李艷光，任明明，牛潔婷，唐國杰，孫震，孔繁義，宋翔

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因之一，發(fā)病率也較高，肺癌主要有2個亞型：小細胞肺癌和非小細胞肺癌(NSCLC)，肺腺癌是最普遍的NSCLC類型。盡管近幾十年來，包括免疫療法、放療和手術切除治療在內(nèi)的多種治療手段已使療效大大提高，但肺腺癌的臨床治療效果仍然不滿意，其總體5年生存率<15%[1]。目前肺腺癌的發(fā)病機制尚未完全明確，因此了解肺腺癌的發(fā)病機制并確定NSCLC患者有效療法的潛在機制具有重要意義。脊椎蛋白2 (spondin2, SPON2 )，也稱為Mindin、Dil1或M-Spondin，是一種細胞外基質(zhì)蛋白，已知與整聯(lián)蛋白受體結(jié)合，可調(diào)節(jié)免疫功能[2]。最近研究表明，在包括結(jié)直腸癌、肝細胞癌和胃癌等各種惡性腫瘤中，SPON2表達上調(diào)[3-5]。在結(jié)直腸癌中，SPON2可通過激活整聯(lián)蛋白β1/PYK2軸來促進單核細胞的細胞骨架重塑和細胞遷移，以促進結(jié)直腸癌的惡性進展。在胃癌中Notch信號通路激活通過增加SPON2表達促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。SPON2具有抗腫瘤治療分子靶點的潛力。Yuan等[6]報道SPON2在肺腺癌組織中表達上調(diào)，其高表達與肺腺癌患者不良臨床病理參數(shù)相關，但是 SPON2在肺腺癌中發(fā)揮的具體作用和分子機制尚不清楚。因此，本研究旨在獲得SPON2作為肺腺癌治療的潛在分子靶點提供實驗室依據(jù)，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)研究對象：病理組織：收集2015年1月—2016年12月河北省滄州市中心醫(yī)院胸外科行手術切除的肺腺癌組織及其配對的癌旁組織樣本各86份，用于免疫組織化學法檢測。細胞系：肺腺癌細胞系A549購自美國ATCC細胞庫。(2)試藥、試劑:甲苯及乙醇購自天津風船試劑公司；IHC DAKO試劑盒購自丹麥；DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素和BCA蛋白濃度檢測試劑盒均購自美國Thermo公司；SPON2 siRNA購自上海吉凱基因有限公司；Lip2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；CCK8試劑購自美國sigma公司；細胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天試劑有限公司；PARP蛋白裂解試劑和ECL化學發(fā)光試劑盒購自北京索萊寶試劑公司；Transwell小室購自美國coring公司；PVDF膜購自美國millipore試劑公司； SPON2一抗(IHC： ab215451)、SPON2一抗(westernblotting： ab171955)和GAPDH一抗(ab171955)抗體購自英國Abcam公司。(3)儀器設備：Transwell小室購自美國coring公司；酶標儀(型號 Varioskan LUX)購自美國Thermo公司；加濕培養(yǎng)箱(型號 BIC-100型)購自上海儒一恒溫公司；顯微鏡(型號 DM2700M)購自德國Leica公司；流式細胞儀(型號 FACSVia)購自美國BD公司。本實驗嚴格遵守赫爾辛基宣言及人體臨床組織的使用，經(jīng)醫(yī)院人體實驗機構(gòu)倫理委員會批準(201402104)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 實驗方法 2021年1月—2022年4月于河北省滄州市中心醫(yī)院進行實驗。

