張鶴令，景青玲，宗群川

（青海大學(xué)附屬醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科，青海 西寧 810001）

骨折愈合受成骨能力、力學(xué)環(huán)境、血供等多種因素影響，愈合延遲或不愈合將嚴(yán)重影響患者肢體功能恢復(fù)及生活質(zhì)量。因此，探尋促進(jìn)骨折愈合的有效方式在創(chuàng)傷骨科備受關(guān)注[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell,MSC）來(lái)源的外泌體（Exosomes,Exos）是一種由細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡，富含生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，是介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，傳遞基質(zhì)與癌細(xì)胞間物質(zhì)的重要運(yùn)輸載體，其通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)miRNA、mRNA、脂質(zhì)及特異性蛋白，參與內(nèi)環(huán)境與細(xì)胞間的信號(hào)傳遞、物質(zhì)運(yùn)輸，并通過(guò)調(diào)節(jié)受體細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)影響其生理行為。相較于骨髓MSC，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSC）具有來(lái)源豐富、無(wú)倫理爭(zhēng)議、免疫原性低及提取方便等優(yōu)勢(shì)，因而成為Exos 的主要來(lái)源之一[2-3]。有體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，hucMSC-Exos 對(duì)小鼠成骨前體細(xì)胞的增殖與分化具有促進(jìn)作用，提示其在骨折治療方面的潛能[4]。目前，有學(xué)者鑒定出多種信號(hào)通路參與成骨，其中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是骨穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，激活該通路可顯著降低骨吸收并促進(jìn)骨形成，β-catenin 可通過(guò)結(jié)合核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子改變DNA 結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)下游Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）等靶向基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及分化。本研究選取小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1 制備外泌體，復(fù)制股骨干骨折大鼠模型進(jìn)行體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察hucMSCExos 對(duì)其愈合的影響，并探討Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在該過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)SD 大鼠40 只，雄性，8 周齡，體重（300±20）g，購(gòu)自北京安凱毅博生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（青）2021-0002]。本研究經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑hucMSC（上海雅吉生物科技有限公司），小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1（賽業(yè)生物科技有限公司），Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制劑XAV939（美國(guó)MedChem Express 公司），兔抗人腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101,TSG101）、浮艦蛋白-1（Flotillin-1）、CD9、β-catenin、p-β-catenin、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β）、Runx2一抗（美國(guó)AbMART 公司）。

1.1.3 主要儀器JEM-2100Plus 透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社），數(shù)字化X 線(xiàn)攝片機(jī)（美國(guó)Hologic 公司），vivaCT40 型MicroCT（瑞士SCANCO Medical AG 公司），TECELF 3200 力學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器（美國(guó)Endura 公司），SZX10 顯微鏡（日本Olympus 株式會(huì)社）。

1.2 外泌體制備

hucMSC 培養(yǎng)于L-15 培養(yǎng)基中[含10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、1%雙抗]，取第3 代hucMSC，培養(yǎng)于高糖DMEM 培養(yǎng)液中（含10%FBS），待融合至75%，更換為無(wú)外泌體FBS 血清培養(yǎng)48 h，棄上清液，移至離心管，充分洗滌，離心棄沉淀，再次離心，4℃過(guò)夜，取沉淀即為hucMSC-Exos。取hucMSC-Exos 10 μL，滴至載樣銅網(wǎng)，靜置2 min，濾紙去浮液，1%磷鎢酸溶液染色5 min，透射電鏡觀察hucMSC-Exos形態(tài)。

取hucMSC-Exos 50 μL，離心棄上清液，冰上裂解，離心取上清液，移至離心管，蛋白定量試劑盒定量，加入上樣緩沖液，沸水浴變性5 min。每孔40 μg上樣，電泳轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，加入兔抗人TSG101、Flotillin-1、CD9 一抗（1∶500），4℃孵育過(guò)夜，洗滌后加入山羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，Western blotting 檢測(cè)hucMSC-Exos 膜表面特異性標(biāo)志蛋白,凝膠成像系統(tǒng)分析。

