馬開樹 劉成坤 屈開新 張威 付林 趙卉

社區(qū)獲得性肺炎(Community-acquired pneumonia, CAP)是指人體處于醫(yī)院之外、社區(qū)環(huán)境中受到細菌、真菌、病毒或混合感染所發(fā)生的肺炎，是威脅人類健康的常見感染性疾病之一。流行病學(xué)研究表明，全球CAP患者死亡率占住院患者的4%～14%[1-2]。肺炎發(fā)展至重癥肺炎時，除了引起呼吸系統(tǒng)的異常反應(yīng)外，還損傷機體的其他系統(tǒng)，最終可能誘發(fā)急性呼吸窘迫綜合癥、膿毒癥以及多器官損傷等[3]。目前，CAP已經(jīng)成為發(fā)展中國家感染性疾病的最主要的死亡原因[3]。雖然病原學(xué)和影像學(xué)診斷已經(jīng)取得了巨大發(fā)展，各種抗感染治療也降低了CAP患者的ICU入住率，但是CAP患者死亡率一直居高不下。此外，臨床醫(yī)生根據(jù)經(jīng)驗診斷CAP的病情容易出現(xiàn)偏差，各種肺炎評分比較復(fù)雜、常涉及多個指標的聯(lián)合應(yīng)用，這些客觀條件增加了CAP的病情診斷和治療難度[4]。因此，尋找一種新的、快速的診斷方法或生物標志物對于提高CAP的診治是非常迫切的。

警報素 S100A8和S100A9是S100家族中比較重要的兩個單體蛋白，生理情況下結(jié)合形成異源二聚體S100A8/A9進而發(fā)揮生物學(xué)功能。S100A8/A9作為鈣離子感受器，在中性粒細胞和單核細胞中豐富表達，S100A8/A9常與TLR4以及RAGE等細胞表面受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能[5]。血清S100A8/A9在很多炎癥性疾病中高表達，如慢性阻塞性肺疾病、風濕性關(guān)節(jié)炎、青少年皮肌炎以及炎癥性腸病[6-8]。但是S100A8/A9是否參與CAP的發(fā)生、發(fā)展目前并不清楚。本研究擬通過一項回顧性的隊列研究分析血清S100A8/A9水平與CAP患者的嚴重程度和預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)，闡述S100A8/A9在CAP疾病進展中的作用。

資料與方法

一、 研究對象

選擇2018年11月至2021年3月就診于阜南縣人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科的CAP患者作為研究對象。所有CAP患者診斷參照《中國成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南(2016年版)》[9]，且所有參與者均簽署書面知情同意。排除標準：年齡小于18周歲者；孕婦；嚴重的免疫功能低下患者；合并有惡性的肺部腫瘤或肺結(jié)核；精神障礙、依從性較差的患者；住院之前在其他醫(yī)院已進行抗生素治療或其他干預(yù)。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標準，并由阜南縣人民醫(yī)院倫理委員會進行認證(FNLL20180012)。

二、 資料收集

收集所有受試者人口學(xué)信息，主要包括性別、年齡、BMI、是否合并基礎(chǔ)疾病；收集臨床檢查資料，主要包括血壓、血常規(guī)指標、肝功能、腎功能、致病源以及炎癥因子等；CAP嚴重程度按照CAP嚴重性評分(CRB-65、CURB-65、PSI、SMART-COP和CURXO)進行評估。

三、 生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)

利用ELISA的方法檢測血清S100A8/A9(CSB-E12149h)的水平，該試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供。檢測前試劑盒室溫下平衡30 min。根據(jù)已知標準品濃度建立標準曲線。在預(yù)先包被抗體的測試孔中，加入標準品或血清，37℃孵育2 h，震蕩洗板后加入辣根過氧化物酶標記的抗體37℃孵育1 h，然后繼續(xù)加入終止液反應(yīng)15 min，輕輕混勻，使用酶標儀檢測吸光度值。根據(jù)已知標準品的濃度和相應(yīng)吸光度值，繪制標準曲線方程，計算血清S100A8/A9水平。

四、 統(tǒng)計分析

結(jié) 果

一、 人口學(xué)信息和臨床特征

111名CAP患者被納入該研究，根據(jù)CAP患者血清S100A8/A9三分位數(shù)水平將所有CAP患者分為三組，分別為低S100A8/A9水平組(低<45.5 pg/mL)、中S100A8/A9組(45.5～110.5 pg/mL)和高S100A8/A9水平組(>110.5 pg/mL)。人口學(xué)信息和臨床特征(表1)所示，性別、體重指數(shù)、血壓和肝功能指標在三組人群間無差異。年齡、白細胞、中性粒細胞、肌酐、尿素氮、尿酸和IL-6隨著血清S100A8/A9濃度升高逐漸升高；相反，淋巴細胞數(shù)隨著CAP患者血清S100A8/A9升高而逐漸減低。此外，基礎(chǔ)疾病在三組CAP患者中無明顯差異。

