療急性心肌梗死和缺血性心力衰竭整體上是安全有效的，能改善心臟功能，縮小心肌梗死面積，明顯降低心肌梗死復(fù)發(fā)率和死亡率，雖然部分患者輸注MSC后可引起短暫性發(fā)熱，但無治療相關(guān)的急性毒性反應(yīng)、感染、腫瘤形成，無致死性心律失常發(fā)生。此后大規(guī)模的臨床試驗進一步展開，如NCT01652209、NCT03404063等，截至2021年6月，在美國國立衛(wèi)生研究院的臨床試驗注冊網(wǎng)站(clinicaltrials.gov)上有關(guān)MSC治療缺血性心臟病的臨床項目達到56項，且近幾年來該類研究項目不斷呈現(xiàn)增多的趨勢，顯示出巨大的應(yīng)用潛力和前景。目前，已有用于治療心臟病的MSC產(chǎn)品在美國、韓國、歐盟國家等獲批使用，我國也有多款MSC產(chǎn)品獲準進行臨床試驗研究。

3 CSC

成體心臟曾一度被認為是終末分化器官，心肌梗死后不能再生。2003年，Beltrami等[25]在《Cell》雜志發(fā)表一項研究成果，其認為成體心臟中存在著一群能在體內(nèi)分化為心肌細胞的c-Kit+細胞(即心肌干細胞)，其將c-Kit+細胞分離后在體外進行培養(yǎng)、富集后注射到壞死心肌細胞區(qū)域，20 d后發(fā)現(xiàn)移植c-Kit+細胞分化產(chǎn)生的心肌細胞可以修復(fù)大部分壞死區(qū)域、改善心臟收縮功能，由此認為心臟內(nèi)存在內(nèi)源性干細胞。該研究成果發(fā)布后在學(xué)術(shù)界引起巨大反響，隨后陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)不同表面標志的CSC，包括胚胎抗原-1+CSC、干細胞抗原-1+CSC、胰島素增強子結(jié)合蛋白-1+CSC、側(cè)群細胞、心肌球源性細胞和心肌球細胞、心外膜源性細胞，但各種CSC分布的位置和比例均不相同[26-29]，且動物實驗研究表明CSC具有心肌細胞和血管的結(jié)構(gòu)特性[30]。自體CSC可從心耳、心室、心外膜活檢中獲得，在移植前將CSC進行體外培養(yǎng)、增殖[31]，可得到大量的CSC，足以進行心肌干細胞移植，且其對心肌收縮功能的改善作用顯著，因此，CSC移植治療心肌缺血具有廣闊的應(yīng)用前景。但在2004年，Murry等[32]采用類似的細胞譜系追蹤實驗技術(shù)進行實驗，未發(fā)現(xiàn)骨髓來源的c-Kit+細胞在體內(nèi)可分化為心肌細胞，而只能分化為血細胞。2012年Jesty等[33]采用相同方法并不能重復(fù)Beltrami等[25]關(guān)于c-Kit+心肌干細胞在成年梗死的心肌中可轉(zhuǎn)化為心肌細胞的研究結(jié)果。2014年van Berlo等[34]在《Nature》上發(fā)文質(zhì)疑Beltrami等[25]聲稱的心肌干細胞在治療心肌梗死中的作用，該研究發(fā)現(xiàn)心肌干細胞治療心肌梗死的效果非常有限，其不能在梗死的患者中產(chǎn)生足夠量的心肌細胞。2018年，經(jīng)哈佛大學(xué)等相關(guān)部門調(diào)查后認定[35]，Beltrami等[25]研究者涉嫌捏造數(shù)據(jù)和論文造假，最終其發(fā)表的34篇論文被相關(guān)雜志撤銷，這使得CSC治療心血管疾病的臨床試驗基本停滯。但在一些臨床試驗如SCIPIO試驗[28]、CADUCEUS試驗[29]中發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈內(nèi)注射內(nèi)源性CSC，能提高心肌缺血患者的左室射血分數(shù)，縮小心肌梗死面積和瘢痕組織，增強心臟局部收縮功能，患者的生活質(zhì)量獲得提高。這可能與以下原因有關(guān)：不同表面標志的CSC雖不能分化成心肌細胞，但其旁分泌作用可以促進心臟內(nèi)源性干細胞的遷移、增殖、分化和血管形成，還可以促進內(nèi)源性CSC的募集，抑制梗死區(qū)細胞的凋亡，抗心肌重塑，從而改善心臟功能[36-39]。由于成體心肌細胞中仍存在非常緩慢的細胞分裂能力，在心肌缺血出現(xiàn)后，如何提升其分裂成心肌細胞的能力，代替壞死心肌細胞發(fā)揮作用，改善心功能，或?qū)⑹墙窈笱芯康臒狳c。

4 小結(jié)與展望

心力衰竭是心血管疾病患者死亡的主要原因，干細胞移植不僅能提供新生的心肌細胞，還可通過分泌各種營養(yǎng)心肌的因子來改善心功能，是治療急性心肌梗死、心臟缺血再灌注損傷、缺血性心臟病的理想選擇。由于ESC存在倫理和免疫排斥等問題，導(dǎo)致其在臨床上的應(yīng)用受到限制。而iPSC具有類似ESC的特性，能分化形成大量心肌細胞，但由于其存在誘發(fā)腫瘤的風(fēng)險，因此需要在重編程技術(shù)方面作進一步研究，以達到在移植前將其定向分化為心肌細胞的目的。MSC具有免疫調(diào)節(jié)特性且來源方便，還可以進行同種異體移植，目前其在臨床試驗中的應(yīng)用已經(jīng)取得一定的成果，應(yīng)用前景十分廣闊，但仍面臨移植存活力低、體外培養(yǎng)時間越長移植后細胞的歸巢率越低等問題。內(nèi)源性CSC能否分化為心肌細胞目前未能得到公認，且其療效尚存疑，而成體心肌細胞仍有細胞分裂能力，但其數(shù)量少，分裂效率低下，如何提高其分裂能力或是今后研究的方向之一。在臨床實踐中，干細胞治療的時機、細胞數(shù)量、療程、輸注方式、如何提高靶區(qū)富集等仍是需要解決的問題。不同技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用應(yīng)是今后臨床治療心血管疾病的主要方向，例如通過生物材料為干細胞提供生物性能和結(jié)構(gòu)上的支持，以促進干細胞的定植、生長和分化，從而提高細胞的移植率[40]；將干細胞與ESC來源的外泌體共培養(yǎng)，然后移植到心肌缺血處以促進干細胞存活和增殖，提高其分化成心肌細胞與血管內(nèi)皮細胞的能力，以改善心肌收縮功能[41]。此外，選擇何種給藥方式來避免肺部對干細胞的清除，如何一次取得足夠量的原代細胞以減少干細胞體外培養(yǎng)的時間，讓干細胞更好地保持其干性，從而更好地發(fā)揮其療效也是今后研究的重點，需要進行大量的臨床實踐。