將成骨細(xì)胞按2×103個(gè)/孔的密度接種于96 孔板，用含體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS、1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)液，在37℃，5%二氧化碳CO2條件下培育，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)80%左右時(shí)胰蛋白酶消化傳代，取第3 代細(xì)胞。將細(xì)胞分為空白組、干預(yù)組，空白組用無(wú)外泌體的FBS 配置α-MEM 培養(yǎng)液，干預(yù)組在α-MEM 培養(yǎng)液中加入10 mg/L FBS 外泌體。兩組均設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h 和72 h，加入新制備的0.5g/L MTT 溶液，每孔20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清液，每孔加入DMSO溶液150 μL，振蕩10 min，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，吸取上清液，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 處的光密度（optical density,OD）值。

1.3 動(dòng)物分組與處理

1.3.1 骨干骨折模型的復(fù)制腹腔注射麻醉大鼠，常規(guī)備皮，保持右側(cè)臥位。取右下肢股外側(cè)切口，剝離外皮，縱向切開(kāi)淺層與深層筋膜層，順股外側(cè)肌間隔進(jìn)行鈍性分離，暴露股骨干。在股骨中段前方最高點(diǎn)位置鋸缺損至骨髓腔（3 mm），形成股骨中段橫行骨折，沿髓腔插入克氏針直到貫穿整個(gè)股骨髓腔，固定骨折，剪除多余克氏針，將遠(yuǎn)端埋在骨皮質(zhì)下。常規(guī)縫合、抗感染。術(shù)后即刻拍攝X射線(xiàn)片，以股骨中段斜形或橫形骨折，骨折端內(nèi)固定效果理想，未發(fā)生明顯移位為骨干骨折模型復(fù)制成功[5]。

1.3.2 干預(yù)方法40 只大鼠復(fù)制股骨干骨折模型，成功30只，隨機(jī)分為對(duì)照組、外泌體組、復(fù)合組，各10 只。將水凝膠作為hucMSC-Exos 的載體，hucMSCExos 100 μg 溶于PBS 緩沖液50 μL 中。骨折后7 d，對(duì)照組經(jīng)皮從骨折斷端注射PBS 緩沖液50 μL、水凝 膠100 μL 至骨髓腔，cMSC-Exos 組同法注射hucMSC-Exos 100 μg、水凝膠100 μL 至骨髓腔[6]。復(fù)合組同法注射hucMSC-Exos 100μg、水凝膠100 μL至骨髓腔，腹腔注射Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制劑XAV939 DMSO 溶液5 mL（XAV939 劑量為1 mg/只）[7]。對(duì)照組、外泌體組腹腔注射DMSO溶液5 mL。

1.4 MicroCT掃描

干預(yù)后2周、4周行MicroCT掃描。采用CTAn軟件定量分析，計(jì)算骨小梁數(shù)量（trabecular number,Tb.N）及骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume/total volume,BV/TV）。

1.5 生物力學(xué)測(cè)試

末次MicroCT 掃描后，頸椎脫臼處死大鼠，剝離左下肢股骨，骨水泥固定兩端，采用力學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器行四點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，記錄最大載荷、最大載荷恢復(fù)率。

1.6 蘇木精-伊紅染色觀察大鼠骨痂組織病理變化及組織學(xué)評(píng)分

處死大鼠后，取骨折上下各5 mm×5 mm 骨痂組織，行常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染色，光鏡下觀察骨折愈合情況。組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分，骨折兩端界限清晰，無(wú)骨膜反應(yīng)；1 分，骨折兩端界限明顯，輕度骨膜反應(yīng)；2 分，骨折兩端界限模糊，可觀察到少量骨痂；3 分，骨折兩端界限接近于消失，可觀察到大量骨痂；4 分，骨折兩端無(wú)界限，骨痂填滿(mǎn)。

1.7 Western blotting 檢測(cè)大鼠骨痂組織βcatenin、p-β-catenin、GSK-3β、Runx2蛋白的表達(dá)

取骨折位置骨痂組織40 mg，加入生理鹽水充分研磨勻漿，RIPA 裂解，4℃離心，取上清液，定量蛋白，取微量蛋白樣本，混合4 倍體積上樣緩沖液，加熱變性蛋白，離心取上清液，行凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗大鼠βcatenin、p-β-catenin、GSK-3β、Runx2 一抗（1∶500），低溫?fù)u床過(guò)夜，加入二抗（1∶2 000）常溫孵育2 h，洗膜后經(jīng)ECL 發(fā)光、暗室顯影，以GAPDH為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定結(jié)果