表1 人口學(xué)特征和臨床信息

二、 CAP患者和對照人群，入院血清S100A8/A9的水平

根據(jù)CAP嚴重程度評分，將CAP分成不同的等級，比較不同程度CAP患者入院時血清S100A8/A9水平的差異。結(jié)果(圖1A)所示，根據(jù)CURXO評分將CAP患者分成輕度和重度人群，發(fā)現(xiàn)重度CAP患者血清S100A8/A9水平高于輕度患者。依據(jù)CURB-65評分，將CAP患者分成三個等級，發(fā)現(xiàn)評分為3～5的CAP患者血清S100A8/A9水平高于其他等級CAP患者(圖1B)。此外，參照CRB-65評分，評分≥3的CAP患者血清S100A8/A9水平最高(圖1C)。根據(jù)PSI評分將CAP患者分成四個等級，91～130分以及大于130分的CAP患者S100A8/A9水平顯著高于評分低于90分的患者(圖1D)。進一步根據(jù)SMART-COP評分分析CAP患者S100A8/A9水平，發(fā)現(xiàn)血清S100A8/A9水平隨著SMART-COP評分升高而逐漸升高(圖1E)。

圖1 CAP患者和對照人群血清S100A8/A9水平

三、 不同預(yù)后結(jié)局CAP患者入院時血清S100A8/A9水平

根據(jù)CAP患者的住院時間，將CAP患者分成三組，分別為<9天組，9～16天組以及>16天組。比較不同住院時間CAP患者血清S100A8/A9水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著住院時間的延長，CAP患者血清S100A8/A9水平是逐漸升高的(圖2A)。CAP患者在入院以后，其中有11(9.91%)名CAP患者死亡，死亡CAP患者在入院時血清S100A8/A9 (223.56±36.56 pg/mL)水平，顯著高于存活患者血清S100A8/A9 (103.32±19.36 pg/mL)水平(圖2B)。

圖2 不同預(yù)后結(jié)局CAP患者入院血清S100A8/A9水平

四、入院血清S100A8/A9升高與CAP預(yù)后結(jié)局之間的關(guān)聯(lián)

進一步分析CAP患者入院時血清S100A8/A9水平與死亡風險之間的關(guān)聯(lián)，單因素Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)血清S100A8/A9升高增加了死亡風險(OR=1.235, 95% CI：1.042～1.687;P<0.001) (表2)；調(diào)整了年齡和性別，控制相關(guān)混雜因素后的多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)死亡風險與血清S100A8/A9水平依舊呈顯著正相關(guān)(OR=1.315, 95% CI：1.115～1.879；P=0.038) (表2)。接下來繼續(xù)分析了住院時間與血清S100A8/A9水平的之間的關(guān)聯(lián)強度，盡管血清S100A8/A9水平與9～16天的住院時間之間無關(guān)聯(lián)，但是單因素和多因素回歸分析均發(fā)現(xiàn)CAP患者入院時血清S100A8/A9水平升高與>16天的住院時間呈顯著正相關(guān)(OR=3.215, 95% CI：1.554～4.925，P=0.011；OR=2.354, 95% CI：1.225～6.897，P=0.023)(表2)。

表2 S100A8/A9 水平與 CAP患者預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)

五、血清S100A8/A9升高的危險因素

CAP患者血清S100A8/A9水平在入院時是顯著升高的，為了分析血清S100A8/A9升高的危險因素，首先采用了單因素Logistic回歸分析，結(jié)果表明年齡、體重指數(shù)，以及合并高血壓、糖尿病以及心血管疾病均是血清S100A8/A9升高的危險因素(表3)。多因素Logistic回歸分析表明年齡、合并高血壓是CAP患者入院時血清S100A8/A9升高的危險因素(表3)。

表3 CAP患者血清S100A8/A9升高的危險因素

六、 血清S100A8/A9對CAP嚴重程度和死亡風險的預(yù)測效能

血清S100A8/A9對于CAP嚴重程度的預(yù)測性能通過受試者工作曲線(ROC曲線)被分析，結(jié)果如(圖3A)所示，血清S100A8/A9，CURB-65，CRB-65，PSI，SMART-COP，CURXO以及CAP評分聯(lián)合血清S100A8/A9(S100A8/A9+CURB65，S100A8/A9+CRB-65，S100A8/A9+PSI，S100A8/A9+SMART-COP，S100A8/A9+CURXO)對重癥CAP患者的預(yù)測性能曲線下面積(AUC)分別為0.821，0.856，0.885，0.920，0.942，0.856，0.945，0.929，0.959，0.986，0.928。血清S100A8/A9水平在截斷值169.56 pg/mL以上可能為重癥CAP，血清S100A8/A9對重癥CAP預(yù)測性能的靈敏度和特異度分別為76.8%和83.9%。血清S100A8/A9對于CAP患者的死亡風險被預(yù)測，結(jié)果如(圖3B、表4)所示，血清S100A8/A9，CURB-65，CRB-65，PSI，SMART-COP，CURXO，S100A8/A9+CURB65，S100A8/A9+CRB-65，S100A8/A9+PSI，S100A8/A9+SMART-COP和S100A8/A9+CURXO對CAP患者死亡風險預(yù)測能力分別為0.854，0.657，0.641，0.587，0.674，0.678，0.795，0.835，0.898，0.869和0.868。血清S100A8/A9濃度在截斷值232.68 pg/mL以上可能增加CAP患者的死亡風險，血清S100A8/A9對死亡風險預(yù)測效能的靈敏度和特異度分別為83.5%和86.9%。

