徐房添 賴仲宏 梁安儒

(1 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科,江西省贛州市 341001；2 廣西康久生物科技有限公司,廣西南寧市 530201)

關(guān)節(jié)軟骨損傷是由創(chuàng)傷、肥胖、退行性變等原因?qū)е碌年P(guān)節(jié)軟骨破壞[1]。據(jù)估計(jì)，全球超過25%的成年人有不同程度的關(guān)節(jié)軟骨損傷，但由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏血管、神經(jīng)和淋巴管，自我修復(fù)能力差，增殖活性和再生能力低等原因，關(guān)節(jié)軟骨損傷后自行愈合非常困難，尤其是較大面積的軟骨缺損，最終可能引起骨關(guān)節(jié)炎[2]。近年來，軟骨組織工程的發(fā)展為軟骨組織缺損的治療提供了新的思路。軟骨組織工程主要由三大部分組成：有效的軟骨形成因子、充足的軟骨形成祖細(xì)胞及種子細(xì)胞、良好的生物相容支架[3]。研究顯示，骨髓干細(xì)胞(bone marrow stem cell，BMSC)作為理想的種子細(xì)胞，在不同的誘導(dǎo)條件下可以向成軟骨、成骨和成脂等方向分化，但其存在來源有限、取材困難、產(chǎn)量低、容易引起軟骨骨化和誘導(dǎo)分化不完全等缺點(diǎn)，從而限制了BMSC的應(yīng)用[4-5]。脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cell，ADSC)與BMSC有相似的特性，且其具有組織來源豐富、取材方便、免疫原性低、增殖速度快和具有多向分化潛能等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為軟骨組織工程研究的熱點(diǎn)[6-7]?；贏DSC具有成軟骨分化的特性，其可作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞，為軟骨缺損治療提供新的方案。本文將從ADSC的起源和特點(diǎn)、不同的生長因子及軟骨組織工程支架等誘導(dǎo)ADSC成軟骨分化的作用等方面作一綜述。

1 ADSC的起源和特點(diǎn)

2001年Zuk等[8]從采用抽脂術(shù)提取的脂肪組織中分離獲得一種在不同的誘導(dǎo)條件下可向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等方向分化的細(xì)胞，將其命名為ADSC。研究表明，ADSC可調(diào)控免疫反應(yīng)、傷口愈合、抗凋亡等過程，并能夠減輕多種疾病的炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)機(jī)體的作用[9-10]。與其他類型的干細(xì)胞相比，ADSC在自分泌某些生長因子和免疫調(diào)節(jié)劑方面更活躍，例如，ADSC表達(dá)的血管內(nèi)皮生長因子-D、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和白細(xì)胞介素-8的mRNA水平高于BMSC、毛乳頭細(xì)胞和真皮鞘細(xì)胞等其他間充質(zhì)干細(xì)胞群[11]。因此,ADSC有望成為軟骨組織工程及軟骨修復(fù)最有前途的種子細(xì)胞之一。

2 ADSC成軟骨分化的影響因素

2.1 生長因子 生長因子在ADSC的成軟骨分化中發(fā)揮重要作用，目前常用的生長因子有轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、IGF-1、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)等[12]。

