康欽欽，邊云，田冰，李晶，劉芳，郝強(qiáng)，陸建平

透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,CCRCC)占所有腎細(xì)胞癌亞型的近90%，是預(yù)后最差、轉(zhuǎn)移潛能最高的一種亞型。WHO-ISUP病理分級(jí)系統(tǒng)是CCRCC患者獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測(cè)因素之一[1-3]。術(shù)前腎腫瘤穿刺活檢術(shù)對(duì)病理分級(jí)的診斷符合率僅46%～64%[4-6]。對(duì)于老年人和偶然發(fā)現(xiàn)的局限于腎臟的小腫瘤，積極主動(dòng)監(jiān)測(cè)治療方式在臨床越來越受到推薦[7,8]，故尋找一種能夠術(shù)前預(yù)測(cè)腫瘤病理分級(jí)的影像學(xué)方法有助于指導(dǎo)臨床的治療計(jì)劃和預(yù)后評(píng)估。體素內(nèi)不相干運(yùn)動(dòng)擴(kuò)散加權(quán)成像(intra voxel incoherent motion diffusion weighted imaging,IVIM-DWI)所獲得的表觀擴(kuò)散系數(shù)(apparent diffusion coefficient,ADC)值不僅能反映水分子的隨機(jī)擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，還可體現(xiàn)毛細(xì)血管網(wǎng)內(nèi)的微循環(huán)灌注情況[9-11]。本研究通過比較IVIM-DWI相關(guān)參數(shù)在不同病理分級(jí)CCRCC中的差異，并且尋找這些參數(shù)與腫瘤微血管密度(microvascular density,MVD)的相關(guān)性，旨在評(píng)估IVIM-DWI術(shù)前預(yù)測(cè)CCRCC病理分級(jí)的價(jià)值。

材料與方法

1.病例資料

本研究為前瞻性研究，全部病例均經(jīng)手術(shù)切除及病理證實(shí)。對(duì)2013年1月-2019年12月間行超聲或CT平掃檢查懷疑腎占位擬行腎臟切除術(shù)的133例患者行IVIM-DWI檢查，此階段患者的納入標(biāo)準(zhǔn)如下:①原發(fā)性腎占位性病變且未接受過任何治療；②MRI檢查后1個(gè)月內(nèi)行腎臟手術(shù)治療；③所有受檢者均無對(duì)比劑過敏病史、肝腎功能不全、腎臟血管性病變或其他泌尿系相關(guān)疾病。133例患者中包括109例透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌和24例非透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌。初始隊(duì)列研究的排除標(biāo)準(zhǔn)如下：①術(shù)前掃描發(fā)現(xiàn)肺、骨或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；②組織病理學(xué)分級(jí)不明(病理分級(jí)為Ⅱ-Ⅲ級(jí)、Ⅰ-Ⅱ分級(jí)或Ⅲ-Ⅳ級(jí))；③圖像質(zhì)量不佳；④免疫組化的腫瘤組織樣本不足。在109例CCRCC患者的初始隊(duì)列研究中，有27例患者因上述排除標(biāo)準(zhǔn)被排除在外。最終的研究隊(duì)列包括82例CCRCC患者，患者的平均年齡為52.2歲(范圍26～79歲)，其中男62例，平均年齡51.8歲(范圍26～76歲)，女20例，平均年齡54.7歲(范圍36～79歲)。根據(jù)WHO-ISUP分級(jí)結(jié)果將患者分為4組，分別為ISUPⅠ級(jí)組(n=14)、ISUP Ⅱ級(jí)組(n=47)、ISUP Ⅲ級(jí)組(n=15)、ISUP Ⅳ級(jí)組(n=6)。由于各級(jí)腫瘤樣本量較小，筆者采用Scelo等[12]推薦的方法，采用合并法將分級(jí)分為兩組，分別為高級(jí)別組(Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)，n=61)和低級(jí)別組(Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)，n=21)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

2.檢查方法

MRI檢查采用3.0T超導(dǎo)型磁共振儀(Signa HDXt,GE Healthcare,USA)。嵌入式體部線圈用于信號(hào)的激發(fā)，8通道體部專用相控陣線圈用于信號(hào)的接收。受檢者檢查前禁食6 h，取仰臥位，將8通道體部專用相控陣表面線圈置于受檢者腹壁前方，使其中心與臍和劍突連線的中點(diǎn)相一致，對(duì)受檢者進(jìn)行呼吸訓(xùn)練以減少呼吸運(yùn)動(dòng)偽影。

