房曉燕，李萌萌，郝濟(jì)偉，丘一諾，解 群，張慶紅

2016年美國食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布藥物警告：3歲以下嬰幼兒接受手術(shù)或醫(yī)療操作，重復(fù)或長時間(3 h)使用全身麻醉及鎮(zhèn)靜藥物，對大腦發(fā)育可能有一定影響[1]。本研究組及以往研究也證實，發(fā)育期多次異氟烷處理對大鼠成年后的認(rèn)知功能有影響[2]；有規(guī)律運(yùn)動對大腦發(fā)育及神經(jīng)功能修復(fù)可產(chǎn)生積極且深遠(yuǎn)的影響[3-6]。但不同性別間的認(rèn)知差異尚未見報道。本研究旨在探討規(guī)律運(yùn)動對生后多次異氟烷處理后不同性別大鼠空間認(rèn)知行為學(xué)的影響，并在探索其分子學(xué)機(jī)制。

1材料與方法

1.1 實驗材料 生后7 d 的SD大鼠110只(北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證編號：11401300035796，1140130035957, 11401300028504, 11401300037563)。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常對照組(n=28)、運(yùn)動組(n=30)、異氟烷組(n=26)和異氟烷(n=26)運(yùn)動組。新生大鼠和母鼠單籠飼養(yǎng)，21 d后按雌雄分籠。分別于出生后7、21和63 d測量大鼠體重，判斷其生長發(fā)育狀況。實驗室溫度(25±1)℃，相對濕度45%～55%，保持動物晝夜生物節(jié)律。行為學(xué)實驗均在9:00～18:00進(jìn)行。本實驗方案通過醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，動物處置過程中所有操作符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 異氟烷處理 異氟烷組及異氟烷運(yùn)動組采用實驗動物麻醉機(jī)(美國MATRX公司)，以3%異氟烷(山東魯南貝特，生產(chǎn)批號64140302)進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)，約5 min幼鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)，以1.5%異氟烷與30%氧氣混合吸入維持2 h。麻醉過程中，通過檢查幼鼠呼吸頻率及每15 min夾尾確保其存活，ALC-HTP動物恒溫系統(tǒng)(上海奧爾科特)維持體溫在(36.5±0.5)℃，開啟二氧化碳吸附器吸收廢氣[2]。異氟烷處理后幼鼠，各組取1只進(jìn)行動脈血?dú)夥治?，排除麻醉動物可能出現(xiàn)的高碳酸血癥等因素對研究結(jié)果的干擾。異氟烷處理后其余幼鼠從誘導(dǎo)箱中取出， 3～5 min恢復(fù)爬行，待完全清醒后統(tǒng)一送回動物房飼養(yǎng)。

1.3 大鼠運(yùn)動方案[7,8]運(yùn)動組及異氟烷運(yùn)動組從21 d開始進(jìn)行有規(guī)律運(yùn)動，訓(xùn)練時間為14:00-17:00，應(yīng)用XR-PT-10A小動物跑臺(上海欣軟信息科技有限公司)。跑臺由相互間隔的6條跑道組成，每條跑道有效空間為600 mm×95 mm×115 mm，跑臺0°傾角不變，速度從4 m/min開始，每周增加2 m/min；6周速度增至14 m/min，每天訓(xùn)練30 min，每周5 d，剔除因受傷等未完成6周訓(xùn)練的大鼠。

1.4 八臂迷宮實驗 運(yùn)動結(jié)束后，各組大鼠進(jìn)行八臂迷宮實驗，亦稱為輻射迷宮(radial arm maze)，用于評估動物空間記憶能力[9]。實驗所用八臂迷宮425 mm×145 mm× 225 mm。八臂迷宮實驗期間，大鼠進(jìn)行飼料限量喂養(yǎng)，不限水?dāng)z入，使其保持饑餓狀態(tài)，體重維持在基礎(chǔ)體重80%～85%。實驗步驟分迷宮適應(yīng)階段、訓(xùn)練階段、測試階段。記錄訓(xùn)練階段完成實驗的總耗時，即大鼠吃完所耗時間或10 min測試結(jié)束。測試階段記錄參考記憶錯誤、工作記憶錯誤、總耗時。

