盧 敏，黃 艷，陳艷艷，王福梅

(河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467000)

姜主要種植在我國中部、東南和西南部，是藥中佳品，主要用于治療風(fēng)寒感冒、嘔吐、痰飲等，具有抗菌消炎、抗氧化、降血糖血脂[1-2]等功能。姜中含有糖類、蛋白質(zhì)、脂類、維生素和多種微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)[3-4]，還含有許多藥理活性物質(zhì)，如姜辣素、黃酮、揮發(fā)油、多糖等[5]。姜辣素具有多重生理功效，其中抗氧化能力最強(qiáng)[6]。黃酮是一種天然抗氧化劑，可以清除人身體里面游離的氧自由基，減緩細(xì)胞的衰亡。黃酮及姜辣素是生姜具有抗氧化活性的主要原因[7-8]。生姜對多種腫瘤細(xì)胞的活性均有較好抑制作用[9]。生姜中的6-姜烯酚可以有效地保護(hù)腦缺血后的大腦[10]，此外，生姜對于脂肪肝也具有保護(hù)作用[11]。在2020年的新型冠狀病毒疫情期間，《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中將生姜等中藥材用于治療新型冠狀病毒肺炎。生姜具有特殊風(fēng)味、藥效溫和無毒，可長期食用且無副作用[12]，目前，其常用于調(diào)料品。該研究以干姜為原料，分析不同提取方法對姜辣素和黃酮含量的影響，以及其抗氧化活性，旨在為生姜的加工利用提供依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

干姜，羅平東恒姜業(yè)有限公司。姜經(jīng)干燥、粉碎后過60目篩，10 g每份分裝保存?zhèn)溆谩７盅b好的姜粉加60 mL石油醚，靜置6 h后脫脂，離心后烘干備用。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)，上海麥克林生化科技有限公司；VC抗壞血酸，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

GENESYS 10S紫外分光光度計(jì)，美國賽默飛世爾科技公司；QΜINTIX型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；PE Eenspire型酶標(biāo)儀，美國PE公司；2XZ-2型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1)姜辣素的提取

超聲波法：取一份脫脂姜粉，加60%的乙醇溶液150 mL，超聲功率600 W，10 min，離心取上清，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。纖維素酶法：取一份脫脂姜粉，加400 mL蒸餾水、0.14 g纖維素酶，65 ℃放置85 min，加無水乙醇后55 ℃沉淀25 min，離心取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。將上述濃縮液加入3倍體積的無水乙醇，4 ℃沉淀10 h，5000 r/min冷凍離心20 min，取上清液，冷凍干燥，得固體粗品。

(2)黃酮的提取

微波輔助法：取一份脫脂姜粉，加75%的乙醇溶液200 mL，微波功率600 W，25 s，置于室溫浸提4 h，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。超聲波法：取一份脫脂姜粉，加90%的乙醇溶液150 mL，超聲功率600 W，40 min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。將上述濃縮液加3倍體積的無水乙醇，4 ℃沉淀10 h，5000 r/min冷凍離心20 min，取上清液，冷凍干燥，得固體粗品。

1.4 姜辣素和黃酮含量測定

1.4.1 姜辣素的含量測定

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的香草醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，不足1.0 mL的加75%乙醇補(bǔ)足，各管中加入濃度為8%的Na2CO3溶液1.5 mL，室溫放置3～5 min，隨后加入80%的Folin酚試劑0.75 mL，搖勻，32.5 ℃下反應(yīng)2.25 h，在280 nm下測定吸光度值。以香草醛濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定回歸方程[13]。

姜辣素樣品含量測定：分別取超聲提取和酶提取的提取液各1 mL，按照上述測定方法測量吸光度，帶入回歸方程，求得姜辣素樣品濃度。進(jìn)一步由計(jì)算公式(1)求得姜辣素含量，計(jì)算公式2求得姜辣素純度。

(1)

式中:2.003為香草醛換算姜辣素的系數(shù)；Y為與標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的濃度，mg/mL；V0為樣品提取液體積，mL；W為樣品重量，g。

(2)

