林晉雨, 何 橋, 王 斌, 楊銀華, 楊春平, 陳華保, 樂貴洲

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院四川 成都 611130; 2. 四川農(nóng)業(yè)大學 理學院,四川 成都 611130)

仿生合成是開發(fā)新型化學和生物農(nóng)藥的重要途徑之一[1]。目前,研究人員已通過仿生合成成功開發(fā)出多種新產(chǎn)品,例如從蘑菇提取的化合物出發(fā)合成的嘧菌酯[2]。從植物中尋找抗真菌活性物質(zhì)是開發(fā)新型殺菌劑的有效策略,例如從天然植物中提取的光甘草定是光果甘草中的主要黃酮類成分之一,其骨架為2-苯基色原酮結構。光甘草定及其衍生物都是以C6—C3—C6為基本碳架的化合物[3](圖Chart 1)。

Chart 1

Scheme 1

據(jù)文獻報道,光甘草定的應用主要集中于醫(yī)藥領域且具有極高的藥用價值[4],如作為抗炎劑、用于抑制酶活性、抑制黑色素生成和抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等[5-8]。目前,研究人員在對光甘草定的提取工藝、抗腫瘤研究和活性成分化合物的分離分析等方面[9-11]已取得較豐富的成果,但在農(nóng)藥領域的應用報道較少。

徐曙等發(fā)現(xiàn)光甘草定對部分植物病原真菌有明顯的抑制作用[12],因此推斷光甘草定類似物具有潛在的殺菌劑應用價值。本文在Stein等[13]報道的合成化合物方法的基礎上,以廉價易得的水楊醇及α-溴代苯乙酮為原料,通過條件優(yōu)化,反應合成了12個異黃烯衍生化合物5a～5l(Scheme 1),并采用抑制菌絲生長速率法測試了化合物對真菌活性的抑制作用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

bruker avance neo 400M型核磁共振波譜儀(CDCl3為溶劑,TMS為內(nèi)標);Agilent Technologies 6224 TOF LC/MS型質(zhì)譜儀。

柱層析硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)高效薄層層析板(煙臺市芝罘黃務廠);草莓灰霉病菌、禾谷鐮刀菌、馬鈴薯早疫病菌、煙草赤星病菌(四川農(nóng)業(yè)大學無公害農(nóng)藥研究實驗室);所用試劑均為分析純或化學純試劑。

1.2 合成

(1) 中間體3的合成

在干燥的50 mL兩頸燒瓶中通入氬氣置換,將鄰羥基苯甲醇(3.0 mmol, 1.0 eq.)、碳酸鉀(3.3 mmol, 1.1 eq.)溶于丙酮(10 mL),攪拌下反應1 h。隨后加入2-溴苯乙酮(3.5 mmol, 1.2 eq.),升溫至回流,攪拌下反應3 h(薄層層析檢測顯示反應完全)。過濾取濾液旋干,殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:乙酸乙酯 ∶石油醚=1∶3,V∶V)純化得中間體3。

3a:[CAS: 109790-47-8]; 收率64%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.95(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.62(t,J=7.6 Hz, 1H), 7.49(t,J=7.6 Hz, 2H), 7.30(d,J=1.2 Hz, 4H), 7.23(t,J=8.0 Hz, 1H), 6.97(t,J=7.6 Hz, 1H), 6.84(d,J=8.4 Hz, 1H), 5.38(s, 2H), 4.75(s, 2H)。

3b:[CAS: 109790-49-0];收率48%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.93(d,J=8.8 Hz, 2H), 7.50(d,J=8.8 Hz, 2H), 7.33(dd,J=7.2 Hz, 1.6 Hz, 1H), 7.26(td,J=8.0 Hz, 1.6 Hz, 1H), 7.00(ψt,J=7.2 Hz, 1H), 6.85(d,J=8.0 Hz, 1H), 5.36(s, 2H), 4.77(s, 2H), 3.48(br s, 1H)。