1.5 Morris水迷宮實驗[10]本實驗采用的水迷宮為直徑150 cm，高60 cm的圓形水池，水深約35 cm，在其中一個象限中央放置平臺(直徑11 cm，高33 cm)，平臺于水下2 cm，實驗過程通過水迷宮上方的攝像機(jī)進(jìn)行錄制。實驗步驟分為定位航行實驗、空間探索實驗及反向空間實驗，記錄大鼠在目標(biāo)象限耗時、目標(biāo)象限潛伏期以及平臺潛伏期。

1.6 免疫組化 各組大鼠在所有行為學(xué)試驗結(jié)束后，腹腔注射3%戊巴比妥(5 mg/kg)，待麻醉后，開胸以4%多聚甲醛經(jīng)左心室進(jìn)行全身灌注固定，完整取出大鼠海馬組織，進(jìn)行免疫組化染色。各指標(biāo)的積分光密度值均應(yīng)用麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)獲得。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western-Blot) 海馬組織取材液氮中保存，隨后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實驗。

2結(jié) 果

2.1 一般情況 飼養(yǎng)及運(yùn)動訓(xùn)練過程中剔除因受傷或拒絕運(yùn)動大鼠18只(雄鼠11只，雌鼠7只)，每組大鼠為10～15只。隨日齡增長，各組SD大鼠體重增加，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。異氟烷處理后，各組幼鼠動脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。腦組織取材后稱重，各組大鼠腦部重量比較無統(tǒng)計學(xué)差異(表1)。

表1 各組SD大鼠一般情況

2.2 八臂迷宮實驗 雌、雄大鼠在八臂迷宮訓(xùn)練階段的總耗時，隨訓(xùn)練次數(shù)增多呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；運(yùn)動組雌、雄大鼠的表現(xiàn)明顯優(yōu)于非運(yùn)動組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；盡管非運(yùn)動組大鼠訓(xùn)練10次也能達(dá)到測試標(biāo)準(zhǔn)，但學(xué)習(xí)次數(shù)與總耗時之間無穩(wěn)定的學(xué)習(xí)進(jìn)步曲線，而進(jìn)行規(guī)律運(yùn)動的大鼠，其學(xué)習(xí)進(jìn)步曲線清晰，尤其是雄鼠在訓(xùn)練第2次基本達(dá)到測試標(biāo)準(zhǔn)，雌鼠在第3，4 次逐漸穩(wěn)定(圖1A，B)；異氟烷處理不同性別大鼠間比較，雌鼠在第5次達(dá)到測試標(biāo)準(zhǔn)，明顯早于雄鼠(圖1C)；規(guī)律運(yùn)動后發(fā)現(xiàn)，雄鼠在第2次即達(dá)到測試標(biāo)準(zhǔn)，而雌鼠在第4次訓(xùn)練才達(dá)到(圖1D)。提示，異氟烷處理可能對雄鼠學(xué)習(xí)能力有一定影響，但規(guī)律運(yùn)動后明顯改善，即雄鼠的運(yùn)動獲益較大。

圖1 運(yùn)動對不同性別SD大鼠成年后在八臂迷宮訓(xùn)練階段的影響

八臂迷宮測試中，采用單因素方差分析雄鼠各組間參考記憶錯誤及總耗時組間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；進(jìn)一步兩兩比較(Tamhane)發(fā)現(xiàn), 與非運(yùn)動組相比，運(yùn)動兩組參考記憶錯誤次數(shù)及總耗時減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)；分析雌鼠參考記憶錯誤及總耗時，組間比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異(均為P=0.000)；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，異氟烷組的參考記憶錯誤次數(shù)及總耗時顯著增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，運(yùn)動組參考記憶錯誤次數(shù)及總耗時降低，與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；另外，異氟烷運(yùn)動組與異氟烷組相比，在參考記憶錯誤次數(shù)及總耗時明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P=0.000，表2)。