2.1.1 TGF-β TGF-β是一類多功能的多肽類生長因子，具有促進(jìn)ADSC生長、增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等功能。TGF-β與其受體結(jié)合后可使活化素受體激酶-5磷酸化，進(jìn)而激活Smad通路,啟動(dòng)軟骨特異性基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生Ⅱ型膠原及軟骨聚集蛋白聚糖表達(dá)，最終促使ADSC向軟骨細(xì)胞分化[13]。有學(xué)者提出10 ng/mL TGF-β3和10 ng/mL BMP-6是誘導(dǎo)ADSC成軟骨分化的“黃金搭檔”，與單獨(dú)使用TGF-β3相比，其更能有效地增強(qiáng)ADSC的成軟骨分化潛能[14]。而對于TGF-β1和TGF-β3的誘導(dǎo)效能，有學(xué)者認(rèn)為并無明顯差異[15]。Li等[16]通過免疫組化和蛋白質(zhì)印跡法證實(shí)TGF-β3可以誘導(dǎo)ADSC成軟骨分化，刺激軟骨細(xì)胞分化成熟，增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成，使Ⅱ型膠原、軟骨聚集蛋白聚糖和SOX9的表達(dá)顯著增加，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其主要通過激活Wnt5a/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮作用。但目前TGF-β誘導(dǎo)ADSC成軟骨分化的具體分子生物學(xué)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.1.2 BMP BMP是一組結(jié)構(gòu)相似、高度保守的功能蛋白，可以促進(jìn)ADSC向骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化。有研究通過測量發(fā)現(xiàn)BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7和BMP-9在正常軟骨組織中高表達(dá)，提示在損傷的軟骨組織中保持適當(dāng)比例的BMP可維持或恢復(fù)軟骨組織的健康動(dòng)態(tài)平衡[17]。在BMP家族中，BMP-14被認(rèn)為是當(dāng)前誘導(dǎo)ADSC成軟骨分化過程中最強(qiáng)的生長因子之一，在早期軟骨形成以及后續(xù)多個(gè)階段中都發(fā)揮著重要作用。Liu等[18]將BMP-14目的基因轉(zhuǎn)染到ADSC，發(fā)現(xiàn)其能顯著增加Ⅱ型膠原、軟骨蛋白聚糖的表達(dá)，誘導(dǎo)ADSC向軟骨細(xì)胞方向分化。目前，美國食品藥物監(jiān)督管理局批準(zhǔn)將重組人BMP-2和BMP-7用于一些骨科疾病的治療，如開放性骨折、骨不連、脊柱融合和頜面部骨骼增強(qiáng)等[17]。總之，BMP家族在軟骨修復(fù)治療中的應(yīng)用已被廣泛研究，并且取得了一些突破性的進(jìn)展。然而，在將這些研究轉(zhuǎn)化為治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的新療法之前，仍有許多問題需要研究解決。

2.1.3 IGF-1 IGF-1是一組能夠促進(jìn)細(xì)胞生長的多肽類物質(zhì)，被認(rèn)為是誘導(dǎo)軟骨形成、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長代謝最關(guān)鍵的細(xì)胞因子之一。IGF-1可以增強(qiáng)軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原和軟骨蛋白聚糖的表達(dá)，并且能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞SOX9的表達(dá)，形成COL2A1；同時(shí)，其可通過抑制蛋白酶的生成和釋放來減少ACAN的降解[19]。研究發(fā)現(xiàn)IGF-1基因的修飾能明顯促進(jìn)大鼠ADSC向軟骨細(xì)胞分化[20]。

2.1.4 FGF FGF是一組可以促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的重要因子，F(xiàn)GF參與胚胎發(fā)育中細(xì)胞的增殖、分化和遷移等過程。Nasrabadi等[21]研究發(fā)現(xiàn)FGF-2可降低堿性磷酸酶和Ⅹ型膠原的表達(dá)，抑制軟骨細(xì)胞的肥大，并可增加TGF-β1/BMP-2誘導(dǎo)的軟骨標(biāo)志物，促進(jìn)成軟骨分化。然而也有學(xué)者提出，在與生長因子聯(lián)合誘導(dǎo)過程中FGF-2抑制了BMP-6誘導(dǎo)成軟骨分化的能力[22]。目前對FGF-2在誘導(dǎo)軟骨形成方面的作用尚存在爭議，還需進(jìn)一步研究。

2.1.5 擴(kuò)張因子 擴(kuò)張因子是表皮生長因子、FGF-2和TGF-β1的統(tǒng)稱，其可以增強(qiáng)干細(xì)胞的成軟骨分化。研究顯示擴(kuò)張因子促進(jìn)了Ⅱ型膠原的強(qiáng)健表達(dá)，但也增加了Ⅰ型和Ⅹ型膠原的沉積，這與肥大的軟骨細(xì)胞表型一致[23]。

