張暢，宋具昆，袁東波，陳偉明，何虎，錢城，楊萌，朱建國(guó)

（1.貴州醫(yī)科大學(xué) 研究生院，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州省人民醫(yī)院 泌尿外科，貴州 貴陽(yáng) 550002）

腎癌起源于腎小管上皮細(xì)胞，占成人惡性腫瘤 的2%～3%，其發(fā)病率以每年約2.5%的速度上升，2021 年美國(guó)新發(fā)7 萬(wàn)多例腎癌病例和2萬(wàn)多例死亡病例[1]。腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma,ccRCC）是最常見的組織學(xué)類型，占腎癌的80%～90%[2]。不同時(shí)期ccRCC 患者生存率差異較大，其中分化差或已有轉(zhuǎn)移的ccRCC 患者總體生存率普遍較低[3]。多項(xiàng)研究報(bào)道，1/3 的局限性ccRCC 患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，單純手術(shù)治療、放療及化療效果均不佳[4-5]。歐洲泌尿外科協(xié)會(huì)臨床指南將免疫檢查點(diǎn)抑制劑作為晚期轉(zhuǎn)移性ccRCC 的一線治療[6]。ccRCC 免疫檢查點(diǎn)抑制劑主要通過程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1,PD-1）、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4），維護(hù)T 淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力[7]。

透明質(zhì)酸和蛋白多糖鏈接蛋白家族基因成員3（hyaluronan and proteoglycan link protein 3,HAPLN3）分子量為40 894 Da，其編碼的蛋白是透明質(zhì)酸和蛋白多糖鏈接蛋白基因家族成員，包含360 個(gè)氨基酸，在人體各組織中廣泛表達(dá)，主要存在于細(xì)胞外基質(zhì)。該蛋白具有促進(jìn)癌細(xì)胞遷移、誘導(dǎo)血管化、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用。而由透明質(zhì)酸與蛋白多糖組成的細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移、增殖、分化和存活等方面均有影響[8]。

既往研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)透明質(zhì)酸和蛋白多糖在ccRCC 的發(fā)展中起重要作用[9]。HAPLN3 作為透明質(zhì)酸與蛋白多糖的鏈接蛋白在腎癌中的作用顯得尤為重要，然而HAPLN3 與ccRCC 的相關(guān)性未見報(bào)道。本文通過多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，探討HAPLN3 在ccRCC 中的差異表達(dá)、預(yù)后價(jià)值及免疫特征，分析HAPLN3 在ccRCC 中免疫及腫瘤相關(guān)通路的富集情況，以及HAPLN3基因表達(dá)降低對(duì)腎癌細(xì)胞株增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

癌癥基因組圖譜分析（the cancer genome atlas,TCGA）（https：//portal.gdc.cancer.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載時(shí)間為2021 年5 月，獲取530 個(gè)ccRCC 患者及72 個(gè)癌旁組織標(biāo)本的RNA 數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息。由于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)癌旁組織較少，將基因型-組織表達(dá)（Genotype-Tissue Expression,GTEx）數(shù)據(jù)庫(kù)的正常組織標(biāo)本加入對(duì)照。使用GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//gtexportal.org/home/datasets）V8 版本，下載89 個(gè)正常腎臟組織的RNA 數(shù)據(jù)。mRNA 相對(duì)表達(dá)量均為標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)，將ccRCC 患者標(biāo)本設(shè)為腫瘤組（530例）。以HAPLN3 mRNA 中位數(shù)為截?cái)帱c(diǎn)，將標(biāo)本分為高表達(dá)組（265例）、低表達(dá)組（265例）。按WHO/ISUP分級(jí)系統(tǒng)中的G3級(jí)、G4級(jí)，分為G3組（206例）、G4組（75例）。最后將癌旁組織標(biāo)本和正常組織標(biāo)本作為正常組（161例）。臨床資料不完整的患者，如pMx 期不能使用，則作為缺失病例處理。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人腎近曲小管上皮細(xì)胞系HK-2、腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系OS-RC-2、ACHN 購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。90%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）+1%雙抗配制成完全培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，將細(xì)胞置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 主要試劑及儀器

基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS、雙抗（美國(guó)Gibco 公司），BCA蛋白定量試劑盒、SP 檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶有限公司），放射免疫分析（radio immunoprecipitation assay,RIPA）裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），兔抗人HAPLN3 多抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），β-tubulin 抗體（美國(guó)Affinity Biosciences 公司），山羊抗兔IgG-HRP（美國(guó)Abeam 公司），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）Mix 試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司），RNA 試劑盒（上海奕杉生物科技有限公司），LipofectamineTM2000 試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司），CCK-8（日本同仁化學(xué)研究所），快速封閉液（英國(guó)Genefist 公司），含干擾序列si-HAPLN3 和si-NC 質(zhì)粒（上海吉?jiǎng)P基因公司）。