表2 運(yùn)動對SD大鼠成年后八臂迷宮測試階段的影響

表2 運(yùn)動對SD大鼠成年后八臂迷宮測試階段的影響

注：與正常對照組比較，①P<0.05；與異氟烷組比較， ②P<0.01

項目正常對照組運(yùn)動組異氟烷組異氟烷運(yùn)動組雄性 例數(shù)11101210 參考記憶錯誤(次)2.68±0.122.06±0.19①3.05±0.162.45±0.15 工作記憶錯誤(次)0.27±0.060.2±0.070.25±0.070.31±0.08 總時間(s)61.39±2.648.8±3.22①70.97±4.8250.1±2.89②雌性 例數(shù)14131111 參考記憶錯誤(次)2.4±0.092.08±0.133.09±0.11①2.17±0.15② 工作記憶錯誤(次)0.23±0.050.2±0.060.15±0.050.20±0.06 總時間(s)57.7±1.9752.5±2.1768.2±2.88①52.7±2.67②

2.3 Morris水迷宮實驗 與正常對照組相比，異氟烷組雄鼠在目標(biāo)象限潛伏期及平臺潛伏期有延長趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；異氟烷組雌鼠在水迷宮空間探索實驗的表現(xiàn)無明顯差異；與非運(yùn)動組相比，運(yùn)動兩組雄鼠在目標(biāo)象限耗時增加，目標(biāo)象限潛伏期及平臺潛伏期均縮短，但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(表3)；反向空間實驗中，異氟烷組雌鼠與正常對照組雌鼠相比，目標(biāo)象限耗時減少(P<0.05,表4)。

表3 運(yùn)動對SD大鼠成年后水迷宮空間探索實驗的影響

表3 運(yùn)動對SD大鼠成年后水迷宮空間探索實驗的影響

分組正常對照組運(yùn)動組異氟烷組異氟烷運(yùn)動組雄性 例數(shù)11101210 目標(biāo)象限耗時25.42±2.730.03±2.2426.08±2.4130.65±2.3 目標(biāo)象限潛伏期4.65±0.533.91±0.665.48±1.924.22±0.83 平臺潛伏期13.93±3.6010.17±2.3416.39±3.566.47±1.30雌性 例數(shù)14131111 目標(biāo)象限耗時25.17±2.5729.88±2.9626.89±1.8124.12±3.01 目標(biāo)象限潛伏期4.41±0.824.81±0.473.93±0.826.54±1.00 平臺潛伏期9.02±2.0513.66±3.029.71±2.3614.84±3.72

表4 運(yùn)動對SD大鼠成年后水迷宮反向空間實驗的影響

表4 運(yùn)動對SD大鼠成年后水迷宮反向空間實驗的影響

注：與正常對照組比較，①P<0.05

分組正常對照組運(yùn)動組異氟烷組異氟烷運(yùn)動組雄性 例數(shù)11101210 目標(biāo)象限耗時21.69±1.8620.95±2.821.17±1.6220.36±1.78 目標(biāo)象限潛伏期4.09±0.313.34±0.544.15±0.343.81±0.43 平臺潛伏期23.84±8.2720.1±8.5431.55±8.7623.75±7.22雌性 例數(shù)14131111 目標(biāo)象限耗時25.58±1.1621.00±2.019.97±2.2①16.78±1.28 目標(biāo)象限潛伏期4.55±5.244.9±0.755.46±1.115.24±0.91 平臺潛伏期24.22±5.6227.03±6.6416.09±3.2229.13±4.83

2.4 運(yùn)動對多次異氟烷處理后不同性別大鼠海馬Ki-67，BDNF表達(dá)的影響 與非運(yùn)動組雄鼠比較，運(yùn)動組和異氟烷運(yùn)動組雄鼠海馬齒狀回中可見Ki-67和BDNF陽性表達(dá)增多(圖2A)。與異氟烷組相比，正常對照組及運(yùn)動組雌鼠海馬齒狀回中均有Ki-67的陽性表達(dá)，而異氟烷組未見K-i67陽性細(xì)胞表達(dá)(圖2B)。Western-Blot分析發(fā)現(xiàn)：與正常對照組相比，異氟烷組中雄鼠BDNF陽性表達(dá)水平較低；與異氟烷組相比，異氟烷運(yùn)動組雄鼠BDNF表達(dá)增多；未見明顯差異。與正常對照組相比，異氟烷組雌鼠中BDNF陽性表達(dá)水平均降低(P<0.05)；與異氟烷組相比，異氟烷運(yùn)動組雌鼠BDNF表達(dá)增多(P<0.05，圖2C、D，表5)。