3c:[CAS: 109790-51-4];收率59%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.91～7.94(m, 2H), 7.47～7.51(m, 2H), 7.31～7.33(m, 1H), 7.26～7.27(m, 1H), 7.23～7.25(m, 1H), 6.97～7.02(m, 1H), 6.84(d,J=8.0 Hz, 1H), 5.35(s, 2H), 4.76(s, 2H)。

3d:收率60%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.97～7.95(m, 2H), 7.64(ψt,J=7.6 Hz, 1.6 Hz, 2H), 7.54～7.50(m, 2H), 7.07(dd,J=8.4 Hz, 3.2 Hz, 1H), 6.91(td,J=8.4 Hz, 3.2 Hz, 1H), 6.79(dd,J=9.0 Hz, 4.2 Hz, 1H), 5.38(s, 2H), 4.74(d,J=4.0 Hz, 1H), 3.44(br s, 1H);13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 194.7, 152.1(d), 134.3, 134.1, 132.3(d), 129.0, 127.9, 116.1, 115.9, 114.4(d), 113.0(d), 71.1, 61.2; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H13O3FNa{[M+Na]+}283.0746, found 283.08149。

3e:收率72%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.92(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.51(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.09(d,J=6.4 Hz, 1H), 6.93(s, 1H), 6.80(s, 1H), 5.35(s, 2H), 4.75(s, 2H), 3.41(br s, 1H);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 194.4, 151.1, 139.1, 133.5, 130.4, 130.3, 129.5, 113.3, 71.3, 58.0; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H12O3FClNa{[M+Na]+}317.0357, found 317.04340。

3f:收率38%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.84～7.82(m, 2H), 7.67～7.65(m, 2H), 7.08(dd,J=8.6 Hz, 3.0 Hz, 1H), 6.91(td,J=8.6 Hz, 3.0 Hz, 1H), 6.77(dd,J=8.8 Hz, 4.0 Hz, 1H), 5.32(s, 2H), 4.73(d,J=4.0 Hz, 1H), 3.28(br s, 1H);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 194.5, 151.1, 133.8, 133.7(d), 132.3, 130.4, 128.4, 113.8, 113.6, 113.4, 113.3(d), 71.3, 58.1; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H12O3FBrNa{[M+Na]+}360.9852, found 360.9944。

3g:[CAS: 109790-48-9];收率55%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.82～7.84(m, 2H), 7.65～7.68(m, 2H), 7.32(d,J=2.8 Hz, 1H), 7.19(dd,J=2.8 Hz, 2.0 Hz), 6.75(d,J=8.8 Hz, 1H), 5.33(s, 2H), 4.72(s, 2H)。

3h:[CAS: 109790-50-3];收率42%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.91(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.50(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.32(d,J=2.8 Hz, 1H), 7.20(dd,J=8.6 Hz, 2.6 Hz), 6.76(d,J=8.4 Hz, 1H), 5.34(s, 2H), 4.72(s, 2H). 3.21(br s, 1H)。

3i:[CAS: 109790-53-6];收率34%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.82(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.66(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.32(d,J=2.8 Hz, 1H), 7.18(dd,J=8.6 Hz, 2.6 Hz), 6.75(d,J=8.8 Hz, 1H), 5.32(s, 2H), 4.71(d,J=0.8 Hz, 2H), 3.26(br s, 1H)。

3j:[CAS: 133308-49-3];收率72%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.96～7.94(m, 2H), 7.67～7.62(m, 1H), 7.54～7.50(m, 2H), 7.45(d,J=2.4 Hz, 1H), 7.33(dd,J=8.6 Hz, 2.6 Hz), 6.72(d,J=8.8 Hz, 1H), 5.38(s, 2H), 4.72(s, 2H), 3.40(br s, 1H)。

