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        姜中姜辣素和黃酮的提取及抗氧化性研究*

        2022-12-01 13:08:26陳艷艷王福梅
        廣州化工 2022年20期
        關(guān)鍵詞:姜辣素抗氧化性清除率

        盧 敏,黃 艷,陳艷艷,王福梅

        (河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,河南 平頂山 467000)

        姜主要種植在我國中部、東南和西南部,是藥中佳品,主要用于治療風(fēng)寒感冒、嘔吐、痰飲等,具有抗菌消炎、抗氧化、降血糖血脂[1-2]等功能。姜中含有糖類、蛋白質(zhì)、脂類、維生素和多種微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)[3-4],還含有許多藥理活性物質(zhì),如姜辣素、黃酮、揮發(fā)油、多糖等[5]。姜辣素具有多重生理功效,其中抗氧化能力最強(qiáng)[6]。黃酮是一種天然抗氧化劑,可以清除人身體里面游離的氧自由基,減緩細(xì)胞的衰亡。黃酮及姜辣素是生姜具有抗氧化活性的主要原因[7-8]。生姜對多種腫瘤細(xì)胞的活性均有較好抑制作用[9]。生姜中的6-姜烯酚可以有效地保護(hù)腦缺血后的大腦[10],此外,生姜對于脂肪肝也具有保護(hù)作用[11]。在2020年的新型冠狀病毒疫情期間,《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中將生姜等中藥材用于治療新型冠狀病毒肺炎。生姜具有特殊風(fēng)味、藥效溫和無毒,可長期食用且無副作用[12],目前,其常用于調(diào)料品。該研究以干姜為原料,分析不同提取方法對姜辣素和黃酮含量的影響,以及其抗氧化活性,旨在為生姜的加工利用提供依據(jù)。

        1 實(shí) 驗(yàn)

        1.1 材料與試劑

        干姜,羅平東恒姜業(yè)有限公司。姜經(jīng)干燥、粉碎后過60目篩,10 g每份分裝保存?zhèn)溆谩7盅b好的姜粉加60 mL石油醚,靜置6 h后脫脂,離心后烘干備用。

        1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,北京索萊寶科技有限公司;2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ),上海麥克林生化科技有限公司;VC抗壞血酸,天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

        GENESYS 10S紫外分光光度計(jì),美國賽默飛世爾科技公司;QΜINTIX型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;PE Eenspire型酶標(biāo)儀,美國PE公司;2XZ-2型冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司等。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        (1)姜辣素的提取

        超聲波法:取一份脫脂姜粉,加60%的乙醇溶液150 mL,超聲功率600 W,10 min,離心取上清,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。纖維素酶法:取一份脫脂姜粉,加400 mL蒸餾水、0.14 g纖維素酶,65 ℃放置85 min,加無水乙醇后55 ℃沉淀25 min,離心取上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。將上述濃縮液加入3倍體積的無水乙醇,4 ℃沉淀10 h,5000 r/min冷凍離心20 min,取上清液,冷凍干燥,得固體粗品。

        (2)黃酮的提取

        微波輔助法:取一份脫脂姜粉,加75%的乙醇溶液200 mL,微波功率600 W,25 s,置于室溫浸提4 h,取上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。超聲波法:取一份脫脂姜粉,加90%的乙醇溶液150 mL,超聲功率600 W,40 min,取上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。將上述濃縮液加3倍體積的無水乙醇,4 ℃沉淀10 h,5000 r/min冷凍離心20 min,取上清液,冷凍干燥,得固體粗品。

        1.4 姜辣素和黃酮含量測定

        1.4.1 姜辣素的含量測定

        繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的香草醛標(biāo)準(zhǔn)溶液,不足1.0 mL的加75%乙醇補(bǔ)足,各管中加入濃度為8%的Na2CO3溶液1.5 mL,室溫放置3~5 min,隨后加入80%的Folin酚試劑0.75 mL,搖勻,32.5 ℃下反應(yīng)2.25 h,在280 nm下測定吸光度值。以香草醛濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定回歸方程[13]。

        姜辣素樣品含量測定:分別取超聲提取和酶提取的提取液各1 mL,按照上述測定方法測量吸光度,帶入回歸方程,求得姜辣素樣品濃度。進(jìn)一步由計(jì)算公式(1)求得姜辣素含量,計(jì)算公式2求得姜辣素純度。

        (1)

