李汭澧，齊曉婭，武明星，梅 英△

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 1.健康管理(體檢)中心；2.眼科，重慶 400010)

健康的角膜是透明且無血管的，如果出現(xiàn)由新生血管發(fā)展導致的病理變化即為角膜新生血管(corneal neovascularization,CRNV)[1-2]，CRNV發(fā)生通常由外傷、缺氧、炎癥等引起[3]，盡管近年來CRNV治療取得了較大進展，但現(xiàn)階段尚無安全有效的治療方案，因此，探索CRNV的可能發(fā)病機制對其進一步診斷和治療至關重要。

蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)是調(diào)節(jié)細胞增殖、分化的常見信號轉(zhuǎn)導蛋白，參與了血管生成的生理和病理過程[4]，SHEN等[5]研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇肌酶(PI3K)/Akt信號通路與CRNV發(fā)生發(fā)展有關。

微RNA(microRNA，miR)是一類內(nèi)源性非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達，從而參與多種病理進程。已有研究證實miRNA在新生血管性眼病發(fā)病機制中扮演重要角色。如在人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs) 株中，miR-1275和miR-1246可以通過抑制血管內(nèi)皮生長因子B(vascular endothelial growth factor B,VEGF-B)和核因子-κB激活蛋白(NKAP) 來調(diào)節(jié)與血管生成相關的因子活性[6]。本研究前期通過TargetScan 軟件預測發(fā)現(xiàn)Akt2的3′-UTR與miR-148-3p存在結合位點。雖有研究證明多種miR與新生血管性眼病相關，但miR-148-3p作用尚未明確。本研究旨在觀察miR-148-3p抑制劑(inhibitor)在調(diào)節(jié)模擬角膜新生血管形成常見體外細胞模型HUVECs[7]的增殖機制，分析miR-148-3p inhibitor可能通過調(diào)控 Akt2 的表達對 HUVECs 增殖能力影響，進而揭示miR-148-3p在CRNV中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

HUVECs購自中國科學院上海細胞庫，DMEM培養(yǎng)基、miR-148-3p inhibitor、過表達Akt2質(zhì)粒載體及各自陰性對照、實時熒光定量PCR(qRT-PCR()試劑盒、BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒、電化學發(fā)光(ECL)發(fā)生液、TRIzol?試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司。CCK-8試劑盒、Akt2及GAPDH一抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和分組

HUVECs置于37 ℃含95% N2和5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，使用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細胞生長融合度至70%時，按照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000試劑盒說明書對細胞進行轉(zhuǎn)染。為了探究miR-148-3p對HUVECs增殖能力的影響，將HUVECs分為：空白對照組(HUVECs不作任何處理)、NC inhibitor組(轉(zhuǎn)染NC inhibitor)、miR-148-3p inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-148-3p inhibitor)。為了探究miR-148-3p和Akt2 對HUVECs增殖能力的影響，將HUVECs分為：NC組(轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒Akt2的陰性對照)、Akt2組(轉(zhuǎn)染過表達Akt2質(zhì)粒)、NC inhibitor組、miR-148-3p inhibitor組、miR-148-3p inhibitor+Akt2 組(共轉(zhuǎn)染miR-148-3p inhibitor和過表達Akt2質(zhì)粒)。

1.2.2qRT-PCR實驗

使用TRizol從各組細胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說明書進行PCR反應，U6作為miR-148-3p的表達內(nèi)參，GAPDH作為Akt2 mRNA的表達內(nèi)參。實驗重復3次。擴增基因及引物序列見表1。反應條件：95 ℃預變性10 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次。反應體系為20 μL:2×SYBR Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，10×cDNA 模板1 μL，H2O 8 μL。

1.2.3CCK-8實驗

HUVECs接種于96孔板，調(diào)整密度為1×105/mL，常規(guī)培養(yǎng)24、48、72、96 h后檢測細胞增殖情況，每孔加入10 μL CCK-8溶液，室溫5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h后，酶標儀測定450 nm處的吸光度(A)值。實驗重復3次。