圖2 運(yùn)動對雄、雌SD大鼠海馬組織Ki-67，BDNF表達(dá)的影響

表5 運(yùn)動對SD大鼠海馬組織BDNF表達(dá)的影響

表5 運(yùn)動對SD大鼠海馬組織BDNF表達(dá)的影響

注：與正常對照組比較，①P<0.05；與異氟烷組比較，②P<0.05

分組正常對照組運(yùn)動組異氟烷組異氟烷運(yùn)動組雄鼠0.65±0.000.38±0.180.41±0.090.45±0.02雌鼠0.66±0.090.52±0.170.30±0.07①0.67±0.15②

3討 論

有研究報道，全身麻醉藥物對發(fā)育期大腦可產(chǎn)生短暫或長期影響，稱為麻醉而致神經(jīng)發(fā)育毒性(anesthesia-induced developmental neurotoxicity, AIDN)[11]，其影響與大腦發(fā)育階段、藥物劑量、暴露時間及次數(shù)有關(guān)。發(fā)育早期(4歲以內(nèi))經(jīng)歷多次麻醉(3次)及手術(shù)暴露的兒童，認(rèn)知損害風(fēng)險增高[12]。但全身麻醉藥物對發(fā)育期不同性別間動物認(rèn)知功能的影響鮮少報道。以往基礎(chǔ)研究多選用雄性動物，以避免雌孕激素水平波動而干擾實驗結(jié)果，但認(rèn)知水平的發(fā)展具有明顯性別差異[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，異氟烷多次處理對大鼠成年后空間認(rèn)知功能有一定影響，學(xué)習(xí)能力降低，雄鼠表現(xiàn)在長期記憶，雌鼠表現(xiàn)在工作記憶方面。同時發(fā)現(xiàn)，發(fā)育期規(guī)律運(yùn)動能夠促進(jìn)大鼠空間認(rèn)知功能的發(fā)育，且雄鼠的運(yùn)動獲益強(qiáng)于雌鼠。English等[14]也指出，在外周神經(jīng)損傷模型中，僅雄鼠在持續(xù)2周運(yùn)動訓(xùn)練后軸突再生明顯；Thompson等[15]在大鼠腦損傷研究中再次證實，雄鼠在持續(xù)平臺訓(xùn)練的運(yùn)動獲益優(yōu)于雌鼠，相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.1 異氟烷處理對大鼠成年后認(rèn)知功能的影響 出生后7 d大鼠腦組織處于發(fā)育高峰，神經(jīng)元樹突、軸突及神經(jīng)突觸可塑性較強(qiáng)[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，多次異氟烷處理對大鼠的空間記憶(八臂迷宮及水迷宮)有一定損害，尤其在八臂迷宮實驗的訓(xùn)練階段，不同性別異氟烷處理組大鼠學(xué)習(xí)能力均有所下降，盡管訓(xùn)練10次也達(dá)到測試標(biāo)準(zhǔn)，但學(xué)習(xí)次數(shù)與總耗時之間無穩(wěn)定的學(xué)習(xí)進(jìn)步曲線；而進(jìn)行規(guī)律運(yùn)動大鼠，其學(xué)習(xí)進(jìn)步曲線清晰，尤其是雄鼠在訓(xùn)練第2次即達(dá)到測試標(biāo)準(zhǔn)。Cao等[16]也發(fā)現(xiàn)，老齡鼠暴露在1.2%異氟烷后2 h，可導(dǎo)致其學(xué)習(xí)過程延長，認(rèn)知功能降低。另外還發(fā)現(xiàn)，異氟烷處理后大鼠參考記憶錯誤及總耗時均有所增加，提示大鼠的空間記憶中的長期記憶受到影響。隨后研究發(fā)現(xiàn)，異氟烷處理后成年大鼠海馬齒狀回BDNF陽性表達(dá)均減少，提示發(fā)育期異氟烷暴露對隨后大鼠的空間記憶編碼，聯(lián)想記憶等有一定影響[17-19]。