1.2.1 細胞培養(yǎng)：采用DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)肺腺癌細胞系A549，并添加10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素100 U/ml，放置在含有5% CO2的37℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞融合度為90%時，采用胰酶消化收集細胞，進行細胞傳代，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 SPON2 siRNA轉(zhuǎn)染細胞：處于對數(shù)期生長的肺腺癌細胞系A549消化后，以2.0×105個細胞鋪至6孔板中，分為si-NC組和si-SPON2組，放置在含有5% CO2的37℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組細胞貼壁更換為無血清培養(yǎng)基待轉(zhuǎn)染，采用 lip2000轉(zhuǎn)染試劑按照說明書分別將5 μg NC siRNA 轉(zhuǎn)染至si-NC組，5 μg SPON2 siRNA轉(zhuǎn)染至si-SPON2組。放置在含有5% CO2的37℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 免疫組織化學法(IHC)檢測SPON2蛋白表達：采用4%聚氧甲基固定待檢測的肺腺癌組織及其配對的癌旁組織樣本1 h，通過乙醇梯度脫水并浸潤石蠟制成5 μm的石蠟切片。石蠟切片經(jīng)烤片1 h后浸入二甲苯中脫蠟30 min，然后經(jīng)乙醇梯度水化20 min。在枸櫞酸鈉抗原修復液中高溫煮沸3 min，冷卻后放置內(nèi)源性過氧化物酶液中孵育30 min封閉非特異性抗原，PBS沖洗3次，每次3 min，后將切片在4℃下與SPON2一抗抗體(1∶100)孵育過夜，PBS沖洗3次，每次3 min，后經(jīng)二抗37℃孵育30 min,然后經(jīng)顯色及蘇木精復染后封片。2位病理學醫(yī)生采用以下標準評估IHC結(jié)果：包括染色強度0分(陰性)，1分(弱陽性)，2分(中度陽性)和3分(強陽性)。染色面積：0分(<5%)，1分(5%～25%)，2分(> 25%～50%)，3分(> 50%～75%)和4分(>75%)。將染色強度得分乘以染色面積得分來計算SPON2蛋白的最終表達評分。染色得分定義如下：得分≥3分為高表達，≤2分為低表達。

1.3.2 CCK8實驗和集落形成實驗檢測A549細胞增殖能力：(1)CCK8實驗：將si-NC組和si-SPON2組A549細胞以每孔2 000個細胞、培養(yǎng)基150 μl鋪至96孔板中，每組設置6個平行復孔。在24、48、72 和 96 h時分別加入 CCK8溶液10 μl，放置在含有5% CO2的37℃加濕培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。震蕩混勻后采用酶標儀測量0、24、48、72、96 h時各孔細胞450 nm處的吸光度值(OD值)。(2)集落形成實驗：將si-NC組和si-SPON2組A549細胞以每孔300個細胞、2 ml鋪至6孔板中，每組設置3個平行復孔，放置在含有5% CO2的37℃加濕培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d更換1次新鮮培養(yǎng)基。肉眼觀察到細胞克隆團后，終止培養(yǎng)，PBS洗3次，無水乙醇固定30 min，并用1%結(jié)晶紫染色10 min,計數(shù)細胞克隆團數(shù)目。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞周期分布率：收集si-NC組和si-SPON2組A549細胞，采用4℃的PBS洗滌2次后，以每管5×105個細胞收集至流式細胞管中，每組設置3個平行復孔。采用緩沖液500 μl重新懸浮細胞后，加入碘化丙啶染色液(PI)25 μl和RNase A 10 μl混勻，常溫避光孵育30 min，流式細胞儀測定細胞周期分布率。

1.3.4 Transwell實驗檢測穿膜細胞數(shù)目：收集si-NC組和si-SPON2組A549細胞，PBS洗滌2次后，以每孔1.0×106個細胞重懸至無血清培養(yǎng)基100 μl中，并均勻加至Transwell小室上室的膜中，再放入含有500 μl完全培養(yǎng)基的Transwell小室下室中，放置在含有5% CO2的37℃加濕培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)12 h后終止培養(yǎng)，擦掉Transwell小室上室中未穿過膜的細胞，PBS將下室面的細胞洗3次后，放入甲醇溶液中15 min以固定細胞，結(jié)晶紫染色15 min。PBS洗3次后，顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)目。

1.3.5 Western-blot檢測蛋白表達：收集si-NC組和si-SPON2組A549細胞，PBS洗滌2次后，加入PARP蛋白裂解液，充分裂解細胞。低溫高速離心，吸取上清液。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測得細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、細胞周期蛋白依賴激酶4(CDK4)、基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP-7)、MMP-9濃度，加入蛋白上樣緩沖液煮沸使蛋白變性。采用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，采用濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上。PVDF與5% 封閉液室溫孵育2 h后，分別與一抗稀釋液4℃孵育過夜、二抗稀釋液室溫孵育1 h。最終采用ECL試劑盒顯示曝光蛋白條帶。

2 結(jié) 果

2.1 肺腺癌組織及其癌旁組織中SPON2表達比較 IHC結(jié)果顯示，肺腺癌組織中SPON2的陽性表達率為59.30%(51/86)，高于癌旁組織中的陽性表達率43.02%(37/86)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.821,P=0.016)，見圖1。