1.2.4末端DNA轉(zhuǎn)移酶dUPT缺口末端標記(TUNEL)實驗

收集細胞，用4%多聚甲醛固定細胞30～60 min，加入含0.1% Triton X-100的PBS冰浴2 min。在用甲醇配制的0.3%過氧化氫溶液室溫孵育20 min。在樣品上加50 μL生物素標記液，37 ℃孵育60 min。滴加0.1～0.3 mL反應終止液，室溫孵育10 min。在樣品上加50 μL Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30 min。滴加 0.2～0.5 mL DAB顯色液，室溫孵育5～30 min或根據(jù)顯色情況孵育適當時間。用蘇木素染液進行細胞核染色。95%乙醇脫水5 min，再用100%乙醇脫水2次，每次約3 min，再用二甲苯透明 2次，每次5 min，隨后封片觀察。TUNEL染色標本根據(jù)陽性細胞分布情況，選擇2個陽性視野，計數(shù) 200 個細胞中陽性細胞數(shù)占比作為凋亡指數(shù)(AI)并進行統(tǒng)計。實驗重復3次。

表1 擴增基因及引物序列

1.2.5miR-148-3p和Akt2的結合位點預測及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C

使用TargetScan數(shù)據(jù)庫預測miR-148-3p和Akt2的結合位點 (http://www.targetscan.org/vert_71/)。構建Akt2野生型3′-UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒pMIR-Akt2-wt和突變型3′-UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒pMIR-Akt2-Mut。將pMIR-Akt2-wt或pMIR-Akt2-Mut與NC-inhibitor或miR-148-3p inhibitor共轉(zhuǎn)染進HUVECs。轉(zhuǎn)染24 h后，使用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，實驗重復3次。

1.2.6蛋白免疫印跡法(Western blot)實驗

采用RIPA裂解液提取HUVECs總蛋白，遵照BCA法測定蛋白濃度，變性蛋白。每泳道加入50 μg總蛋白，用12% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。加入一抗Akt2抗體(1∶500)，GAPDH抗體(1∶1 000)，GAPDH為內(nèi)參。4 ℃孵育過夜。加入HRP標記的兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h。ECL液暗室發(fā)光顯影，采集圖像并分析。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 miR-148-3p inhibitor抑制HUVECs的增殖能力

CCK-8實驗結果顯示，常規(guī)培養(yǎng)24 h時，空白對照組、NC inhibitor組、miR-148-3p inhibitor組的細胞增殖能力(A值)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；常規(guī)培養(yǎng)48、72、96 h時，miR-148-3p inhibitor組的細胞增殖能力(A值)明顯低于空白對照組、NC inhibitor組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 miR-148-3p inhibitor對HUVECs增殖能力的影響

2.2 miR-148-3p inhibitor下調(diào)HUVECs中Akt2表達

TargetScan篩選結果顯示，miR-148-3p在Akt2的3′-UTR上具有潛在的結合位點(圖2A)，qRT-PCR結果顯示，轉(zhuǎn)染miR-148-3p inhibitor后，細胞中miR-148-3p的表達(0.29±0.03)明顯低于NC inhibitor組的(1.00±0.05)，差異有統(tǒng)計學意義(t=21.090，P<0.001)，見圖2B，證明轉(zhuǎn)染成功。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y果顯示，miR-148-3p inhibitor組pMIR-Akt2-wt質(zhì)粒熒光素酶活性(26.41±3.01)與NC inhibitor組(25.37±2.41)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，miR-148-3p inhibitor組pMIR-Akt2-Mut質(zhì)粒熒光素酶活性為(26.45±2.03)，NC inhibitor組熒光素酶活性為(25.13±2.31)，2組熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2C。因此Akt2非miR-148-3p直接靶基因。但Western blot檢測結果表明，miR-148-3p inhibitor組Akt2表達水平為(0.14±0.03)，明顯低于NC inhibitor組的0.87±0.12(t=10.222，P<0.05)，見圖2D，提示miR-148-3p抑制劑可負調(diào)控Akt2表達。

2.3 過表達Akt2促進HUVECs增殖并抑制凋亡

采用CCK-8法檢測Akt2對細胞增殖能力的影響，結果顯示，Akt2組除24 h外，其余各時間點的細胞增殖能力(A值)均明顯高于NC組(P<0.05),見表1。TUNEL實驗結果顯示，與NC組(0.72±0.14)比較，Akt2組(0.41±0.08)HUVECs的AI值減少(P<0.01)，見表1、圖3。

A：TargetScan生信圖；B：轉(zhuǎn)染實驗；C：雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?；D：Western blot；a：P<0.01，與NC inhibitor組比較。