        式中:2.003為香草醛換算姜辣素的系數(shù);Y為與標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的濃度,mg/mL;V0為樣品提取液體積,mL;W為樣品重量,g。

        (2)

        式中:C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算出的樣品含量,mg/g;M為樣品的質(zhì)量,g;m為粗提物質(zhì)量,mg。

        1.4.2 黃酮的含量測定

        繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確量取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別加入10 mL容量瓶中,不足5 mL加60%的乙醇補(bǔ)足,加入5%的NaNO2溶液0.3 mL,搖勻后放置6 min,加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL,搖勻后放置6 min,加入4%的NaOH溶液4 mL,混勻,60%的乙醇溶液定容至10 mL搖勻,靜置15 min,在510 nm波長下測吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定回歸方程。

        黃酮樣品含量測定:分別取微波提取和超聲提取的提取液1 mL,按照上述測定方法測量吸光度。帶入回歸方程,求得黃酮樣品濃度。進(jìn)而按照公式(3)求得黃酮含量,按照公式(2)求得黃酮純度。

        (3)

        式中:C為黃酮的質(zhì)量濃度,mg/mL;V為樣品提取液體積,mL;T為稀釋倍數(shù);m為粗提物質(zhì)量,g。

        1.5 姜辣素和黃酮提取物抗氧化活性測定

        1.5.1 DPPH抗氧化實(shí)驗(yàn)

        以VC作為陽性對照物,姜辣素和黃酮的樣品溶液濃度調(diào)整為1 mg/mL,設(shè)置6個濃度梯度,樣品溶液和DPPH溶液混勻之后避光0.5 h,517 nm處測吸光度值。以水和DPPH溶液作為空白組,無水乙醇代替DPPH溶液作為對照組。清除率計(jì)算公式(4)如下:

        (4)

        式中:Ai為樣品和DPPH的吸光值;Aj為樣品和無水乙醇的吸光值;AC為水和DPPH的吸光值。

        DPPH的半數(shù)清除率(IC50),指清除50%的自由基,所需要的樣品最終濃度。以實(shí)驗(yàn)所得的抗氧化物濃度為橫坐標(biāo),清除率為縱坐標(biāo),計(jì)算線性回歸方程,將清除率50%帶入方程中,求得對應(yīng)的橫坐標(biāo)即為DPPH的IC50。

        1.5.2 ABTS抗氧化實(shí)驗(yàn)

        以VC作為陽性對照物,姜辣素和黃酮溶液的濃度配置成1 mg/mL,設(shè)置6個濃度梯度,樣品溶液和ABTS溶液混勻之后避光0.5 h,734 nm處測得吸光值。同樣方法測得樣品和蒸餾水組,無水乙醇和ABTS組的吸光度值。清除率計(jì)算公式(5)如下:

        (5)

        式中:Ai為樣品和ABTS的吸光值;Aj為樣品和蒸餾水的吸光值;Ac無水乙醇和ABTS的吸光值。

        ABTS的半數(shù)清除率計(jì)算同DPPH計(jì)算方法。

        1.5.3 FRAP抗氧化實(shí)驗(yàn)

        設(shè)置0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L的6個濃度梯度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)液0.3 mL,加入3 mL FRAP工作液和0.3 mL超純水?;靹蚝蠓磻?yīng)5 min,593 nm處測定其吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        姜辣素和黃酮溶液的濃度配成1 mg/mL,量取0.1 mL的樣品溶液,按照上述測定方法測定吸光度,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 含量的測定

        2.1.1 姜辣素的含量測定

        實(shí)驗(yàn)采用福林酚法繪制姜辣素含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為:Y=0.003X+0.0159(R2=0.9963),在0~320 μg/mL范圍內(nèi)香草醛溶液濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

        由表1可知,超聲提取姜辣素的含量為2.1 mg/g、纖維素酶提姜辣素含量為1.8 mg/g,超聲法提取的姜辣素純度相對高于纖維素酶法。

        表1 姜辣素提取液的含量和純度

        2.1.2 黃酮的含量測定

        基于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液法繪制黃酮含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為:Y=5.884X+0.0082(R2=0.9985),在0.02~0.20 mg/mL范圍內(nèi)蘆丁溶液濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