圖3 血清S100A8/A9水平對CAP的預(yù)測效能

表4 不同指標對于CAP患者嚴重程度以及死亡風險的預(yù)測性能

討 論

CAP是臨床上常見的呼吸道疾病，是導(dǎo)致住院患者死亡的主要原因之一。受諸多因素的影響，CAP的發(fā)生率呈逐漸升高的趨勢，已經(jīng)成為威脅我國民眾健康和生命安全的重要公共衛(wèi)生問題。由于CAP發(fā)病早期，常會表現(xiàn)出咳嗽、發(fā)熱、呼吸困難等癥狀，還伴有腹瀉、心悸等肺外癥狀，發(fā)病特征不明顯，容易引起臨床診斷的誤差，因此對CAP患者進行及時而有效的診斷是非常有必要的。

既往研究發(fā)現(xiàn)，血清S100A8/A9在很多炎癥性疾病中高表達，如慢性阻塞性肺疾病、風濕性關(guān)節(jié)炎、青少年皮肌炎以及炎癥性腸病[6-8]。S100A8/A9在急性肺損傷中發(fā)揮著重要的作用[10]；L.sigmodontis感染誘發(fā)小鼠血清S100A8/A9升高[11]。因此，我們有理由推測S100A8/A9可能參與了CAP進程，但是缺少相關(guān)的臨床流行病學(xué)和實驗室研究證據(jù)。于是，我們檢測了不同嚴重程度CAP患者血清S100A8/A9水平，結(jié)果提示隨著CAP患者嚴重程度的加深，血清S100A8/A9水平也是逐漸升高的；回歸分析發(fā)現(xiàn)S100A8/A9與CAP患者嚴重程度評分呈正相關(guān)。以上結(jié)果提示，S100A8/A9可能參與了CAP的發(fā)生及發(fā)展進程。

本課題也比較了不同住院時間CAP患者血清S100A8/A9水平，結(jié)果表明入院時血清S100A8/A9升高的CAP患者住院時間明顯延長；同時也發(fā)現(xiàn)死亡患者在入院時血清S100A8/A9水平高于存活患者。于是我們進行了Logistic回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)入院時血清S100A8/A9的升高，延長了CAP患者住院時間和增加了死亡風險。此外，ROC曲線下面積分析發(fā)現(xiàn)盡管單獨的血清S100A8/A9水平與CAP嚴重程度評分對于CAP患者嚴重程度以及死亡風險的預(yù)測性能無明顯差異，但是血清S100A8/A9水平聯(lián)合CAP嚴重程度評分顯著增加了單獨的血清或CAP嚴重程度評分的預(yù)測性能。以上結(jié)果表明，入院時血清S100A8/A9升高，增加了CAP患者的不良預(yù)后風險。

臨床流行病學(xué)研究表明，高齡和合并基礎(chǔ)疾病均加重了CAP患者的嚴重程度[12]。因此，在本課題中人口學(xué)因素對于CAP患者血清S100A8/A9升高的影響被分析。單因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)年齡、體重指數(shù)、收縮壓和舒張壓的升高，以及合并高血壓、糖尿病和心血管疾病均是CAP患者血清S100A8/A9升高的危險因素。進一步的多因素Logistic回歸分析表明年齡增加以及合并高血壓是CAP患者入院時血清S100A8/A9升高的獨立危險因素，也是CAP患者不良預(yù)后的危險因素。

警報素 S100A8和S100A9在骨髓細胞中豐富表達，在中性粒細胞和單核細胞中合成和分泌，S100A8和S100A9通常形成異源二聚體S100A8/A9進而發(fā)揮生物學(xué)功能[13]。S100A8/A9作為鈣離子感受器，S100A8/A9可與TLR4以及RAGE等細胞表面受體相結(jié)合，S100A8/A9與受體結(jié)合以后，可激活NF-κB和AP-1信號促進其核轉(zhuǎn)位，激活的NF-κB和AP-1信號可進一步發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，促進下游炎癥因子的合成與分泌[14-15]。因此我們推測，肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致肺泡上皮細胞損傷，誘發(fā)S100A8/A9的釋放，S100A8/A9的分泌通過與其受體的結(jié)合進而激活炎癥信號通路引起炎癥因子釋放，炎癥因子釋放將進一步促進S100A8/A9的分泌，形成一個正反饋環(huán)路，不斷誘發(fā)S100A8/A9的分泌和促進CAP的發(fā)生和發(fā)展。

綜上，血清S100A8/A9與CAP患者嚴重程度以及不良預(yù)后呈正相關(guān)，入院時血清S100A8/A9越高，CAP患者住院時間和死亡風險也顯著升高。此外，年齡增加和合并高血壓是CAP患者入院時血清S100A8/A9升高的危險因素。因此，血清S100A8/A9可能在將來被用作CAP患者嚴重性和預(yù)后的一個早期診斷分子標志物。