3k:收率51%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.92～7.89(m, 2H), 7.51～7.46(m, 2H), 7.45(d,J=2.4 Hz, 1H), 7.34(dd,J=8.6 Hz, 2.6 Hz), 6.71(d,J=8.8 Hz, 1H), 5.33(s, 2H), 4.71(s, 2H), 3.22(br s, 1H);13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 193.0, 155.1, 140.9, 132.4(d), 132.2(d), 131.5, 131.3, 129.4(d), 129.3(d), 114.3, 113.4(d), 70.6, 61.6(t); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H12O3ClBrNa{[M+Na]+}376.9556, found 376.96521。

3l:收率46%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.83～7.80(m, 2H), 7.67～7.64(m, 2H), 7.45(d,J=2.4 Hz, 1H), 7.32(dd,J=8.6 Hz, 2.6 Hz), 6.69(d,J=8.8 Hz, 1H), 5.31(s, 2H), 4.71(s, 2H), 3.29(br s, 1H);13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 193.3, 155.1, 132.7, 132.5(d), 132.3(d), 132.1, 131.4(d), 129.7, 129.4(d), 114.3, 113.4(d), 70.6, 61.3; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H12O3Br2Na{[M+Na]+}422.9030, found 422.91204。

(2) 中間體4的合成

在干燥的50 mL兩頸燒瓶中通入氬氣置換,依次加入中間體3(2.0 mmol, 1.0 eq.)、 PPh3·HBr(2.2 mmol, 1.1 eq.)及乙腈(10 mL),所得溶液于90 ℃條件下攪拌下反應3 h(薄層層析檢測顯示反應完全)。冷卻至室溫后,乙醚洗滌過濾,得到鏻鹽4,并直接用于下一步反應,無需純化。

(3) 異黃烯衍生物5的合成

在干燥的50 mL兩頸燒瓶中通入氬氣置換,依次加入中間體4(2.0mmol, 1.0 eq.)、乙醇鈉(2.2 mmol, 1.1eq.)及乙醇(10 mL),室溫下攪拌過夜,將所得溶液減壓濃縮。隨后加入稀鹽酸和鹽水,混合物用乙酸乙酯(5×25 mL)萃取,合并有機層,無水硫酸鎂干燥、過濾,取濾液旋干經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:乙酸乙酯 ∶石油醚=1 ∶6,V∶V)純化得到產(chǎn)物5。

5a:[CAS: 6054-00-8];收率76%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.41～7.44(m, 2H), 7.36～7.40(m, 2H), 7.28～7.33(m, 1H), 7.10～7.14(m, 1H), 7.07～7.09(m, 1H), 6.90(td,J=7.6 Hz, 1.2 Hz, 1H), 6.85(d,J=8.0 Hz, 1H), 6.80(s, 1H), 5.16(d,J=1.6 Hz, 2H)。

5b:[CAS: 77670-09-8];收率77%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.36(s, 4H), 7.14(td,J=7.6 Hz, 1.6 Hz, 1H), 7.09(d,J=2.0 Hz, 1.6 Hz, 1H), 6.92(td,J=7.6 Hz, 1.2 Hz, 1H), 6.85(d,J=8.0 Hz, 1H), 6.80(s, 1H), 5.13(d,J=1.2 Hz, 2H)。

5c:[CAS: 109790-38-7];收率69%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.36(s, 4H), 7.12～7.15(m, 1H), 7.08～7.10(m, 1H), 6.92(td,J=7.2 Hz, 0.8 Hz, 1H), 6.85(d,J=8.0 Hz, 1H), 6.80(s, 1H), 5.13(d,J=1.2 Hz, 2H)。

5d:收率60%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.45～7.39(m, 2H), 7.42～7.39(m, 2H), 7.34(tt,J=7.2 Hz, 1.5 Hz, 1H), 6.84～6.79(m, 3H), 6.75(s, 1H), 5.14(d,J=1.2 Hz, 2H);13C NMR(150 MHz, CDCl3)δ: 149.1, 136.3, 133.5, 128.8(d), 128.4(d), 125.0(d), 124.8, 124.1(d), 119.5(d), 116.3(t), 115.0(d), 113.0(q), 67.3(t); HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H11NFO{M+}226.0794, found 226.0753。