        由表2可知,微波提取黃酮的含量為1.14 mg/g、超聲提取黃酮含量0.936 mg/g,微波輔助法提取黃酮純度稍高。

        表2 黃酮的含量和純度

        2.2 抗氧化活性

        2.2.1 姜辣素和黃酮對DPPH的清除率

        由圖1可知,采用不同的方法來提取姜辣素和黃酮,提取物抗氧化性是有一定差異的,但整體而言,姜辣素和黃酮在一定濃度范圍內(nèi)對DPPH自由基的清除率都隨著濃度的增加而增大。

        圖1 姜辣素和黃酮DPPH清除率

        超聲姜辣素抗氧化性強(qiáng)于酶提姜辣素。超聲提取和酶提取姜辣素的IC50值分別為0.187 mg/mL、0.201 mg/mL,與劉步云等[8]對不同品種的姜提取物的DPPH抗氧化性(0.79~4.35 mg/mL)相比,該實(shí)驗(yàn)條件下獲取的姜辣素DPPH抗氧化性相對較強(qiáng)。

        微波黃酮的抗氧化性強(qiáng)于超聲黃酮。微波提取和超聲提取黃酮的IC50值分別為0.185 mg/mL、0.197 mg/mL,與孫昕等[14]對姜提取的DPPH抗氧化性(0.35 mg/mL)相比,該實(shí)驗(yàn)條件下獲取的黃酮DPPH抗氧化性相對較強(qiáng)。

        2.2.2 姜辣素和黃酮對ABTS的清除率

        由圖2可知,不同方法來提取姜辣素和黃酮,其抗氧化性有一定差別,但整體而言,姜辣素和黃酮在一定濃度范圍內(nèi)對ABTS自由基的清除率都隨著濃度的增加而增大。

        圖2 姜辣素和黃酮的ABTS清除率

        超聲姜辣素的抗氧化性強(qiáng)于酶提姜辣素。超聲提取和酶提姜辣素的IC50值分別為0.227 mg/mL、0.253 mg/mL,與劉步云等[8]對不同品種的姜提取物的ABTS抗氧化性(最低為0.63 mg/mL)相比,該實(shí)驗(yàn)條件下獲取的姜辣素ABTS抗氧化性相對較強(qiáng)。

        微波黃酮的抗氧化性強(qiáng)于超聲黃酮。微波提取和超聲提取黃酮的IC50值分別為0.215 mg/mL、0.248 mg/mL,與孫昕等[14]姜提取物的ABTS抗氧化性(0.92 mg/mL)相比,該實(shí)驗(yàn)條件下獲取的黃酮ABTS抗氧化性相對較強(qiáng)。

        2.2.3 FRAP抗氧化測定

        基于FeSO4測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程為Y=0.1603X+0.046(R2=0.9962),表明在0~1.0 mM范圍內(nèi)FeSO4溶液濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

        姜辣素和黃酮的FRAP抗氧化測定結(jié)果見表3,由表3可知,不同的方法提取的姜辣素其抗氧化性有一定差異。超聲提取姜辣素的抗氧化活性強(qiáng)于酶提姜辣素,微波提取黃酮的抗氧化活性強(qiáng)于超聲提取黃酮。

        表3 姜辣素和黃酮的FRAP抗氧化活性

        3 結(jié) 論

        本文通過不同的方法對姜中活性成分的提取進(jìn)行探索,同時測定姜辣素和黃酮物質(zhì)的抗氧化能力,以期為姜的深加工利用提供一定的研究基礎(chǔ)。測定結(jié)果顯示不同的方法處理對姜辣素、黃酮的提取率有一定的影響。后續(xù)可優(yōu)先選用超聲法提取姜辣素,微波輔助法提取黃酮,并對該兩種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化,進(jìn)一步增加提取率。抗氧化活性測定結(jié)果顯示,姜辣素和黃酮的DPPH、ABTS以及FRAP抗氧化性最強(qiáng)的為微波提取黃酮,其次為超聲提取姜辣素。從三種抗氧化活性測定結(jié)果來看,姜辣素和黃酮都具有一定的抗氧化性,但黃酮的抗氧化性強(qiáng)于姜辣素,且微波輔助提取黃酮和超聲提取姜辣素的抗氧化活性最強(qiáng)。

        綜上所述,通過超聲提取姜辣素和微波輔助提取黃酮的方法提取率相對較高,且所得產(chǎn)品純度相對較高,抗氧化活性相對較強(qiáng),后續(xù)可通過該兩種提取方法對姜辣素和黃酮物質(zhì)的提取做進(jìn)一步研究。

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