3.2 運(yùn)動對異氟烷處理大鼠成年后認(rèn)知的影響 運(yùn)動已被證實能夠促進(jìn)其認(rèn)知功能，能夠促進(jìn)大腦發(fā)育，智力水平，學(xué)習(xí)能力、執(zhí)行和閱讀能力[20-23]，以發(fā)育期尤為顯著。其機(jī)制與運(yùn)動促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)及神經(jīng)形成，神經(jīng)細(xì)胞增殖、樹突分枝形成、突觸發(fā)生、長時程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)和神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)水平升高等相關(guān)[5,6,24,25]。本研究發(fā)現(xiàn)：發(fā)育期進(jìn)行運(yùn)動的兩組大鼠在訓(xùn)練階段，運(yùn)動促進(jìn)大鼠在八臂迷宮中的表現(xiàn)，總耗時呈穩(wěn)定進(jìn)步趨勢，學(xué)習(xí)進(jìn)步曲線穩(wěn)定，且雄鼠獲益更明顯；然而，水迷宮的行為學(xué)測試中未發(fā)現(xiàn)運(yùn)動優(yōu)勢。盡管兩種行為學(xué)研究工具均是評測大鼠的空間認(rèn)知功能，但對于不同性別間的研究結(jié)果差異尚需進(jìn)一步探討。

3.3 運(yùn)動對異氟烷處理大鼠成年后海馬的影響 大腦海馬是與記憶相關(guān)的重要腦區(qū)，在空間記憶編碼、聯(lián)想記憶及學(xué)習(xí)能力方面起重要作用[18,19]，運(yùn)動引起海馬改變與空間記憶任務(wù)中表現(xiàn)提高直接相關(guān)。本研究免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，特異性海馬增殖指標(biāo)Ki-67，在雌雄大鼠運(yùn)動兩組(運(yùn)動組及異氟烷運(yùn)動組)的海馬齒狀回中表達(dá)增多，提示該區(qū)域細(xì)胞增殖活躍。與Sakalem 等[26]研究一致，運(yùn)動及環(huán)境富集刺激可提高海馬細(xì)胞和神經(jīng)元的總體數(shù)量，從而提高空間記憶能力。大鼠在發(fā)育期進(jìn)行規(guī)律運(yùn)動，運(yùn)動強(qiáng)度逐漸增加至中等強(qiáng)度，對其成年后認(rèn)知功能有一定促進(jìn)作用，與異氟烷組比較，異氟烷運(yùn)動組大鼠BDNF表達(dá)也呈現(xiàn)增多趨勢。進(jìn)一步證實，運(yùn)動改善認(rèn)知能力與BDNF水平升高相關(guān)。

此外，我們將異氟烷和運(yùn)動對大鼠成年后認(rèn)知的影響分為學(xué)習(xí)和記憶兩個階段分別進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)異氟烷處理影響大鼠的學(xué)習(xí)能力，與梅奧醫(yī)學(xué)中心發(fā)表的MASK臨床研究結(jié)果相呼應(yīng)[27]，該研究發(fā)現(xiàn)多次接受全身麻醉的患兒的問題處理速度和精細(xì)運(yùn)動能力下降。本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動能夠改善異氟烷所造成的損害，這可能為未來進(jìn)行認(rèn)知功能改善提供參考。

綜上，多次異氟烷處理對大鼠成年后學(xué)習(xí)認(rèn)知功能有一定影響，且存在性別差異；雄鼠在長期記憶，而雌鼠在工作記憶方面有一定損害。同時發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動促進(jìn)大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知功能的發(fā)育，且雄鼠的運(yùn)動獲益更為明顯。