5e:收率73%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.38(td,J=4.0 Hz, 8.0 Hz, 4H), 6.88～6.80(m, 3H), 6.74(s, 1H), 5.11(s, 2H);13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 158.9 , 156.5, 149.1, 134.7, 134.2, 132.2, 126.1, 123.7, 119.3(d), 116.4(d), 115.3(d), 113.09(d), 67.0; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H11ClFO{[M+H]+}261.0482, found 261.0289。

5f:收率49%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.38～7.44(m, 4H), 7.32～7.36(m, 1H), 7.20～7.22(m, 2H), 6.74(s, 1H), 6.72(s, 1H), 5.17(d,J=1.2 Hz, 2H);13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 149.1(d), 135.2, 132.2, 126.4, 123.8(d), 122.4, 120.0(d), 116.4(d), 115.5, 115.2, 113.1(d), 67.0; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H11BrFO{[M+H]+}304.9977, found 304.9775。

5g:[CAS: 88040-01-1];收率30%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.39～7.45(m, 4H), 7.32～7.36(m, 1H), 7.06～7.08(m, 2H), 6.77～6.80(m, 1H), 6.73(s, 1H), 5.16(d,J=1.2 Hz, 2H)。

5h:[CAS: 109790-37-6];收率21%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.33～7.39(m, 4H), 7.05～7.09(m, 2H), 6.78(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.71(s, 1H), 5.12(d,J=1.2 Hz, 2H)。

5i:[CAS: 109790-40-1];收率67%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.50～7.53(m, 2H), 7.25～7.29(m, 2H), 7.04～7.09(m, 2H), 6.77(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.71(s, 1H), 5.11(d,J=1.6 Hz, 2H)。

5j:[CAS: 128723-62-6];收率91%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.38～7.44(m, 4H), 7.32～7.36(m, 1H), 7.20～7.22(m, 2H), 6.74(s, 1H), 6.72(s, 1H), 5.17(d,J=1.2 Hz, 2H);13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 152.3, 136.2, 133.1, 132.0, 131.5, 131.5, 128.9, 128.8, 128.5, 125.8, 124.8, 118.9, 117.2, 113.4, 67.3; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H12BrO{[M+H]+}287.0072, found 286.9889。

5k:收率40%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.32～7.38(m, 4H), 7.18～7.26(m, 2H), 6.72(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.70(s, 1H), 5.12(d,J=1.2 Hz, 2H);13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 152.3, 134.7, 134.3, 131.8, 129.4, 129.0, 126.1, 124.6, 119.4, 117.3, 113.7, 67.0; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C15H11BrClO{[M+H]+}320.9682, found 320.9483。

5l:[CAS: 109790-39-8];收率61%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.50～7.53(m, 2H), 7.28～7.29(m, 1H), 7.26～7.27(m, 1H), 7.19～7.23(m, 2H), 6.71～6.74(m, 2H), 5.12(d,J=1.2 Hz, 2H)。

1.3 抑菌活性測試

采用菌絲生長速率抑制法測試了目標化合物對草莓灰霉病菌、禾谷鐮刀菌、馬鈴薯早疫病菌和煙草赤星病菌的抑菌活性。以0.1%吐溫-20為溶劑,將樣品配制成400 mg/L的溶液,吸取1 mL樣品溶液與9 mL對苯二胺混合倒入培養(yǎng)皿中制成培養(yǎng)基,滅菌、接種。于適溫下孵育4 d,通過交叉雜交方法擴大病原體的直徑,重復3次獲得菌絲體的生長抑制率。吐溫-20(0.1%)為溶劑的光甘草定(400 mg/L)溶液作為對照。