掃描序列及掃描參數(shù): ①軸面抑脂F(xiàn)SE T2WI，TR 6316 ms，TE 72 ms，視野360 mm×360 mm～400 mm×400 mm，矩陣320×192，層厚5 mm，層間距1 mm，翻轉(zhuǎn)角90°，NEX 2，帶寬83.3 KHz。②自由呼吸觸發(fā)腎臟SS-EPI DWI，TR 6000 ms，TE 58.6 ms，視野360 mm×360 mm～400 mm×400 mm，矩陣130×96，層厚5 mm，層間距1 mm，翻轉(zhuǎn)角90°，NEX 8，帶寬250 KHz，設(shè)定9個(gè)b值分別為0、20、50、100、200、400、600、800、1000 s/mm2。

3.圖像處理與數(shù)據(jù)采集

本研究采用IVIM雙指數(shù)模型來計(jì)算灌注分?jǐn)?shù)f、偽擴(kuò)散系數(shù)D*和單純擴(kuò)散系數(shù)D。雙指數(shù)模型不僅可反映組織內(nèi)水分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，還能體現(xiàn)組織的微血管灌注情況，隨著b值的增大，IVIM-DWI 圖像上組織信號(hào)的衰減會(huì)受到上述這兩種因素的影響。雙指數(shù)模型的計(jì)算公式為：S/S0=(1-f)exp(-b·D*)+f exp(-b·D)，其中S 為不同b值(b>0)IVIM-DWI圖像的信號(hào)強(qiáng)度，S0表示b值=0時(shí)IVIM-DWI圖像的信號(hào)強(qiáng)度，f為灌注分?jǐn)?shù)，代表局部微血管灌注情況所致的擴(kuò)散占全部擴(kuò)散效應(yīng)的百分比。D代表單純擴(kuò)散系數(shù)，反映局部組織水分子的真實(shí)擴(kuò)散情況，單位為mm2/s。D*代表假性擴(kuò)散系數(shù)，主要反映局部組織內(nèi)與微血管灌注相關(guān)的擴(kuò)散情況，單位為mm2/s[13]。

將所有患者的圖像信息上傳至GE ADW 4.4工作站，采用其自帶的后處理軟件進(jìn)行圖像處理分析。由兩位具有5～10年MRI圖像閱片經(jīng)驗(yàn)的影像科醫(yī)生在不知病理分級(jí)的情況下進(jìn)行圖像分析并取得一致意見，在獲得的后處理圖像上測(cè)量灌注分?jǐn)?shù)(f)、假性擴(kuò)散系數(shù)(D*)及單純擴(kuò)散系數(shù)(D)值。感興趣區(qū)(region of interest,ROI)盡可能多的包括腫瘤的實(shí)性部分，盡量避開脂肪、囊變、出血壞死區(qū)域。為減少部分容積效應(yīng)的影響，盡量將ROI靠近腫塊的中心位置。當(dāng)腫瘤實(shí)體部分信號(hào)不均勻時(shí)，在2～3個(gè)不同的信號(hào)區(qū)域勾畫腫瘤實(shí)質(zhì)的ROI，并計(jì)算以上參數(shù)的平均值，ROI面積為0.25～0.50 cm2。

4.標(biāo)本的采集、處理及免疫組化染色

采用4%的中性甲醛固定溶液對(duì)標(biāo)本處理后進(jìn)行石蠟包埋，切片厚度為4 μm，首先進(jìn)行常規(guī)H-E染色，采用WHO-ISUP核分級(jí)系統(tǒng)進(jìn)行病理分級(jí)。分級(jí)應(yīng)遵循最高原則，即當(dāng)組織內(nèi)腫瘤的核分級(jí)出現(xiàn)異質(zhì)性時(shí)，應(yīng)以最高分級(jí)為準(zhǔn)，然后采用Envision法進(jìn)行CD34免疫組化染色[14]。