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（中國(guó)上海力申科學(xué)儀器有限公司），凝膠成像系統(tǒng)、qRT-PCR 儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek Instruments 公司）。

1.4 方法

1.4.1 差異表達(dá)、生存分析及預(yù)后模型構(gòu)建使用R 軟件分析HAPLN3 在腫瘤組與正常組中的mRNA差異表達(dá)，并進(jìn)一步分析在G3 組、G4 組及正常組中mRNA差異表達(dá)，“ggplot2”R軟件繪制箱線圖?！皊urvival”“survminer”R 軟件繪制生存曲線，研究不同表達(dá)量HAPLN3 對(duì)ccRCC 生存率的影響，以及G4 組、G3 組不同亞組間生存差異。采用單變量和多變量Cox 回歸分析評(píng)估HAPLN3 與5 個(gè)主要因素的關(guān)系，包括年齡、pT 分期、pN 分期、pTNM 分期、WHO 分級(jí)。通過“forestplot”R 軟件繪制森林圖，顯示每個(gè)變量的HR、95% CI和P值。使用“rms”R 軟件構(gòu)建列線圖，預(yù)測(cè)1年、3年和5年總體生存率（overall survival,OS），計(jì)算出一致性指數(shù)（concordance index,C-index），繪制出校正曲線。采用Bootstrap 法自抽樣200 次（B=200）驗(yàn)證，C 指數(shù)越大，預(yù)測(cè)價(jià)值越高，校正曲線越接近45°斜線，說(shuō)明預(yù)測(cè)值與觀察值越接近。

1.4.2 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及免疫檢查點(diǎn)分析采用腫瘤免疫浸潤(rùn)數(shù)據(jù)庫(kù)（Tumor Immune Estimation Resource,TIMER）2.0（https：//cistrome.shinyapps.io/TIMER2.0/）分析HAPLN3 與腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞（tumorinfiltrating immune cells,TIIC）的相關(guān)性。采用“immunedeconv”R 軟件中的TIMER 2.0 算法分析ccRCC 中HAPLN3 與6 種常見免疫細(xì)胞亞型浸潤(rùn)水平的相關(guān)性，使用XCELL 算法評(píng)估免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分及腫瘤微環(huán)境。使用“ggplot2”“pheatmap”和“immuneeconv”R 軟件評(píng)估免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因在G3 組、G4 組的mRNA 相對(duì)表達(dá)量，以及HAPLN3 與免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因的共表達(dá)情況。使用JIANG等[10]開發(fā)的腫瘤免疫功能障礙和排除（tumor immune dysfunction and exclusion,TIDE）算法預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)阻斷（immune checkpoint blockade,ICB）療效，若TIDE 評(píng)分高代表接受ICB 治療后生存期短。

1.4.3 基因富集分析尋找ccRCC 中潛在的HAPLN3 相關(guān)信號(hào)通路。HAPLN3 表達(dá)高表達(dá)組和低表達(dá)組使用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）v3.0（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/downloads.jsp）。本研究中P＜0.05 和FDR＜5%為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4.4 免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry,IHC）法檢測(cè)HAPLN3的表達(dá)選取2020 年1 月—2021 年8 月在貴州省人民醫(yī)院泌尿外科行根治性腎切除的50例患者的癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并經(jīng)患者同意后簽署知情同意書。標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切片厚度約4 μm，脫蠟，脫水，抗原修復(fù)，封閉，HAPLN3 一抗（1∶2 000）孵育過夜，羊抗兔IgG 二抗（1∶200）37℃孵育30 min，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明封片。顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，由2 位病理科醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行評(píng)價(jià)。染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0 分，淡黃色為1 分，黃褐色為2 分，深褐色為3 分。陽(yáng)性細(xì)胞比例：＜5%為0 分；5%～25%為1 分；＞25%～50%為2 分；＞50%～75%為3 分；＞75%為4 分。相乘得出最終結(jié)果，0 分為陰性（-），1～4 分為弱陽(yáng)性（+），5～8 分為陽(yáng)性（++），9～12 分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。根據(jù)IHC 染色結(jié)果分為陰性表達(dá)（陰性和弱陽(yáng)性）和陽(yáng)性表達(dá)（陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性）。