式中:C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算出的樣品含量，mg/g；M為樣品的質(zhì)量，g；m為粗提物質(zhì)量，mg。

1.4.2 黃酮的含量測定

繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確量取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加入10 mL容量瓶中，不足5 mL加60%的乙醇補(bǔ)足，加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加入4%的NaOH溶液4 mL，混勻，60%的乙醇溶液定容至10 mL搖勻，靜置15 min，在510 nm波長下測吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定回歸方程。

黃酮樣品含量測定：分別取微波提取和超聲提取的提取液1 mL，按照上述測定方法測量吸光度。帶入回歸方程，求得黃酮樣品濃度。進(jìn)而按照公式(3)求得黃酮含量，按照公式(2)求得黃酮純度。

(3)

式中：C為黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為樣品提取液體積，mL；T為稀釋倍數(shù)；m為粗提物質(zhì)量，g。

1.5 姜辣素和黃酮提取物抗氧化活性測定

1.5.1 DPPH抗氧化實(shí)驗(yàn)

以VC作為陽性對照物，姜辣素和黃酮的樣品溶液濃度調(diào)整為1 mg/mL，設(shè)置6個濃度梯度，樣品溶液和DPPH溶液混勻之后避光0.5 h，517 nm處測吸光度值。以水和DPPH溶液作為空白組，無水乙醇代替DPPH溶液作為對照組。清除率計(jì)算公式(4)如下：

(4)

式中：Ai為樣品和DPPH的吸光值；Aj為樣品和無水乙醇的吸光值；AC為水和DPPH的吸光值。

DPPH的半數(shù)清除率(IC50)，指清除50%的自由基，所需要的樣品最終濃度。以實(shí)驗(yàn)所得的抗氧化物濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程，將清除率50%帶入方程中，求得對應(yīng)的橫坐標(biāo)即為DPPH的IC50。

1.5.2 ABTS抗氧化實(shí)驗(yàn)

以VC作為陽性對照物，姜辣素和黃酮溶液的濃度配置成1 mg/mL，設(shè)置6個濃度梯度，樣品溶液和ABTS溶液混勻之后避光0.5 h，734 nm處測得吸光值。同樣方法測得樣品和蒸餾水組，無水乙醇和ABTS組的吸光度值。清除率計(jì)算公式(5)如下：

(5)

式中：Ai為樣品和ABTS的吸光值；Aj為樣品和蒸餾水的吸光值；Ac無水乙醇和ABTS的吸光值。

ABTS的半數(shù)清除率計(jì)算同DPPH計(jì)算方法。

1.5.3 FRAP抗氧化實(shí)驗(yàn)

設(shè)置0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L的6個濃度梯度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)液0.3 mL，加入3 mL FRAP工作液和0.3 mL超純水?；靹蚝蠓磻?yīng)5 min，593 nm處測定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

姜辣素和黃酮溶液的濃度配成1 mg/mL，量取0.1 mL的樣品溶液，按照上述測定方法測定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 含量的測定

2.1.1 姜辣素的含量測定

實(shí)驗(yàn)采用福林酚法繪制姜辣素含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=0.003X+0.0159(R2=0.9963)，在0～320 μg/mL范圍內(nèi)香草醛溶液濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

由表1可知，超聲提取姜辣素的含量為2.1 mg/g、纖維素酶提姜辣素含量為1.8 mg/g，超聲法提取的姜辣素純度相對高于纖維素酶法。

表1 姜辣素提取液的含量和純度

2.1.2 黃酮的含量測定

基于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液法繪制黃酮含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=5.884X+0.0082(R2=0.9985)，在0.02～0.20 mg/mL范圍內(nèi)蘆丁溶液濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

由表2可知，微波提取黃酮的含量為1.14 mg/g、超聲提取黃酮含量0.936 mg/g，微波輔助法提取黃酮純度稍高。

表2 黃酮的含量和純度

2.2 抗氧化活性

2.2.1 姜辣素和黃酮對DPPH的清除率

由圖1可知，采用不同的方法來提取姜辣素和黃酮，提取物抗氧化性是有一定差異的，但整體而言，姜辣素和黃酮在一定濃度范圍內(nèi)對DPPH自由基的清除率都隨著濃度的增加而增大。