根據(jù)Weidner等[15]報(bào)道的方法進(jìn)行MVD的測(cè)量，即首先在低倍鏡視野內(nèi)(×100)選取組織內(nèi)MVD最高的區(qū)域，然后轉(zhuǎn)到高倍鏡視野(×400)計(jì)算5個(gè)視野的微血管數(shù)目，取平均值作為微血管密度的測(cè)量值。微血管的判斷標(biāo)準(zhǔn)：高倍鏡下與背景完全不同的棕色或褐色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞叢均作為1個(gè)血管，另外只要結(jié)構(gòu)不連，分支血管也可作為1個(gè)血管計(jì)數(shù)。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較低、高級(jí)別組間腫瘤IVIM-DWI參數(shù)的差異。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線評(píng)估各參數(shù)值在鑒別診斷高級(jí)別與低級(jí)別組CCRCC中的效能并確定診斷閾值。低級(jí)別和高級(jí)別組CCRCC的MVD與IVIM-DWI各參數(shù)的相關(guān)性以及IVIM-DWI各參數(shù)與病理分級(jí)之間的相關(guān)性通過Spearman等級(jí)相關(guān)進(jìn)行分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

不同病理分級(jí)CCRCC的IVIM相關(guān)參數(shù)值及MVD測(cè)量值見表1。高級(jí)別與低級(jí)別組CCRCC的D*值分別為(51.1±7.6)、(44.3±9.5)mm2/s，D值分別為(1.2±0.3)、(1.3±0.3)mm2/s，MVD測(cè)量值分別為(81.5±8.8)、(67.5±12.8)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。灌注分?jǐn)?shù)(f)在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

圖1 CCRCC患者，女，65歲，WHO-ISUP Ⅲ級(jí)，體檢發(fā)現(xiàn)左腎上極占位1周，近幾日肉眼血尿間歇出現(xiàn)，時(shí)輕時(shí)重。a)T2WI圖像；b)增強(qiáng)掃描實(shí)質(zhì)期圖像；c)單b值DWI圖像；d)IVIM-D*圖像，相應(yīng)的D*值為42.35mm2/s；e)D圖，相應(yīng)的D值為1.23mm2/s；f)f圖，相應(yīng)的f值為41.75%。

表1 不同CCRCC的IVIM-DWI各參數(shù)值及MVD值比較

IVIM-DWI參數(shù)、ISUP分級(jí)及MVD的相關(guān)性分析結(jié)果見表2。D*、D及MVD值均與透明細(xì)胞癌的病理分級(jí)相關(guān)，其中D*值與病理分級(jí)呈正相關(guān)(r=0.346，P<0.05)，D值與病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.315，P<0.05)。MVD值與病理分級(jí)呈顯著正相關(guān)(r=0.617，P<0.05)。灌注分?jǐn)?shù)與透明細(xì)胞癌的病理分級(jí)無明顯相關(guān)性。D*值及D值均與MVD存在相關(guān)性，其中D*值與MVD呈顯著正相關(guān)(r=0.585,P<0.05)，而D值與MVD呈負(fù)相關(guān)(r=-0.337,P<0.05，圖2～5)。

表2 IVIM-DWI參數(shù)、ISUP分級(jí)、MVD之間的相關(guān)性分析

ROC曲線分析結(jié)果顯示，D值、D*值鑒別高、低級(jí)別CCRCC的ROC曲線下面積均為0.7(圖6)。D值、D*值的診斷閾值分別為1.2 mm2/s、44.4 mm2/s，敏感度分別為70.0%、60.7%，特異度分別為70%、90%。

圖6 a)D值鑒別診斷高、低級(jí)別CCRCC的ROC曲線；b)D*值鑒別診斷高、低級(jí)別CCRCC的ROC曲線。

討 論

本研究首先對(duì)82例CCRCC患者進(jìn)行IVIM-DWI研究，獲得了能夠反映腫瘤組織水分子擴(kuò)散情況的參數(shù)即單純擴(kuò)散系數(shù)(D)、腫瘤組織內(nèi)微循環(huán)血管灌注情況所導(dǎo)致的水分子擴(kuò)散參數(shù)即假性擴(kuò)散系數(shù)(D*)以及反映腫瘤組織內(nèi)微血管血流灌注情況的參數(shù)即灌注分?jǐn)?shù)(f)；然后對(duì)上述82例CCRCC患者的病理切片進(jìn)行CD34免疫組化分析以量化腫瘤組織內(nèi)MVD，以評(píng)估IVIM-DWI所獲得的相關(guān)參數(shù)與不同級(jí)別透明細(xì)胞癌MVD的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示D*及D值在不同病理分級(jí)CCRCC中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且兩者均與WHO-ISUP分級(jí)有一定相關(guān)性。通過免疫組化分析，本研究發(fā)現(xiàn)不同病理分級(jí)透明細(xì)胞癌的MVD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與D*值呈明顯正相關(guān)，與D值呈負(fù)相關(guān)，與f值無明顯相關(guān)性。

