張月強，高雅晴，尹連榮，康婷婷，曹丹鳳，劉莎莎

目前，近視已成為嚴重的公共衛(wèi)生和社會問題，全球近視患病率約28%，預測2050 年全球50%人口將患近視[1-2]，而亞洲地區(qū)近視患病率將高達69%～90%[3]。近視不是單純的屈光不正，往往伴隨著眼軸增長、赤道部擴張、鞏膜變薄、脈絡膜視網(wǎng)膜萎縮等病理性改變[4]。近視可通過鏡片或手術(shù)進行矯正，減少生活中的不便，但并不能解決近視對視覺系統(tǒng)的器質(zhì)性損傷，特別是其導致的致盲性并發(fā)癥的發(fā)生。因此，亟需通過臨床和基礎(chǔ)研究闡明近視的發(fā)病機制，尋求有效的治療靶點和藥物。研究[5-6]顯示補腎益精類中藥可以改善近視患者遠視力，緩解視疲勞，但對近視眼部結(jié)構(gòu)的影響目前文獻報道較少。本課題組在臨床中自擬益精通絡方（Yijing TongluoFormula，YJTL）應用于近視患者，發(fā)現(xiàn)其可以控制近視進展[7-8]?；诖?，本研究擬利用與人類近視相似的離焦型近視（defocus-induced myopia，DIM）的動物模型，探討中藥復方制劑YJTL對DIM豚鼠眼部結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級2周齡雄性三色豚鼠30只，體重約120 g，購自北京芳元緣養(yǎng)殖場，實驗動物合格證號：SCXK（京）2017-0036，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院眼科研究所普通級動物房。自由飲水條件下適應性飼養(yǎng)48 h，眼部檢查正常后進行實驗。飼養(yǎng)溫度維持在20℃～25℃，晝夜節(jié)律，使用專用豚鼠飼料喂養(yǎng)。

1.2 試劑、儀器與藥物

1%復方托吡卡胺滴眼液（日本Santen 公司，J20180051），0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液（參天制藥有限公司，B2055），蘇木精—伊紅染色（hematoxylineosin staining，HE）試劑盒（北京蘭杰柯科技有限公司，171160）。

帶狀光檢影鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司，YZ24），眼科A/B 型超聲診斷儀（徐州市凱信電子設(shè)備有限公司，SW-2100），冰凍切片機（德國Leica 公司，RM2255），顯微鏡（德國Leica 公司，BX51），NIS-Elements 圖片處理系統(tǒng)（日本Nikon 公司，941176）。

YJTL 的藥物組成：黃芪30 g、當歸10 g、枸杞子10 g、菟絲子10 g、赤芍10 g、紅花6 g、川芎6 g，購自中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院中藥房，以上藥物均符合2015 年版《中國藥典》的規(guī)定和標準。上述藥物清水浸泡30 min 后，添加水量超過藥物表面5 cm，先用武火燒開，再用文火慢煮，頭煎40 min，二煎25 min，煎藥后藥物濃度為0.635 g/mL，保存在4℃冰箱中備用。

1.3 DIM模型建立方法

甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）透鏡由北京京德嘉潤視覺科技股份有限公司制作。鏡片參數(shù)：度數(shù)為-5.0 D，后表面曲率（基弧區(qū)）為7.50 mm，內(nèi)光學區(qū)是11.50 mm，外光學區(qū)為11.35 mm，帽沿寬2.25 mm，總直徑為17.00 mm。

DIM 模型的建立從適應性飼養(yǎng)48 h 后開始，操作者剪除豚鼠雙眼眶周體毛，將右眼縫合-5.0 D PMMA 鏡片的橡膠頭套戴于豚鼠頭部，調(diào)整好雙眼位置，進行誘導。誘導期間發(fā)現(xiàn)鏡片脫落或頭套位置異常時及時重新調(diào)整，每天早晚各清洗1次鏡片。

1.4 動物分組與處理

30 只雄性三色豚鼠隨機分為照組（control group，CG），模型 組（model group，MG），治 療組（YJTL），每組10 只。YJTL 組豚鼠右眼透鏡誘導的同時給予10.0 mL/kg 的YJTL 湯劑灌胃，每日1 次；MG 組豚鼠右眼透鏡誘導，給予10.0 mL/kg 生理鹽水灌胃；CG 組豚鼠眼部不做任何處理，僅給予10.0 mL/kg生理鹽水灌胃。連續(xù)4周。

1.5 標本采集

異氟烷麻醉后，摘除豚鼠右側(cè)眼球。顯微鏡下沿角鞏膜緣注射適量的4%多聚甲醛溶液，室溫下靜置1 h，再沿角鞏膜緣剪開角膜，取出晶狀體、部分玻璃體，留取眼杯，并置于4%多聚甲醛固定液中，4℃固定。24 h以后取出眼杯組織，梯度蔗糖溶液脫水，包埋后進行冰凍切片，切片厚度20 μm。