圖1 姜辣素和黃酮DPPH清除率

超聲姜辣素抗氧化性強(qiáng)于酶提姜辣素。超聲提取和酶提取姜辣素的IC50值分別為0.187 mg/mL、0.201 mg/mL，與劉步云等[8]對不同品種的姜提取物的DPPH抗氧化性(0.79～4.35 mg/mL)相比，該實(shí)驗(yàn)條件下獲取的姜辣素DPPH抗氧化性相對較強(qiáng)。

微波黃酮的抗氧化性強(qiáng)于超聲黃酮。微波提取和超聲提取黃酮的IC50值分別為0.185 mg/mL、0.197 mg/mL，與孫昕等[14]對姜提取的DPPH抗氧化性(0.35 mg/mL)相比，該實(shí)驗(yàn)條件下獲取的黃酮DPPH抗氧化性相對較強(qiáng)。

2.2.2 姜辣素和黃酮對ABTS的清除率

由圖2可知，不同方法來提取姜辣素和黃酮，其抗氧化性有一定差別，但整體而言，姜辣素和黃酮在一定濃度范圍內(nèi)對ABTS自由基的清除率都隨著濃度的增加而增大。

圖2 姜辣素和黃酮的ABTS清除率

超聲姜辣素的抗氧化性強(qiáng)于酶提姜辣素。超聲提取和酶提姜辣素的IC50值分別為0.227 mg/mL、0.253 mg/mL，與劉步云等[8]對不同品種的姜提取物的ABTS抗氧化性(最低為0.63 mg/mL)相比，該實(shí)驗(yàn)條件下獲取的姜辣素ABTS抗氧化性相對較強(qiáng)。

微波黃酮的抗氧化性強(qiáng)于超聲黃酮。微波提取和超聲提取黃酮的IC50值分別為0.215 mg/mL、0.248 mg/mL，與孫昕等[14]姜提取物的ABTS抗氧化性(0.92 mg/mL)相比，該實(shí)驗(yàn)條件下獲取的黃酮ABTS抗氧化性相對較強(qiáng)。

2.2.3 FRAP抗氧化測定

基于FeSO4測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y=0.1603X+0.046(R2=0.9962)，表明在0～1.0 mM范圍內(nèi)FeSO4溶液濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

姜辣素和黃酮的FRAP抗氧化測定結(jié)果見表3，由表3可知，不同的方法提取的姜辣素其抗氧化性有一定差異。超聲提取姜辣素的抗氧化活性強(qiáng)于酶提姜辣素，微波提取黃酮的抗氧化活性強(qiáng)于超聲提取黃酮。

表3 姜辣素和黃酮的FRAP抗氧化活性

3 結(jié) 論

本文通過不同的方法對姜中活性成分的提取進(jìn)行探索，同時測定姜辣素和黃酮物質(zhì)的抗氧化能力，以期為姜的深加工利用提供一定的研究基礎(chǔ)。測定結(jié)果顯示不同的方法處理對姜辣素、黃酮的提取率有一定的影響。后續(xù)可優(yōu)先選用超聲法提取姜辣素，微波輔助法提取黃酮，并對該兩種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，進(jìn)一步增加提取率。抗氧化活性測定結(jié)果顯示，姜辣素和黃酮的DPPH、ABTS以及FRAP抗氧化性最強(qiáng)的為微波提取黃酮，其次為超聲提取姜辣素。從三種抗氧化活性測定結(jié)果來看，姜辣素和黃酮都具有一定的抗氧化性，但黃酮的抗氧化性強(qiáng)于姜辣素，且微波輔助提取黃酮和超聲提取姜辣素的抗氧化活性最強(qiáng)。

綜上所述，通過超聲提取姜辣素和微波輔助提取黃酮的方法提取率相對較高，且所得產(chǎn)品純度相對較高，抗氧化活性相對較強(qiáng)，后續(xù)可通過該兩種提取方法對姜辣素和黃酮物質(zhì)的提取做進(jìn)一步研究。