D、D*值與病理分級(jí)：本研究結(jié)果顯示，D*值在不同病理分級(jí)CCRCC中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且與CCRCC分級(jí)呈正相關(guān)(P<0.05)。以往諸多研究報(bào)道D、D*值均與細(xì)胞密度相關(guān)，細(xì)胞密度越大，D和D*值越小[16,17]。然而，另有研究報(bào)道ADC值與細(xì)胞密度無明顯相關(guān)性[18]。本研究結(jié)果顯示，不同病理分級(jí)CCRCC之間有明顯的D和D*值差異，高級(jí)別CCRCC的D*值較低級(jí)別CCRCC高，而D值較低級(jí)別CCRCC略低。筆者分析其原因可能是腫瘤的病理分級(jí)越高，血供越豐富，血流微循環(huán)所致的D*值越大，但高分級(jí)腫瘤組織的細(xì)胞粘度或細(xì)胞膜的屏障作用加強(qiáng)，從而使得組織內(nèi)水分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)受限，故D值減低[19,20]。本研究結(jié)果顯示，D和D*值鑒別診斷高級(jí)別與低級(jí)別CCRCC的最佳閾值分別為1.2 mm2/s和44.4 mm2/s，診斷敏感度分別為70%、60%，特異度分別為90%、70%。

灌注分?jǐn)?shù)與病理分級(jí)：本研究結(jié)果顯示，f值與CCRCC的病理分級(jí)無明顯相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r=-0.071,P=0.526)。但也有研究發(fā)現(xiàn)f值與CCRCC分級(jí)呈明顯相關(guān)性，這可能是由于高級(jí)別透明細(xì)胞癌血供更豐富，血容量較低級(jí)別透明細(xì)胞癌增加的緣故[21]。由于90%以上的腎臟血容量存在于腎臟皮質(zhì)內(nèi)，腎皮質(zhì)的平均灌注分?jǐn)?shù)(f)值明顯高于腎髓質(zhì)[22]。本研究得出兩者無相關(guān)性結(jié)論的原因可能與高級(jí)別CCRCC的患者數(shù)量較少有關(guān)，未來還需要加大樣本量行進(jìn)一步研究。

D、D*值與MVD：相關(guān)研究分析了基于單指數(shù)模型DWI所獲得的ADC值與腫瘤組織內(nèi)MVD之間的關(guān)系[23]，但其所使用的單指數(shù)模型只能反映水分子的總體擴(kuò)散情況，并不能將血流灌注情況所導(dǎo)致的水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)的差異表現(xiàn)出來。而根據(jù)Huuse等[23]研究的雙指數(shù)模型，可以更好地描述組織中信號(hào)的衰減程度與不斷增加的b值之間的關(guān)系，并且能分別得到單純反映水分子組織擴(kuò)散率的參數(shù)和反映組織微循環(huán)灌注情況的定量IVIM參數(shù)。本研究結(jié)果顯示，D*和D值均與腫瘤組織的MVD顯著相關(guān)。此外，盡管惡性腫瘤的生物學(xué)行為類似，但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)D*值和f值在不同器官組織腫瘤間存在明顯差異[24]，筆者推測(cè)這種差異是由于血管灌注情況不同所導(dǎo)致的；本研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，MVD與D*值顯著相關(guān)，D*值代表組織內(nèi)毛細(xì)血管的微循環(huán)灌注情況，表明MVD與腫瘤的血流灌注密切相關(guān)。

灌注分?jǐn)?shù)與MVD：本研究結(jié)果表明灌注分?jǐn)?shù)(f)值與MVD值無明顯相關(guān)性，反映了腫瘤組織的血容量與其微血管密度無明顯相關(guān)性，腫瘤組織體積較大時(shí)，其微血管密度減低，但其血容量可能并不會(huì)低于低級(jí)別腫瘤。此外，在不同的組織器官惡性腫瘤中，D值的差異性并不明顯，這可能從側(cè)面印證了惡性腫瘤的單純水分子擴(kuò)散特征可能是相似的。

