易禎禛 宮黎明 賀敏 文德學(xué) 王興林 任真奎△

(1.黔西南布依族苗族自治州人民醫(yī)院檢驗科，貴州 興義 562400；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心，貴州 遵義 563099)

慢性乙型肝炎病毒(chronic hepatitis B virus ，HBV)的感染在我國處于高發(fā)狀態(tài)，而肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)生主要與HBV感染密切相關(guān)[1,2]。由于每年的HBV感染率逐漸增加，導(dǎo)致HCC的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢，肝硬化也是乙肝患者轉(zhuǎn)為肝癌的一個中間階段。HCC是臨床常見的惡性腫瘤之一，部分肝癌患者在發(fā)病后就已經(jīng)為晚期，失去最佳手術(shù)治療的機會，其死亡率一直居于消化系統(tǒng)惡性腫瘤的前三位。因此，能夠盡早評估發(fā)現(xiàn)肝癌對提高患者的預(yù)后和治療效果具有重要的臨床意義。當(dāng)前的臨床方法使用血清學(xué)指標(biāo)，例如乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(hepatitis B virus deoxyribonucleic acid ，HBV-DNA)，核心啟動子突變和肝硬化”(core promoter mutations and cirrhosis，GAG-HCC)， “乙型肝炎e-抗原血清清除后肝細(xì)胞癌”( hepatocellular carcinoma after hepatitis B e-antigen seroclearance，HCC-ESC)等評分，來用于預(yù)測HCC的發(fā)展[3-5]，但這些對于5年期的HCC發(fā)展評估不理想。目前，缺乏對預(yù)測肝癌發(fā)展的高度準(zhǔn)確，且真正有效地，可識別和操作的方法。近年來，在各種腫瘤研究報告中HLA-G(human leukocyte antigen-G ，HLA-G)分子存在顯著差異，其在HCC中也有報道。研究已指出，HLA-G是機體內(nèi)重要的參與免疫耐受的分子，包含三種可溶性的HLA-G5(sHLA-G5)、HLA-G6、HLA-G7分子及四種模型HLA-G1-G4[6-7]。 HLA-G的全基因片段含6個外顯子，外顯子1～4以及內(nèi)含子4表達(dá)HLA-G5，翻譯過程終止于此區(qū)域終止密碼子處，導(dǎo)致外顯子5和6不翻譯，跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)缺失[8]。在HLA-G分子的3個可溶型亞型中，表達(dá)豐度與功能研究最多的是HLA-G5。HLA-G5在免疫中表現(xiàn)出的作用在移植免疫、腫瘤免疫和生殖免疫領(lǐng)域備受關(guān)注，具有廣泛的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用前景[9-10]。以往研究皆顯示出腫瘤的整個病程與腫瘤宿主的免疫狀況密切相關(guān)，而T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在機體抗腫瘤免疫中起著主導(dǎo)作用[11]。T細(xì)胞亞群是機體進(jìn)行免疫監(jiān)視、抗腫瘤及抗感染中的重要組成部分，可以分為CD3+、CD4+和CD8+三類細(xì)胞，其中CD3+細(xì)胞是全T細(xì)胞標(biāo)志，CD4+細(xì)胞具有輔助前細(xì)胞的功能，CD8+細(xì)胞則具有抑制誘導(dǎo)及細(xì)胞毒性功能[12]。T淋巴細(xì)胞亞群分布指示的機體免疫功能狀態(tài)是研究治療肝病的重要因素，然而目前僅有的這些指標(biāo)對疾病的預(yù)判遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，尋求更新且有效的指標(biāo)是目前研究的重要方向。因此，本研究嘗試結(jié)合HLA-G5與T淋巴細(xì)胞亞群來聯(lián)合判斷患者的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，對確定相應(yīng)的治療方案、觀察療效及評估預(yù)后提供參考。報告如下。

1 材料與方法

1.1材料 (1)材料與試劑:患者標(biāo)本由黔西南州人民醫(yī)院經(jīng)患者知情同意后采集獲得；ELISA檢測試劑盒由江蘇科特生物科技有限公司獲得；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測試劑盒、甲胎蛋白(AFP)檢測試劑盒和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)檢測試劑盒購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；抗CD3+、CD4+和CD8+的單克隆抗體購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；酶標(biāo)儀(Addcare ELISA 600)，流式細(xì)胞儀(BriCyte E6)，高速離心機(14D)、超低溫冰箱(DW-25L262)。

1.2方法

1.2.1患者標(biāo)本的分組及采集 整個實驗分為3個組，分別為乙肝組、肝硬化組和肝癌組，隨機抽取2018年8月至2020年2月本院收治的肝病患者作為本次實驗的研究對象，每組約40份標(biāo)本，經(jīng)知情同意后，每位患者采集全血2～3 mL，高速離心分離血清，冰凍保存，待標(biāo)本全部收集完成進(jìn)行檢測。同上，用抗凝管采集患者1～2 mL全血用于流式檢測。

1.2.2全自動生化分析儀檢測血清中ALT、AST含量 將檢測試劑裝載上機后，血清標(biāo)本ALT和AST的檢測在本院檢驗科生物化學(xué)組進(jìn)行，保存結(jié)果。

1.2.3全自動化學(xué)發(fā)光儀檢測血清中AFP含量 將檢測試劑裝載上機后，血清標(biāo)本放在化學(xué)發(fā)光儀自動進(jìn)行AFP含量檢測，保存結(jié)果。

