李喆 呂建瑞 周華成

肺移植是治療終末期肺部疾病的公認(rèn)方法。在肺移植中，缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury , IRI)是限制肺移植成功的重要因素[1]，因此預(yù)防和治療肺IRI在臨床上都很重要。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是肺IRI的主要機(jī)制[2]。氫氣具有抗炎癥和抗氧化應(yīng)激的作用，并且和氫氣的濃度有關(guān)[3]。既往研究報(bào)道低濃度氫氣的肺損傷保護(hù)作用[4]，但是高濃度氫氣是否能更好的發(fā)揮肺損傷保護(hù)作用，尚未有研究。本研究將進(jìn)一步探究高濃度氫氣對(duì)大鼠肺IRI的影響及作用機(jī)制。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)SD雄性大鼠，體重220～260 g，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 SD大鼠隨機(jī)分成3組(n=10)：假手術(shù)組(Sham 組)、缺血再灌注組(I/R 組)和氫氣組(H2組)。

二、實(shí)驗(yàn)方案

大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉60mg/kg，氣管切開(kāi)后，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)(683型，Harvard公司，美國(guó))行機(jī)械通氣，潮氣量10mL/kg，呼吸頻率60次/分。左胸部去毛消毒，逐層分離暴露左側(cè)肺門(mén)。尾靜脈注射肝素鈉200U/kg, 5 min后用血管鉗于呼氣末夾閉左側(cè)肺門(mén)行左肺缺血30min，然后移除血管鉗，行再灌注1h。Sham組只開(kāi)胸，不建立缺血再灌注模型；I/R 組建立缺血再灌注模型，不吸入H2；H2組建立缺血再灌注模型，并且在再灌注期間吸入67%H2。使用Nano bubble 純水氫氣發(fā)生器(上海納諾巴伯納米科技有限公司)產(chǎn)生純度為99%的氫氣。將氫氣和空氣混合后通入密閉箱，在出氣口用氫氣檢測(cè)儀(JK40-H2-P，深圳吉順安科技有限公司)通過(guò)通氣管路調(diào)定氫氣的濃度。

再灌注1h后處死大鼠，取左肺下葉，按重量體積比1 ∶10加入生理鹽水，在4℃進(jìn)行組織勻漿，4℃ 12000g離心5min，取上清液作為待測(cè)樣品。采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定上清液中SOD的活性(南京建成生物工程研究所，中國(guó))，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定上清液中MDA的濃度(南京建成生物工程研究所，中國(guó))；采用ELISA法檢測(cè)上清液中IL-6、TNF-α的水平(碧云天生物技術(shù)，中國(guó))。提取組織蛋白，采用BCA測(cè)定組織蛋白濃度(碧云天生物技術(shù)，中國(guó))，通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉。采用兔抗cleaved-caspase-3(1 ∶5000; Abcam)、兔抗cleaved-caspase-9(1 ∶5000; Abcam)和兔抗β-actin(1 ∶3000; Abcam)的一抗4℃孵育過(guò)夜，用TBST洗膜，孵育二抗，通過(guò)凝膠成像分析儀，將PVDF膜上的目的蛋白顯像，拍照，通過(guò)Image J 軟件計(jì)算其光密度值，并分析目的蛋白/β-actin的比值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

與Sham組比較，I/R 組和H2組上清液IL-6、TNF-α和MDA水平升高，SOD活性降低(P<0. 05); 與I/R 組比較，H2組上清液IL-6、TNF-α和MDA水平降低，SOD活性升高(P<0. 05)(見(jiàn)表1)。

表1 三組大鼠炎癥指標(biāo)和氧化指標(biāo)的比較

與Sham組比較，I/R 組和H2組 cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9的蛋白表達(dá)明顯升高(P<0. 05); 與I/R 組比較，H2組cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9的蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)(見(jiàn)圖1～2)。

討 論

肺臟IRI是限制肺移植成功的重要因素，肺臟缺血再灌注產(chǎn)生大量活性氧自由基，進(jìn)而誘發(fā)急性炎癥反應(yīng)，以及局部浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞釋放大量TNF-α及IL-6等炎癥因子，直接或間接造成肺組織炎癥反應(yīng)?；钚匝踝杂苫哂袕?qiáng)烈的氧化作用，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)，造成肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)[5]。同時(shí)，大量產(chǎn)生的活性氧自由基損傷線粒體內(nèi)膜，細(xì)胞色素C被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活下游的凋亡蛋白caspase-3和caspase-9，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。既往研究提示肺臟IRI主要與炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡有關(guān)[7-10]。本研究參照文獻(xiàn)的方法制備肺缺血再灌注模型[11]。結(jié)果表明，I/R 組細(xì)胞凋亡明顯升高，IL-6、TNF-α和MDA水平升高，SOD活性降低，進(jìn)一步證實(shí)了肺臟IRI與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激密切相關(guān)。因此，有效抑制肺臟缺血再灌注過(guò)程中的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是減輕肺臟IRI的重要途徑。

圖1 三組大鼠cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平的比較

圖2 三組大鼠cleaved-caspase-9蛋白表達(dá)水平的比較

既往研究發(fā)現(xiàn)H2在2%～4%濃度范圍內(nèi)是一種安全和有效的治療氣體，H2對(duì)肺損傷具有抗氧化、抗炎癥等效應(yīng)，但多局限于低濃度(<4%)-[12]。最近有研究發(fā)現(xiàn)吸入高濃度(67%)H2能夠緩解哮喘小鼠氣道的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷[13]，并且發(fā)現(xiàn)氫氣的保護(hù)作用可能和濃度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，高濃度氫氣(67%)明顯減少了IL-6、TNF-α和MDA的表達(dá)，增加了SOD的活性，明顯減輕了肺臟IRI的細(xì)胞凋亡。提示高濃度氫氣對(duì)肺臟IRI有保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

本研究有一定的局限性：(1)本次實(shí)驗(yàn)只檢測(cè)了再灌注后1h的結(jié)果，時(shí)間比較局限，下一步將延長(zhǎng)再灌注后的時(shí)間以及增加檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)；(2)本次實(shí)驗(yàn)氫氣濃度范圍比較局限，不同濃度的氫氣效果對(duì)比需要進(jìn)一步研究，以確定最適宜的氫氣治療濃度。

綜上所述，高濃度氫氣能夠緩解大鼠肺缺血再灌注的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而減輕大鼠肺缺血再灌注損傷。