圖1 肺腺癌組織、癌旁組織中SPON2的表達比較(免疫組織化學染色，×200)

2.2 2組肺腺癌細胞SPON2表達比較 qRT-PCR結(jié)果顯示，si-SPON2組細胞中SPON2的表達量為(1.00±0.03)，明顯高于si-NC組的(0.41±0.02) (t=28.343,P<0.001)。

2.3 SPON2對肺腺癌細胞增殖能力的影響 CCK8實驗檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-SPON2組細胞增殖活性在不同時間(24、48、72、96 h)顯著降低(P<0.05)，見表1；集落形成實驗檢測結(jié)果顯示，si-SPON2組肺腺癌細胞的克隆形成數(shù)目為(50.67±8.75)個，低于si-NC組的(117.33±14.09)個，差異有統(tǒng)計學意義 (t=6.961,P<0.001)，見圖2。

表1 si-NC組和si-SPON2組不同時點肺腺癌細胞450 nm OD值比較

圖2 2組肺腺癌細胞的克隆形成數(shù)目比較

2.4 SPON2對肺腺癌細胞周期的影響 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-SPON2組G0/G1期的細胞分布增加(P<0.01)，G2/M期的細胞分布增加(P<0.05)，S期的細胞分布減少(P<0.01)，見表2。

表2 si-NC組和si-SPON2組肺腺癌細胞各個細胞周期細胞比率比較

2.5 抑制SPON2對肺腺癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響 Transwell實驗檢測結(jié)果顯示，si-SPON2組肺腺癌細胞的穿膜數(shù)目為(20.33±4.87)個，少于si-NC組的(58.67±9.63)個，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.154，P=0.002)，見圖3。

圖3 抑制SPON2對肺腺癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響

2.6 抑制SPON2對肺腺癌細胞中細胞周期相關蛋白和轉(zhuǎn)移相關蛋白的影響 Western-blot實驗檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-SPON2組肺腺癌細胞CyclinD1、CDK4、MMP-7、MMP-9表達均減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4、表3。

圖4 抑制SPON2對肺腺癌細胞周期相關蛋白和轉(zhuǎn)移相關蛋白表達的影響

表3 si-NC組和si-SPON2組肺腺癌細胞周期相關蛋白和轉(zhuǎn)移相關蛋白表達比較

2.7 SPON2表達在肺腺癌患者不同臨床病理參數(shù)間比較 在肺腺癌T分期T3～4期、N分期N1～2期、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者中SPON2表達高于T1～2期、 N0期、Ⅰ～Ⅱ期，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在不同性別、年齡患者中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 SPON2在肺腺癌組織中的表達水平與臨床病理參數(shù)之間的關系 [例(%)]

2.8 SPON2表達與肺腺癌患者預后的關系 與低表達SPON2的肺腺癌患者比較，高表達SPON2的肺腺癌患者預后較差，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.877，P=0.027)，見圖5。

圖5 不同SPON2表達的肺腺癌患者預后生存曲線比較

3 討 論

SPON2通過直接與細菌和病毒病原體結(jié)合，引發(fā)先天免疫反應，是一種宿主先天免疫調(diào)節(jié)劑，是編碼細胞外基質(zhì)蛋白的F-Spondin超家族成員[7]。研究表明其表達異常在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用，既往研究報道，在腎透明細胞癌和肝細胞肝癌中SPON2過表達，其中在腎透明細胞癌中SPON2表達與患者分期、組織分級和復發(fā)均顯著相關[8]，在肝細胞肝癌組織中SPON2的高表達與患者腫瘤較大及患者預后較差相關[4]，可作為腎透明細胞癌和肝細胞肝癌預后生物標志物。同時Yuan等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌中SPON2蛋白的過表達與腫瘤分化、陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較高的血清癌胚抗原(CEA)水平和整體存活率不佳相關。本研究結(jié)果顯示，SPON2在肺腺癌組織中的表達顯著高于其配對的癌旁組織，SPON2在T分期、N分期、TNM分期較高及預后較差的肺腺癌組織中表達相對較高，并是肺腺癌患者預后不良的獨立危險因素，與已有的報道具有一致性[6,9]，均提示SPON2可以用作監(jiān)測肺腺癌預后的生物標志物，但對于某個臨床病理特征的不一致，可能是由樣本量及樣本來源的區(qū)域不同而導致的，后續(xù)本研究會繼續(xù)擴大樣本量進行驗證。