1.2.4ELISA法檢測血清中的HLA-G5變化情況 按試劑盒步驟將標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋液按一定比例進(jìn)行稀釋，并將以上患者血清標(biāo)本分組排好序，將標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣本加入孔板中，在450 nm波長處測各孔吸光度(OD值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物濃度與OD值導(dǎo)出標(biāo)準(zhǔn)曲線和函數(shù)方程，將樣品OD值輸入該方程，計算出相應(yīng)樣品中的HLA-G5濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，本實驗中稀釋倍數(shù)為5倍。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，空白孔為無檢測試劑與樣品，樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)孔OD值均以空白孔調(diào)零。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞亞群分布情況 將采集的抗凝全血混勻，取100 μL于試管中，分別加入CD4+CD4+和CD8+單克隆熒光抗體10 μL，混勻后室溫避光靜置15 min。接著用溶血素溶解紅細(xì)胞，同樣混勻后避光放置15 min，待溶解結(jié)束后1 000 rpm離心5 min收集細(xì)胞沉淀。細(xì)胞用PBS緩沖液反復(fù)洗3次，盡可能洗掉前面所用試劑。最后同樣條件離心收集細(xì)胞用稀釋液重懸細(xì)胞，上機檢測。

2 結(jié) 果

2.1各組肝病患者血清中的AFP、AST和ALT的含量 檢測結(jié)果顯示，與乙肝組相比，肝癌組的AFP、AST和ALT含量明顯升高(P<0.05)，肝硬化組含量有升高趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同肝病患者AFP、AST和ALT的含量

2.3各組肝病患者外周血中的T淋巴細(xì)胞亞群分布情況 流式結(jié)果顯示，與乙肝組相比，肝硬化與肝癌組CD3+百分比均減少，而CD4+ /CD8+比值均增加，肝癌組的CD4+百分比上升)，肝硬化組CD4+百分比呈上升趨勢，但是未具統(tǒng)計學(xué)意義，肝硬化組的CD8+百分比減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而肝癌組的CD8+百分比也有下降趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同肝病患者T淋巴細(xì)胞亞群分布

3 討 論

我國乙肝一直處于高發(fā)狀態(tài)，同時肝病患者比例也相應(yīng)增多。由乙肝到肝癌的過程復(fù)雜且長久，在臨床治療中面臨著諸多困難，例如對肝癌患者的早發(fā)現(xiàn)早治療就是一大問題。臨床上對疾病的診斷依據(jù)目前還是血清學(xué)常規(guī)檢查等，并結(jié)合相應(yīng)的臨床指標(biāo)作出治療對策，這些指標(biāo)雖能對疾病狀態(tài)進(jìn)行評估，但是不能更好地反映患者的具體病理狀態(tài)，進(jìn)而不能很好地指導(dǎo)臨床進(jìn)行救治。而在肝病患者治療過程中發(fā)現(xiàn)，了解其免疫功能的具體情況對疾病進(jìn)程的認(rèn)知以及診治有很大的幫助。因此，尋求真正有效地和可識別的指標(biāo)是研究的方向。有研究發(fā)現(xiàn)HLA-G在許多免疫相關(guān)疾病中可被誘導(dǎo)，起到免疫耐受作用[13,14]。在研究的大多數(shù)組織學(xué)類型的癌癥中均觀察到不同程度的HLA-G表達(dá)，并且強調(diào)了HLA-G相關(guān)的信號通路在癌癥生物學(xué)中作為免疫檢查點的重要性[15]。HLA-G 關(guān)聯(lián)的信號通路可抑制NK細(xì)胞，T和B淋巴細(xì)胞的增殖以及樹突狀細(xì)胞的成熟和抗原呈遞，抑制細(xì)胞的細(xì)胞毒和殺傷作用，B細(xì)胞的免疫球蛋白產(chǎn)生等[16-18]。

在本次研究中，我們擬通過結(jié)合檢測患者血清HLA-G5和全血T細(xì)胞亞群分布，來研究不同肝病患者細(xì)胞免疫功能的改變情況及其之間的相互聯(lián)系，進(jìn)一步評估患者免疫功能的紊亂程度，為臨床研究肝病患者的免疫療法補充材料。本次研究結(jié)果顯示，首先指示肝臟的AFP、AST和ALT指標(biāo)的升高說明此次研究的患者的病程判斷正確，AST和ALT指標(biāo)升高表明就診患者肝臟功能受損加重。接著在我們本次研究中各組肝病患者血清中的HLA-G5呈現(xiàn)的升高變化，與之前的報告一致[19-21]。流式結(jié)果顯示，肝病患者的T淋巴細(xì)胞亞群明顯超出正常范圍值。肝硬化與肝癌組CD3+百分比均減少，而CD4+ /CD8+比值均增加，肝癌組的CD4+百分比增加，肝硬化組的CD8+百分比下降，說明患者免疫功能處于對病毒的清除階段，機體還未發(fā)展嚴(yán)重的到免疫細(xì)胞毒性階段。肝硬化與肝癌組的HLA-G5明顯升高，且肝癌組明顯比肝硬化HLA-G5表達(dá)高，根據(jù)之前的研究，HLA-G在免疫T細(xì)胞中顯示出不同的調(diào)控作用[22]，說明在肝病患者的體內(nèi)HLA-G5的表達(dá)與免疫狀態(tài)存在重要的調(diào)控關(guān)系。大量研究表明，癌癥中HLA-G的異常表達(dá)與疾病進(jìn)展和較差的臨床預(yù)后有關(guān)[23]。HLA-G與T淋巴細(xì)胞亞群的聯(lián)合結(jié)果更能進(jìn)一步地觀察到肝病患者體內(nèi)機體的免疫狀態(tài)，更能細(xì)致區(qū)分機體免疫的動態(tài)過程，為評估患者治療提供新的支撐，當(dāng)然這也需要更多的進(jìn)一步的臨床試驗來將二者之間的關(guān)系進(jìn)行歸納。