MVD與組織病理學(xué)分級(jí)：腫瘤的組織病理學(xué)分級(jí)目前是CCRCC預(yù)后模型中唯一的一種基于組織學(xué)的預(yù)后指標(biāo)[25]。MVD可簡(jiǎn)單量化腫瘤組織的血管生成能力，CCRCC的血供非常豐富，故腫瘤的MVD為透明細(xì)胞癌比較標(biāo)志性的免疫組化指標(biāo)。MVD也是CCRCC不同病理分級(jí)的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。既往研究表明，不同病理分級(jí)透明細(xì)胞癌CT增強(qiáng)模式的差異是由血管生成能力所導(dǎo)致，與腫瘤組織的MVD密切相關(guān)[26]。本研究結(jié)果顯示，腫瘤組織的MVD與病理Fuhrman分級(jí)呈正相關(guān)，MVD越高，F(xiàn)uhrman分級(jí)越高，這與之前的研究結(jié)果不同[27]。原因可能是本研究將Fuhrman Ⅲ及Ⅳ級(jí)患者歸為高級(jí)別組且FuhrmanⅣ級(jí)的患者僅有6例，免疫組化結(jié)果顯示Fuhrman Ⅳ級(jí)患者的MVD值最小，F(xiàn)uhrman Ⅲ級(jí)的MVD較Ⅱ級(jí)腫瘤略高，故導(dǎo)致MVD值與病理Fuhrman分級(jí)呈正相關(guān)的結(jié)果。在以后的研究中筆者還將擴(kuò)大Ⅰ級(jí)和Ⅳ級(jí)患者的樣本量進(jìn)行四種病理分級(jí)的研究。

另外有一些研究表明，利用不需外源性示蹤劑的MRI技術(shù)，如動(dòng)脈自旋標(biāo)記成像(arterial spin labeling,ASL)，也可用于腎臟腫瘤良惡性及不同病理分級(jí)的鑒別診斷，但ASL的掃描技術(shù)及對(duì)MR灌注參數(shù)的計(jì)算較IVIM-DWI更具挑戰(zhàn)性[26]。未來筆者可以將ASL-DWI聯(lián)合掃描技術(shù)用于腎腫瘤的病理分級(jí)及良惡性的評(píng)估研究中，可能會(huì)進(jìn)一步闡釋腎臟腫瘤特別是CCRCC的微環(huán)境。

本研究存在以下局限性：首先，本研究樣本量較小，尤其Fuhrman Ⅳ級(jí)患者只有6例，主要是多數(shù)Ⅳ級(jí)CCRCC患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移或伴靜脈癌栓，未來還需更大樣本量的前瞻性研究來評(píng)估驗(yàn)證我們的初期結(jié)論。其次，雖然當(dāng)腫瘤信號(hào)不均勻時(shí)，筆者選擇2～3個(gè)實(shí)性部分區(qū)域進(jìn)行ROI的勾畫，取其平均值，但為了減少容積效應(yīng)盡量將ROI放置于腫瘤的中心位置，導(dǎo)致獲取的參數(shù)不能充分評(píng)估腫瘤組織的異質(zhì)性。最后，本研究?jī)H對(duì)腫瘤實(shí)性部分進(jìn)行了IVIM-DWI分析，忽略了腫瘤的囊變壞死區(qū)域?qū)VIM-DWI參數(shù)的影響。故以后在對(duì)腎臟腫瘤定量影像特征的研究中還需將全腫瘤ROI技術(shù)納入研究并進(jìn)行分析比較。

綜上所述，基于IVIM-DWI參數(shù)在不同病理分級(jí)CCRCC之間的差異及其與MVD的相關(guān)性，筆者認(rèn)為IVIM-DWI可作為一種無創(chuàng)評(píng)估術(shù)前不同病理分級(jí)CCRCC的影像手段,達(dá)到術(shù)前評(píng)估預(yù)后的目的。DWI成像速度快且不需要使用外源性對(duì)比劑，對(duì)于一部分合并有侵襲性基礎(chǔ)疾病、適合隨訪的腎臟小腫瘤、老年人或肝腎功能不全患者具有良好的應(yīng)用前景，可為臨床隨訪或主動(dòng)監(jiān)測(cè)提供一種無創(chuàng)的影像方法。