表1 各組HUVECs細胞增殖能力(A值)、AI值比較

圖3 過表達Akt2抑制HUVECs凋亡

2.4 miR-148-3p inhibitor通過下調(diào)Akt2表達，抑制HUVECs增殖并促進凋亡

采用CCK-8法檢測miR-148-3p inhibitor和Akt2對細胞增殖能力(A值)的影響，結果顯示，與NC inhibitor組比較，miR-148-3p inhibitor組24、48、72、96 h時增殖能力降低；而miR-148-3p inhibitor +Akt2組各個時間節(jié)點的HUVECs 增殖能力均不同程度高于miR-148-3p inhibitor組，見表2。TUNEL實驗結果顯示，與NC inhibitor組比較，miR-148-3p inhibtior組HUVECs的AI值增加(P<0.01)，miR-148-3p inhibitor+Akt2組的AI值明顯低于miR-148-3p inhibtior組(P<0.01)，見表2、圖4。

圖4 miR-148-3p調(diào)控 Akt2 影響HUVECs凋亡能力

表2 各組HUVECs細胞增殖能力(A值)、AI值比較

3 討 論

CRNV作為常見的眼部疾病，近年越來越多的研究集中在新生血管形成的機制上[8]。HUVECs可用來模擬CRNV形成，徐萌等[9]使用HUVECs探究馬錢子堿對血管形成活性物質(zhì)的抑制作用；BAI等[10]用VEGF刺激人臍HUVECs體外誘導CRNV細胞，從而探究長鏈非編碼RNA(lncRNA) MIAT 在抑制角膜血管生成的作用。

近年，miR被證實參與了眼部疾病的發(fā)生發(fā)展，尤其是與血管新生相關，既往研究顯示miR-148-3p與炎癥、免疫、血管生成等生理病理過程相關[11-12]，但miR-148-3p在CRNV中的具體作用效果和相關機制卻鮮有報道。本研究利用CRNV形成常見體外細胞模型HUVECs，分析miR-148-3p的差異表達對CRNV的作用機制，即miR-148-3p對CRNV是否具有重要調(diào)控作用。本研究結果顯示，下調(diào)miR-148-3p能抑制HUVECs的增殖能力，同時能促進細胞凋亡。

Akt作為常見信號轉(zhuǎn)導蛋白，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、血管生成等生理和病理過程。SAMAKOVA等[13]研究發(fā)現(xiàn)，缺血時PI3K/Akt通路與血管生成、氧化應激及間充質(zhì)干細胞存活相關；有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21通過 PI3K/Akt/VEGF通路抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞生長和血管生成[14]。與以往高質(zhì)量研究結果類似，本研究發(fā)現(xiàn)過表達Akt2明顯促進了HUVECs增殖，同時抑制了HUVECs的凋亡。

為了進一步探究miR-148-3p對Akt2的調(diào)控機制[15]，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)Akt2可能是 miR-148-3p潛在靶點，但miR-148-3p抑制劑對 Akt2 的雙熒光素酶強度無明顯影響，因此說明Akt2可能不是miR-148-3p的直接靶點，但Western blot初步證實miR-148-3p抑制劑可負調(diào)控Akt2表達。

本文利用CRNV形成常見體外細胞模型HUVECs進一步探究miR-148-3p和Akt2對HUVECs增殖和凋亡的影響，初步證實miR-148-3p inhibitor可通過下調(diào)Akt2的表達抑制HUVECs增殖，隨后采用TUNEL實驗進行驗證，發(fā)現(xiàn)miR-148-3p inhibtior可以促進HUVECs凋亡，Akt2組明顯抑制了HUVECs的凋亡，而Akt2抑制了miR-148-3p inhibitor促進HUVECs 凋亡的能力。

綜上，此次研究利用CRNV形成常見體外細胞模型HUVECs，分析了miR-148-3p對CRNV的影響，在體外驗證了miR-148-3p inhibtior通過下調(diào)Akt2 的表達對CRNV形成有抑制作用。目前，臨床治療CRNV的藥物較多，部分藥物可通過調(diào)控某些miR來實現(xiàn)對CRNV的抑制。本研究結論為CRNV的治療靶點選擇提供了新的參考和客觀依據(jù)。然而，本研究為體外實驗研究，人體內(nèi)源性miR-148-3p在角膜血管化中的具體作用過程較為復雜，涉及多條信號傳導通路，且各種miR間可能存在相互影響，一種miR有可能通過調(diào)節(jié)另外一種miR的表達而發(fā)揮相關的調(diào)節(jié)作用。由于客觀條件的限制，本研究僅探索了miR-148-3p這一單一miR對HUVECs增殖、凋亡的影響，在后續(xù)的研究中將拓展研究范圍和深度，進一步分析miR在CRNV中的作用效果及相關機制。