2.2 軟骨組織工程支架 近年來隨著科技的發(fā)展，生物支架材料已成為軟骨組織工程研究的熱點(diǎn)[24]。用于軟骨組織工程的支架材料主要包括天然支架材料、人工支架材料和復(fù)合支架材料。天然可降解高分子有機(jī)材料更接近人體天然組織的結(jié)構(gòu)和成分，具有良好的生物相容性，但機(jī)械強(qiáng)度較差，容易降解。人工合成可降解材料可以高精度制備，其機(jī)械性能、孔隙率、降解速率可控，來源充足；其主要缺點(diǎn)在于缺乏生物活性，細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力較差，降解產(chǎn)物存在一定的毒副作用，免疫原性較強(qiáng)。

Pacelli等[25]研究發(fā)現(xiàn)海藻酸鹽水凝膠有利于維持軟骨細(xì)胞表型和促進(jìn)新軟骨組織生成，通過調(diào)節(jié)海藻酸鹽的濃度，可以有效地提高構(gòu)建體中干細(xì)胞成軟骨分化的效率，維持軟骨的特異性表型，抑制肥大軟骨基因表達(dá)和成骨分化。與此同時(shí)，Cao等[26]通過構(gòu)建關(guān)節(jié)軟骨缺損模型以鑒定羊膜/膠原復(fù)合支架對軟骨修復(fù)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羊膜/膠原復(fù)合支架促進(jìn)了ADSC的增殖和軟骨分化。因此，在軟骨組織工程中復(fù)合支架材料的應(yīng)用可能更有利于ADSC成軟骨分化。

2.3 其他因素 在誘導(dǎo)ADSC成軟骨分化的過程中，還受到諸多因素的影響，如供體的年齡、取材部位、低氧、細(xì)胞代數(shù)等[27-28]。關(guān)于年齡對誘導(dǎo)ADSC成軟骨分化能力的影響目前尚有爭議，大部分學(xué)者認(rèn)為ADSC成軟骨分化能力隨著供體年齡的增加而下降，然而也有部分學(xué)者認(rèn)為年齡對ADSC成軟骨分化能力的影響不大[29]。目前，大多數(shù)研究的首選取材部位是皮下脂肪，如腹部和臀部等，也有取自大網(wǎng)膜，不同部位來源的ADSC成軟骨分化能力也有所差異[30]。在低氧條件下可以誘導(dǎo)細(xì)胞因子穩(wěn)定表達(dá)，從而促進(jìn)軟骨相關(guān)基因表達(dá)，抑制YAP表達(dá)的同時(shí)不影響HIF-1α信號(hào)通路的表達(dá)，但會(huì)抑制由低氧引起的SOX9表達(dá)的上調(diào)。HIF-1α/YAP信號(hào)軸可能在促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化和維持軟骨細(xì)胞的表型中起重要作用[31]。有文獻(xiàn)報(bào)告體外傳代數(shù)在2～5代比較合適，此時(shí)細(xì)胞增殖、分化能力較強(qiáng)[32]。此外，誘導(dǎo)ADSC成軟骨分化的過程中可能還受生物力學(xué)、動(dòng)態(tài)環(huán)境和電磁場刺激等因素的影響[33]。

3 小結(jié)與展望

ADSC作為種子細(xì)胞用于軟骨組織工程修復(fù)相應(yīng)的軟骨缺損已取得初步成功，但目前的研究還處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，無論是體外研究還是體內(nèi)研究仍存在許多問題有待解決。首先，ADSC的分離、提取和純化缺乏標(biāo)準(zhǔn)化流程；其次，生長因子通過何種具體方式調(diào)節(jié)ADSC的作用機(jī)制目前仍不清楚；再者，天然支架和人工合成材料都存在一定的不足，如何將天然支架和人工合成材料結(jié)合起來，取長補(bǔ)短，實(shí)現(xiàn)最優(yōu)組合還有待進(jìn)一步研究。隨著臨床醫(yī)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織工程學(xué)和相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，以及研究者對ADSC研究的不斷深入和相關(guān)問題的不斷解決，ADSC作為優(yōu)良的種子細(xì)胞應(yīng)用于軟骨組織工程修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損可能是一種理想、有效的治療方法。