蔣偉民，李林江，孫少青，趙 星，江欣星

近年來輔助生殖技術(shù)有了長足進(jìn)步，越來越多的不孕癥患者接受體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization embryo transfer，IVF-ET）治療，但妊娠率較低[1]。因此如何準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)IVF-ET結(jié)局至關(guān)重要。miR-142-3p在惡性腫瘤中差異表達(dá)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用[2～4]。miR-142-3p可抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖、侵襲等[5]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming gro-wth factor-β1，TGF-β1）能調(diào)控血管合成、卵泡液發(fā)育、受精和著床調(diào)控過程[6]。劉昕等[7]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1通過高遷移率族蛋白組A1（homo sapiens high mobility group AT-hook 1，HMGA1）抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲。但miR-142-3p、TGF-β1在卵泡液中表達(dá)情況尚無文獻(xiàn)報(bào)道，與IVF-ET結(jié)局關(guān)系不明?；诖?，筆者主要探討miR-142-3p、TGF-β1在卵泡中表達(dá)水平及其對(duì)IVF-ET結(jié)局的影響，旨在提升IVF-ET妊娠成功率。

1 材料與方法

1.1 臨床材料

選擇海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院2018年10月至2020年12月進(jìn)行IVF-ET的100例不孕癥患者，年齡28～41歲，平均年齡29.18歲（標(biāo)準(zhǔn)差4.09歲）；體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）18～26 kg/m2，平均BMI 23.11 kg/m2（標(biāo)準(zhǔn)差3.08 kg/m2）；不孕年限1～7年，平均不孕年限3.62年（標(biāo)準(zhǔn)差0.84年）?；颊吆灦ㄖ橥鈺?，上報(bào)倫理委員會(huì)備案。

選擇標(biāo)準(zhǔn)：符合不孕癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；近期未使用免疫抑制劑、激素類藥物；男方精液無異常。

排除標(biāo)準(zhǔn)：卵巢手術(shù)史；免疫系統(tǒng)疾病、傳染及代謝?。慌渑既旧w異常；精神疾?。簧称骰?。

1.2 方法

1.2.1 體外受精-胚胎移植方法

在B超引導(dǎo)下提取卵母細(xì)胞，然后與精子進(jìn)行受精，繼續(xù)孵育受精卵；取卵后48～72 h將分裂為4～8個(gè)細(xì)胞的早期胚胎移植入宮腔，注射黃體酮；2周后若尿妊娠試驗(yàn)陽性，繼續(xù)注射黃體酮至10周停止。記錄成熟卵細(xì)胞、受精及種植數(shù)。

1.2.2 卵泡液轉(zhuǎn)化生長因子-β1水平檢測(cè)

注射人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）36 h后收集卵泡液，于2 500 r/min條件下離心10 min，于-20℃冰箱保存。采用酶聯(lián)免疫吸附分析試驗(yàn)盒（天津中奧天元生物有限公司，中國）檢測(cè)TGF-β1水平。根據(jù)TGF-β1中位數(shù)分為高、低表達(dá)組。

1.2.3 卵泡液miR-142-3p水平檢測(cè)

按miRNeasy Mini Kit提取分離試劑盒說明書進(jìn)行miRNA提取，隨后用分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及純度。按照cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA，反應(yīng)體系10μL：總RNA 7μL，5×Prime Script Buffer 2μL，Prime Script Enzyme Mix I 0.5μL，RT Primer 0.5μL，-20℃條件下保存?zhèn)溆?。以U6作為內(nèi)參，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積20μL：cDNA 4μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，PCR Forward Primer（10μmol/L）0.8μL，PCR Reverse Primer 0.8μL（10μmol/L），Rnase-Free Water 4.4μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃15 s，60℃60 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果使用2-ΔCt表示。

內(nèi)參為U6。miR-142-3p引物：F 5＇-TGCGGCAACACC-AGTCGATGG-3＇，R 5＇-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3＇；U6引物：F 5＇-GGCTACAGCAACAGGGTG-3＇，R 5＇-TTTGGTTGAGCACAGGGT-3＇。根據(jù)miR-142-3p中位數(shù)分為高、低表達(dá)組。

1.2.4 臨床妊娠評(píng)估

IVF-ET 4周后行陰道超聲，若有孕囊則認(rèn)定為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用受試者工作特性 （receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估m(xù)iR-142-3p、TGF-β1對(duì)IVF-ET結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外受精-胚胎移植結(jié)局

100例患者成熟卵細(xì)胞數(shù)、受精數(shù)、種植數(shù)分別為1 107個(gè)、1 011個(gè)、493個(gè)；獲卵數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)分別為（17.84±1.34）個(gè)、（13.46±1.63）個(gè)、（4.01±0.47）個(gè)；妊娠48例（48.00%），未妊娠52例（52.00%）。