1.6 等效球鏡度測量

所有豚鼠在干預前后，使用復方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，在暗室條件下進行右眼檢影驗光，連續(xù)測量3 次，記錄每只豚鼠右眼的等效球鏡度平均值，等效球鏡度=球鏡度+1/2柱鏡度（D）。

1.7 A超檢測

所有豚鼠在干預前后，室內(nèi)自然光線下，0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液點雙眼2 次。眼科A/B 型超聲診斷儀測量右眼眼軸長度（axial length，AL）、玻璃體腔長度（vitreous length，VL）、前房深度（anterior chamber depth，ACD）及晶狀體厚度（lens thickness，LT），以手動模式至少測量5 次取平均值，精確到1 μm，刪除測量結(jié)果中與平均值偏差明顯的數(shù)據(jù)，重復上述操作步驟，直到測量的標準差（standard deviation，SD）≤50 μm。

1.8 HE染色測量脈絡膜厚度

按照HE 染色試劑盒操作說明，豚鼠視網(wǎng)膜后極部組織切片依次進行蘇木素染液染色、分化液分化、返藍液返藍和伊紅染色，之后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，光學顯微鏡下觀察脈絡膜病理組織變化。每張切片于光鏡下，從視網(wǎng)膜后極部中央開始，向兩邊各隨機連續(xù)取5張視野，共10個視野，在NIS-Elements 圖像分析系統(tǒng)下測量各組脈絡膜厚度（choroid thickness，CT），每個視野測10 次取平均值[9]。

1.9 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料，方差分析（ANOVA）進行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗，當P＜0.05時，被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 YJTL對DIM豚鼠等效球鏡度、AL、VL的影響

等效球鏡度：干預前3組DIM豚鼠等效球鏡度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。干預后3組等效球鏡度比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=2,243.000，P=0.000）。兩兩比較：與CG 組比較，MG 組和YJTL 組豚鼠干預后等效球鏡度降低，差異有統(tǒng)計學意義（tMG=62.654，tYJTL=54.532，均P=0.000）；與MG 組比較，YJTL 組豚鼠干預后等效球鏡度升高，差異有統(tǒng)計學意義（t=9.160，P=0.000）。與同組干預前比較，CG、MG、YJTL組豚鼠干預后的等效球鏡度均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（tCG=13.746，tMG=46.425，tYJTL=53.664，均P=0.000）（表1）。

AL：干預前3 組DIM 豚鼠AL 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。干預后3 組AL 比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=408.800，P=0.000）。兩兩比較：與CG組比較，MG 和YJTL 組豚鼠干預后AL 增加，差異有統(tǒng)計學意義（tMG=31.623，tYJTL=18.767，均P=0.000）；與MG 組比較，YJTL 組豚鼠AL 減小，差異有統(tǒng)計學意義（t=-6.508，P=0.000）。與同組干預前比較，CG、MG、YJTL 組豚鼠干預后的AL 均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（tCG=-14.443，tMG=-43.782，tYJTL=-34.560，均P=0.000）（表1）。

VL：干預前3 組DIM 豚鼠VL 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；干預后3 組VL 比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=54.720，P=0.000）。兩兩比較：與CG組比較，MG 和YJTL 組豚鼠干預后VL 明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（tMG=9.522，tYJTL=6.724，均P=0.000）；與MG 組比較，YJTL 組豚鼠VL 減小，差異有統(tǒng)計學意義（t=-3.239，P=0.005）。與同組干預前比較，CG、MG、YJTL 組豚鼠干預后的VL 均增加，差異有統(tǒng)計學意義（tCG=-3.647，P=0.002；tMG=-25.121，tYJTL=-23.679，均P=0.000）（表1）。

表1 YJTL對DIM豚鼠等效球鏡度、AL、VL的影響（，n=10）

表1 YJTL對DIM豚鼠等效球鏡度、AL、VL的影響（，n=10）

注：*與CG 比較，P＜0.05；#與MG 比較，P＜0.05；&與本組干預前比較，P＜0.05；CG 對照組；MG 模型組；YJTL 益精通絡組；DIM 離焦型近視；AL 右眼眼軸長度;VL 玻璃體腔長度

2.2 YJTL對DIM豚鼠ACD、LT的影響

ACD：干預前和干預后3組DIM豚鼠ACD比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。與同組干預前比較，3組DIM 豚鼠干預后的ACD，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

LT：干預前和干預后3 組DIM 豚鼠LT 比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。與同組干預前比較，3 組DIM 豚鼠干預后的豚鼠LT 比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.3 YJTL對DIM豚鼠CT的影響

干預后3 組豚鼠的CT 值分別為CG 組（60.19±2.55）μm，MG 組（34.34±2.63）μm，LYTL 組（45.33±3.03）μm，差異有統(tǒng)計學意義（F=223.400，P=0.000）。兩兩比較：與CG 組比較，MG、YJTL 組豚鼠CT 減小，差異有統(tǒng)計學意義（tMG=-22.315，tYJTL=-11.866，均P=0.000）；與MG 組比較，YJTL 組豚鼠CT增加，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.662，P=0.000）。