2 結果與討論

2.1 合成

根據(jù)Stein的文獻報道,最初以未取代的水楊醇1a及α-溴代苯乙酮1b為底物,按照文獻的條件(丙酮/60 ℃)進行親核取代反應,獲得的收率為中等,僅有56%(表1)。隨后對該反應條件進行了優(yōu)化,在溶劑和溫度不變的條件下,考察了另外3種堿對反應的影響都沒有碳酸鉀的效果好。接著以碳酸鉀為反應堿,同時考察了溶劑及溫度對反應的影響,結果發(fā)現(xiàn)在丙酮中反應的溫度越低,收率越高,在室溫下可以獲得70%的收率。其它的溶劑N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷及四氫呋喃等反應效果都很差(表2)。綜合表1及表2的數(shù)據(jù),最終選擇碳酸鉀作反應堿,丙酮作溶劑,于室溫下進行反應。

表1 堿對反應的影響

表2 溶劑和溫度對反應的影響

隨后以該條件,擴展其它取代基的水楊醇1及α-溴代苯乙酮2,以34%～72%的收率得到{1-芳基-2-(鄰羥甲基)苯氧基苯乙酮}3。隨后,將化合物3加入到乙腈中加熱回流,冷卻后過濾即獲得相應的三苯基溴化鏻鹽4。室溫下化合物4在乙醇鈉的乙醇溶液中發(fā)生分子內(nèi)的維蒂希反應,經(jīng)兩步反應以21%～91%的收率獲得化合物5。

表3 光甘草定及其類似物的體外抑制真菌活性

2.2 抑菌活性

化合物的抑菌活性如表3所示,所有的化合物對草莓灰霉病菌、禾谷鐮刀菌、馬鈴薯早疫病菌和煙草赤星病菌都表現(xiàn)出不同程度的抑制活性?；衔?j和5k對灰霉病菌的抑制率分別為60.0%和68.4%,與光甘草定效果相當且明顯高于其他化合物,這表明在R位上溴取代苯并吡喃的前提下在苯環(huán)上引入氯原子或不引入都會增加化合物對草莓灰霉病菌的抑制效果,且氯原子取代比氫的作用效果稍好一些;所有化合物對禾谷鐮刀病菌的抑制率為4.9%～51.6%,均低于光甘草定相對應的抑制效果,以此看來在苯并吡喃和苯環(huán)上引入鹵素原子并不能提高化合物對禾谷鐮刀病菌的抑制能力。尤其值得注意的是,化合物5g對馬鈴薯早疫病菌的抑制作用達到了85.0%,且顯著高于光甘草定(61.9%),5j的效果與光甘草定相當,表明當苯環(huán)不引入原子時苯并吡喃上引入氯原子或溴原子均能增加化合物抑制馬鈴薯早疫病菌的效果,且氯原子的引入顯著提高了化合物抑制馬鈴薯早疫病菌的效果。化合物5i對煙草赤星病菌的抑制率達到了64.1%,與其它化合物差異顯著,可得出氯原子和溴原子分別引入到苯并吡喃和苯環(huán)上對煙草赤星病菌有一定抑制活性,但稍低于光甘草定。結果表明,3-芳基異黃酮類化合物具有一定的抑菌活性,對不同真菌的抑制作用差異較大,部分可作為新型殺菌劑的先導化合物,進一步優(yōu)化研究。

以鄰羥基苯甲醇為起始原料,通過親核取代、季磷鹽化和分子內(nèi)維蒂希反應合成了12個3-芳基異黃烯衍生物,并測試了合成物對草莓灰霉病菌、西瓜枯萎病菌、馬鈴薯早疫病菌和煙草赤星病菌的抑真菌活性。結果表明,部分化合物對草莓灰霉病菌、禾谷鐮刀菌、馬鈴薯早疫病菌和煙草赤星病菌有一定抑制作用。后續(xù)將擴大試驗病菌種類,考察化合物的抑菌活性。