2.2 妊娠和未妊娠患者卵泡液miR-142-3p、TGFβ1水平比較

妊娠組卵泡液TGF-β1水平[（327.34±46.33）pg/mL]、miR-142-3p水平（0.36±0.01）低于未妊娠組患者[（478.12±53.06）pg/mL，1.02±0.14]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.476、10.034，P=0.038、0.000）。見圖1。

2.3 不同miR-142-3p、TGF-β1水平患者體外受精-胚胎移植結(jié)局比較

根據(jù)miR-142-3p、TGF-β1水平中位數(shù)（397.73pg/mL，0.71）分為低表達(dá)組、高表達(dá)組。低表達(dá)組患者獲卵數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、臨床妊娠率均高于高表達(dá)組患者（P=0.000）。見表1、2。

表1 不同miR-142-3p水平患者IVF-ET結(jié)局比較Tab.1 Comparison of IVF-ET outcomes in patients with different miR-142-3p levels

表2 不同TGF-β1水平患者IVF-ET結(jié)局比較Tab.2 Comparison of IVF-ET outcomes in patients with different TGF-β1 level

2.4 卵泡液miR-142-3p、TGF-β1水平預(yù)測(cè)體外受精-胚胎移植結(jié)局的價(jià)值

miR-142-3p水平聯(lián)合TGF-β1水平預(yù)測(cè)IVFET結(jié)局的ROC曲線下面積（area under curve，AUC）、靈敏度及特異度均高于miR-142-3p水平、TGF-β1水平單獨(dú)預(yù)測(cè)。見表3、圖2。

表3 卵泡液miR-142-3p、TGF-β1水平對(duì)IVF-ET結(jié)局的預(yù)測(cè)效能Tab.3 Predictive efficacy of miR-142-3p and TGF-β1 level in follicular fluid on outcomes of IVF-ET

3 討論

近年來，中國不孕癥發(fā)生率逐年升高，目前IVFET是治療不孕癥的最有效技術(shù)，但該技術(shù)的臨床妊娠率只有50%左右，因此如何預(yù)測(cè)IVF-ET結(jié)局，從而提高妊娠率成為研究的熱點(diǎn)。臨床妊娠是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及胚胎、子宮內(nèi)膜及內(nèi)分泌等多種因素。截至目前，人們嘗試使用年齡、竇卵泡計(jì)數(shù)（antral follicle counting，AFC）、可溶性人類白細(xì)胞抗原G（human leucocyte antigen-G，HLA-G）、抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）去預(yù)測(cè)IVF-ET臨床結(jié)局，但結(jié)果差強(qiáng)人意[9～12]。卵泡液在促進(jìn)卵泡成熟、精子運(yùn)動(dòng)，抑制透明帶硬化等中發(fā)揮重要作用，卵泡液中一些生物化學(xué)指標(biāo)可反映卵母細(xì)胞質(zhì)量，影響胚胎發(fā)育。

有文獻(xiàn)報(bào)道，TGF-β1可調(diào)控顆粒細(xì)胞生物學(xué)行為，干擾卵泡成熟[13]。此外，TGF-β1可用于預(yù)測(cè)IVFET結(jié)局[14]。筆者研究結(jié)果顯示，低TGF-β1患者獲卵數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、臨床妊娠率均高于高TGFβ1患者，提示TGF-β1影響了卵泡的發(fā)育，進(jìn)而影響了IVF-ET妊娠結(jié)局，這與其他人的研究結(jié)果基本一致[14，15]。TGF-β1在細(xì)胞增殖、侵襲及血管生成中發(fā)揮重要作用，而卵泡膜可保證卵泡液TGF-β1含量較低，有利于卵母細(xì)胞成熟。

miRNA在顆粒細(xì)胞增殖、分化、性激素合成中發(fā)揮重要作用，與卵泡成熟度有關(guān)[16～18]。miR-142-3p位于人染色體19q13.42，參與多種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。文獻(xiàn)報(bào)道[19]，miR-142-3p可靶向FOXM1調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)功能。筆者研究結(jié)果顯示，低mi R-142-3p患者獲卵數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、臨床妊娠率均高于高miR-142-3p患者，提示mi R-142-3p影響了卵泡的發(fā)育，進(jìn)而影響了IVF-ET妊娠結(jié)局。但miR-142-3p影響妊娠結(jié)局的機(jī)制有待進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

卵泡液TGF-β1、miR-142-3p水平與IVF-ET結(jié)局關(guān)系不詳。筆者研究結(jié)果顯示，妊娠者兩者濃度低于未妊娠者，且ROC曲線顯示，它們均可預(yù)測(cè)IVFET結(jié)局，特別是兩者聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)價(jià)值更高。

綜上所述，卵泡液TGF-β1、mi R-142-3p水平可預(yù)測(cè)IVF-ET結(jié)局，但筆者研究數(shù)據(jù)有待進(jìn)一步大樣本驗(yàn)證。