2.4 屈光度與眼部結(jié)構(gòu)指標的相關(guān)性分析

DIM 豚鼠屈光度與ACD、LT 改變的相關(guān)性均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與AL、VL 呈正相關(guān)，與CT呈負相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義（rAL=-0.833，rVL=-0.515，rCT=0.762，均P=0.000）。

圖1 YJTL對DIM豚鼠CT的影響（HE染色，×200）

表2 YJTL對DIM豚鼠ACD、LT的影響（，n=10）

表2 YJTL對DIM豚鼠ACD、LT的影響（，n=10）

注：CG 對照組；MG 模型組；YJTL 益精通絡組；DIM 離焦型近視；ACD 前房深度；LT晶狀體厚度

3 討論

目前近視研究常用的動物模型主要有2 種：形覺剝奪型近視（form deprived myopia，F(xiàn)DM）和DIM。DIM 是通過給動物配戴負性球鏡，使物體成像于視網(wǎng)膜之后，但由于動物的正視化功能，鞏膜途徑和脈絡膜途徑的調(diào)控作用，使眼球的形態(tài)發(fā)生改變[10-12]。FDM 則采用各種方法阻斷中心視覺路徑，避免影像成像在視網(wǎng)膜上，使處于發(fā)育過程中的幼年動物失去外界物體的形覺刺激，降低對比度[13]。故人類由于用眼習慣及正視化功能，DIM 模型和人類近視的發(fā)病機制和病理狀態(tài)更接近[14-15]。三色豚鼠是目前用于近視研究中比較成熟的動物[16-17]，2周齡時的等效球鏡度約為+（2.56±0.53）D，經(jīng)過4周的自然生長約為+（0.76±0.18）D，說明豚鼠與人類一樣出生時為遠視，隨生長而逐漸正視化。選用-5.0 D透鏡誘導4 周后，MG 誘導眼等效球鏡度為-（4.72±0.21）D，說明中度DIM模型的成功建立。因此，本研究選擇建立三色豚鼠的DIM 模型來探索YJTL 對近視的影響。

《審視瑤函·目為至寶論》[18]中將近視的成因概括為：先天稟賦不足或長期過用目力，加之久視，致氣虛血耗精傷，故氣、血、精液虧虛不能上充于目，目不能視。近視病程較長，符合中醫(yī)“久病必虛”理論，病機多以虛為主，虛久必致瘀。臨床中發(fā)現(xiàn)近視眼患者部分證型為氣虛血瘀證。本課題組在經(jīng)典補氣活血通絡古方—補陽還五湯基礎(chǔ)上進行加減，加入補腎益精藥物，減少了活血藥物，創(chuàng)立了本研究所用的YJTL，方中重用黃芪，補益元氣，意在氣旺血行，瘀去絡通為君藥；當歸補血活血，枸杞子、菟絲子補益肝腎，共為臣藥；紅花、赤芍助當歸活血化瘀為佐藥；川芎兼引諸藥上行于頭目為使藥，全方形成了君臣益精、佐使通絡為主的YJTL。

本研究使用YJTL 湯劑在近視誘導過程中進行干預，結(jié)果顯示，與正常豚鼠比較，DIM 模型可以使等效球鏡度、CT 降低，AL、VL 增加，而給藥YJTL 可以使DIM模型等效球鏡度、CT增加，AL、VL降低，差異均有統(tǒng)計學意義；干預后屈光度與眼軸及VL 呈正相關(guān)、與CT呈負相關(guān)，說明YJTL的使用能夠達到抑制DIM 豚鼠屈光度加深、AL 增長、VL 增長及CT變薄效果。此研究結(jié)果與李巧蓮等[19]、季鵬等[20]、魏星等[21]、陳莉蘋等[9]通過透鏡誘導近視的研究結(jié)果相一致，即透鏡誘導眼可形成相應的近視、AL及VL的延長；近視眼眼軸延長的主要病理改變是玻璃體腔的延長，高度近視屈光度與CT 呈高度相關(guān)[22]。脈絡膜是一個富含血管的組織，其厚薄與血流的多少成正比[23]，最新的假說“鞏膜缺氧學說”[24]認為近視視覺信號使脈絡膜變薄及血流減少，引起脈絡膜缺氧，激活低氧誘導因子-1信號通路，導致鞏膜變薄、眼軸延長，發(fā)生近視，由此推測YJTL 控制近視進展可能與其增加脈絡膜血流相關(guān)，但關(guān)于該方對于近視眼CT改變的原理，目前文獻未有記載。

綜上所述，YJTL 具有補益肝腎，活血通絡的作用，可局部調(diào)整眼部氣血，濡養(yǎng)目系的作用，能夠抑制近視眼屈光度加深、AL 及VL 增長、CT 變薄，但具體機制還需進一步的研究。