透射電鏡觀察顯示，Exos 大小、分布不均，表現(xiàn)為類(lèi)圓形或圓形環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有雙圓盤(pán)結(jié)構(gòu)囊泡，直徑30～200 nm，符合Exos 特征。Western blotting 結(jié)果顯示，與全細(xì)胞蛋白裂解物比較，獲取的hucMSCExos 膜表面富含特異性標(biāo)志蛋白TSG101、Flotillin-1、CD9。見(jiàn)圖1、2。

圖1 hucMSC-Exos形態(tài)（透射電鏡×70 000）

圖2 hucMSC-Exos膜表面特異性標(biāo)志蛋白的表達(dá)

2.2 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Tb.N、BV/TV的變化

對(duì)照組、外泌體組、復(fù)合組大鼠干預(yù)后2 周、4 周的Tb.N、BV/TV 比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)Tb.N、BV/TV 有差異（F=23.584 和31.267，均P=0.000）；②3 組大鼠Tb.N、BV/TV 有差異（F=85.512 和54.796，均P=0.000），與對(duì)照組、復(fù)合組相比，外泌體組Tb.N 較多，BV/TV 較高，促進(jìn)骨折愈合效果相對(duì)較好；③3 組大鼠Tb.N、BV/TV 變化趨勢(shì)有差 異（F=19.417 和25.461，均P=0.000），見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Tb.N、BV/TV比較（n=10，）

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Tb.N、BV/TV比較（n=10，）

2.3 3組大鼠最大載荷、最大載荷恢復(fù)率比較

對(duì)照組、外泌體組、復(fù)合組大鼠最大載荷、最大載荷恢復(fù)率比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；外泌體組最大載荷、最大載荷恢復(fù)率高于對(duì)照組和復(fù)合組。見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠最大載荷、最大載荷恢復(fù)率比較（n=10，）

表2 3組大鼠最大載荷、最大載荷恢復(fù)率比較（n=10，）

2.4 大鼠骨痂組織病理變化及組織學(xué)評(píng)分比較

對(duì)照組骨小梁不具明顯的方向性，成骨不活躍，骨小梁增粗不明顯；外泌體組骨折斷端可觀察到較多的骨性骨痂，骨小梁部分成熟，且有明顯礦化，且與應(yīng)力方向一致，排列有序；復(fù)合組可觀察到生成較多軟骨性及纖維性骨痂，在軟骨性骨痂邊緣有較多鈣化，有骨外膜下成骨，并形成骨小梁，間隙中毛細(xì)血管豐富。見(jiàn)圖3。

圖3 3組大鼠骨痂組織病理切片（HE染色×40）

對(duì)照組、外泌體組、復(fù)合組大鼠骨痂組織組織學(xué)評(píng)分分別為（1.68±0.37）分、（2.47±0.52）分、（3.08±0.63）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.380，P=0.000）；與外泌體組比較，對(duì)照組組織學(xué)評(píng)分降低（P＜0.05），復(fù)合組組織學(xué)評(píng)分升高（P＜0.05）。

2.5 3 組大鼠骨痂組織p-β-catenin/β-catenin、GSK-3β、Runx2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組、外泌體組、復(fù)合組大鼠骨痂組織p-βcatenin/β-catenin、GSK-3β、Runx2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對(duì)照組比較，外泌體組pβ-catenin/β-catenin、Runx2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05），GSK-3β 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與外泌體組比較，復(fù)合組p-β-catenin/β-catenin、Runx2 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05），GSK-3β 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 3組大鼠骨痂組織p-β-catenin/β-catenin、GSK-3β、Runx2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，）

表3 3組大鼠骨痂組織p-β-catenin/β-catenin、GSK-3β、Runx2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，）