SPON2具有驅(qū)動肺腺癌發(fā)生發(fā)展的生物學功能，而不僅僅是顯示患者預后不良的生物標志物。查閱文獻顯示，SPON2在結(jié)直腸癌、胃癌等惡性腫瘤中促進腫瘤的進展，其中在胃癌中SPON2與Cyclin D1的啟動子區(qū)結(jié)合，促進其轉(zhuǎn)錄水平增加，促進胃癌細胞的增殖[3，9]。結(jié)合Yuan等[6]的研究及本研究結(jié)果，SPON2在T分期和TNM分期晚期的肺腺癌患者中表達升高，提示SPON2可能促進肺腺癌細胞的增殖。本研究CCK8實驗和集落形成實驗結(jié)果均顯示，抑制SPON2的表達可抑制肺腺癌細胞的增殖能力。在正常生理過程中，細胞周期具有嚴密的調(diào)控機制，當細胞周期調(diào)控失調(diào)時，細胞增殖能力增加，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制之一[10-12]。本研究結(jié)果顯示，抑制SPON2的表達后，肺腺癌細胞周期阻滯在G0/G1期，表明SPON2促進肺腺癌的周期進展進而促進細胞增殖。細胞周期相關蛋白Cyclin D1、CDK4是調(diào)控G0/G1期轉(zhuǎn)換的關鍵蛋白，CDK4與Cyclin D1結(jié)合形成復合物，并表現(xiàn)出激酶活性，促進下游蛋白磷酸化，驅(qū)動細胞周期進展[13-15]。本研究抑制SPON2的表達后，肺腺癌細胞中Cyclin D1和CDK4蛋白表達降低，表明SPON2通過增加Cyclin D1和CDK4 蛋白的表達促進細胞周期的進展，導致細胞增殖能力增加。與徐正磊等[9]報道的SPON2促進胃癌細胞中Cyclin D1的表達一致，但是本研究未對SPON2和cyclinD1直接結(jié)合進行相關研究。

研究發(fā)現(xiàn)，SPON2對于募集淋巴細胞和引發(fā)免疫反應至關重要，尤其是在腫瘤相關的巨噬細胞(TAM)浸潤中。TAM是腫瘤與免疫微環(huán)境之間復雜相互作用的關鍵調(diào)節(jié)劑，包括腫瘤的遷移調(diào)控[16]，提示SPON2與腫瘤遷移相關。新近研究表明，SPON2在細胞遷移和腫瘤進展中具有復雜的作用，在肝細胞癌(HCC)的腫瘤微環(huán)境中，SPON2-α4β1整合素信號傳導激活增加F-肌動蛋白的重組并促進M1樣表型巨噬細胞的浸潤，而SPON2-α5β1整合素信號傳導失活并防止F-肌動蛋白組裝，抑制HCC細胞遷移能力，研究結(jié)果表明，在肝細胞癌中SPON2充當抑癌因子，并利用不同的信號通路在肝細胞肝癌的微環(huán)境中執(zhí)行雙重功能[4]。但是在結(jié)直腸癌中SPON2通過促進M2樣表型巨噬細胞的浸潤，以促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。此外SPON2可促進胃癌和腎透明細胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力[3]。而在本研究中干擾SPON2的表達，肺腺癌細胞的轉(zhuǎn)移能力顯著降低，與在結(jié)直腸癌和胃癌中的報道一致，也與肺腺癌N分期較高的患者癌組織中SPON2表達較高一致。細胞外基質(zhì)的降解是細胞入侵和轉(zhuǎn)移開始的信號，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是參與細胞外基質(zhì)降解和轉(zhuǎn)移的重要分子[17]，在胃癌組織中SPON2與MMP-9表達呈正比[18]，本研究結(jié)果顯示抑制SPON2的表達，肺腺癌細胞中MMP-7、MMP-9蛋白表達降低，提示SPON2通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-7、MMP-9蛋白促進肺腺癌細胞轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，SPON2在肺腺癌組織中表達升高，與肺腺癌患者不良病理參數(shù)和預后相關，SPON2通過調(diào)控細胞周期相關蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶促進肺腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力。SPON2具有作為肺腺癌患者預后不良生物標志物和分子靶點的重要意義。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

李艷光：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫;任明明：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;牛潔婷：進行統(tǒng)計學分析;唐國杰：課題設計，論文審核；孫震：實施研究過程，分析試驗數(shù)據(jù)；孔繁義:資料搜集整理，論文修改；宋翔：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)