3 討論

股骨干骨折是臨床常見(jiàn)的成人骨折類(lèi)型，盡管骨組織擁有很強(qiáng)的愈合力，但仍有10%左右的患者存在股骨干骨折延遲愈合或不愈合問(wèn)題，進(jìn)而導(dǎo)致骨骼畸形、肢體縮短、永久性殘疾等并發(fā)癥[8]。隨著組織工程技術(shù)的不斷進(jìn)步，以hucMSC 移植為代表的細(xì)胞移植成為治療骨折的新型方式。然而有研究發(fā)現(xiàn)，外源性hucMSC 移植后并未直接參與損傷組織的修復(fù)、再生過(guò)程，而是通過(guò)旁分泌效應(yīng)如分泌Exos 參與組織修復(fù)[9-10]。

Exos 是直徑30～150 nm 的囊泡樣小體，觸發(fā)適應(yīng)性及先天性免疫應(yīng)答風(fēng)險(xiǎn)小，無(wú)致瘤性，且具有性質(zhì)穩(wěn)定、可長(zhǎng)期存儲(chǔ)的優(yōu)勢(shì)，其與干細(xì)胞功能類(lèi)似，在心血管疾病、骨科疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及肝病等領(lǐng)域均取得了較大成就[11-13]。hucMSC-Exos 注入骨髓腔周可釋放促軟骨細(xì)胞增殖及促基質(zhì)合成因子，可調(diào)節(jié)微環(huán)境平衡，促進(jìn)軟骨修復(fù)與再生[14]。此外，hucMSC-Exos 中含有豐富的酶類(lèi)，可改善生物能量代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量，并通過(guò)調(diào)控免疫系統(tǒng)恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[15]。ZHANG等[16]研究表明，Exos 作為細(xì)胞間通訊的重要參與者，通過(guò)促進(jìn)骨生成和血管生成，對(duì)骨不連的治療發(fā)揮關(guān)鍵作用。LIANG等[17]研究證實(shí)，骨髓MSC 外泌體可促進(jìn)軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)重建，減少軟骨細(xì)胞凋亡，并減少炎癥組織中巨噬細(xì)胞聚集，下調(diào)炎癥因子水平達(dá)到抗炎效果。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，外泌體組干預(yù)后2 周、4 周Tb.N 增加，BV/TV、最大載荷、最大載荷恢復(fù)率升高，提示hucMSC-Exos 可促進(jìn)股骨干骨折大鼠骨折愈合，并提高骨痂生物力學(xué)性能。

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)及分化的經(jīng)典途徑，與骨生成代謝關(guān)系密切，在該通路中β-catenin 是具有正向調(diào)節(jié)作用的核心蛋白，GSK-3β是其負(fù)向調(diào)控酶，可促進(jìn)β-catenin 磷酸化，p-βcatenin 與DNA 親和蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，從而調(diào)控下游靶基因，參與骨代謝過(guò)程[18-19]。近年來(lái)，以Wnt/β-catenin 信號(hào)通路為靶點(diǎn)，治療骨折的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已獲得一定進(jìn)展[20-22]。LIU等[23]研究發(fā)現(xiàn)，激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路可促進(jìn)成年和老年雄性小鼠干骺端骨折愈合，其骨痂組織中成骨細(xì)胞數(shù)量增加，且活性亦隨之增強(qiáng)。此外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路可通過(guò)誘導(dǎo)血管生成和細(xì)胞分化，促進(jìn)小鼠骨折愈合，提示該通路在成骨分化及骨形成中發(fā)揮重要作用[24]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，外泌體組骨痂組織p-β-catenin/βcatenin、Runx2 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，GSK-3β 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，且在hucMSC-Exos 的基礎(chǔ)上增加Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制 劑XAV939將減弱hucMSC-Exos 對(duì)骨折愈合的促進(jìn)作用，提示W(wǎng)nt/βcatenin 信號(hào)通路在骨折大鼠中活性降低，hucMSCExos 可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路發(fā)揮作用。

綜上所述，股骨干骨折大鼠骨髓腔內(nèi)注射hucMSC-Exos 對(duì)骨折愈合具有促進(jìn)作用，其作用機(jī)制可能與激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)。