1.4.5 Western blotting檢測(cè)HAPLN3 蛋白的表達(dá)取培養(yǎng)好的細(xì)胞，RIPA 裂解，離心后收集上清液。根據(jù)BCA 蛋白定量試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作測(cè)定蛋白濃度。配置5%濃縮膠、10%分離膠進(jìn)行上樣電泳和轉(zhuǎn)膜，快速封閉液封閉10 min，稀釋?duì)?tubulin、HAPLN3 后4℃孵育過夜。TBST 洗滌3 次，稀釋二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗滌3 次，顯影，采用Image J軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值，進(jìn)行半定量分析。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.4.6 qRT-PCR檢測(cè)HAPLN3 mRNA的表達(dá)采用RNA 試劑盒提取細(xì)胞RNA，然后在260 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值和RNA 濃度，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照qRT-PCR Mix 試劑盒說(shuō)明書配置20 μL反應(yīng)體系：2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，正反向引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，補(bǔ)充ddH20 至20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)，熔解曲線按儀器默認(rèn)條件。以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算HAPLN3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。HAPLN3正向引物：5'-AGGAGACCCTGTTCACCTACC-3'，反向引物：5'-ACAGCTTCCACCATTTGACAC-3',引 物長(zhǎng) 度 111 bp；β -actin正向引物 ：5'-TCCTCTCCCAAGTCCACACA-3'，反向引物：5'-GCACGAAGGCTCATCATTCA-3'，引物長(zhǎng)度129 bp。引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.4.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OS-RC-2、ACHN 細(xì)胞，根據(jù)LipofectamineTM2000 試劑盒說(shuō)明書，分別轉(zhuǎn)染si-HAPLN3 和si-NC。轉(zhuǎn)染完成后qRT-PCR 檢測(cè)siRNA 沉默效率。將構(gòu)建成功的細(xì)胞胰酶消化后計(jì)數(shù)，等密度均勻接種于96 孔板,100 μL/孔，細(xì)胞4 000 個(gè)/孔,每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔，分別于0 h、24 h、48 h、72 h 加入CCK-8 試劑，孵育2 h 后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的光密度（optical density,OD），計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Rv 4.0.3 和GraphPad Prism v8.02統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)M（P25，P75）表示，比較用秩和檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較用Dunn'st檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Spearman 法；影響因素的分析用單因素和多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HAPLN3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較及生存分析

腫瘤組與正常組HAPLN3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為3.138（2.541，3.748）和1.565（1.137，2.400），經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=14153.000，P=0.000），腫瘤組高于正常組。

G4 組、G3 組、正常組HAPLN3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為4.081（3.281，4.755）、3.591（2.923，4.182）和1.565（1.137，2.400），經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=208.342，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：G4 組HAPLN3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于G3 組、正常組（P＜0.05），G3 組HAPLN3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于正常組（P＜0.05）。

生存曲線結(jié)果顯示，HAPLN3 高表達(dá)組與低表達(dá)組OS 比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.673，P=0.003），HAPLN3 高表達(dá)組OS 低于低表達(dá)組，提示HAPLN3基因高表達(dá)與ccRCC 患者預(yù)后不良有關(guān)。G4 組與G3 組OS 比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=33.063，P=0.000），G4 組OS 組低于G3 組，提示高級(jí)別ccRCC 可能預(yù)后更差。見圖1。

圖1 各組Kaplan-Meier法繪制生存曲線

2.2 臨床特征的單因素和多因素分析

預(yù)后模型構(gòu)建以TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的腎癌患者年齡、臨床分期、病理分級(jí)及HAPLN3 表達(dá)為自變量，總生存情況為因變量，通過單因素及多因素Cox回歸分析篩選腎癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。單因素Cox 回歸分析結(jié)果表明，HAPLN3 高表達(dá)[=1.548（95%CI：1.325，1.801）]、高齡[=1.029（95%CI：1.016，1.042）]、高pT 分期[=1.923（95%CI：1.632，2.265）]、高pN分期[=3.425（95% CI：1.818，6.456）]、高pTNM分期[=1.867（95% CI：1.638，12.12）]、高Grade分級(jí)[=2.291（95% CI：1.870，2.806）] 是ccRCC 患者不良預(yù)后的影響因素（均P=0.000）。

列線圖結(jié)果表明，用HAPLN3 表達(dá)量、年齡、pTNM 分期、Grade 分級(jí)構(gòu)建的預(yù)后模型可以較好地預(yù)測(cè)ccRCC 患者的1 年、3 年、5 年OS，C 指數(shù)為0.779（95%CI：0.729，1.000）（P=0.000）。見圖2。

圖2 HAPLN3聯(lián)合相關(guān)臨床特征構(gòu)建的列線圖及校正曲線

2.3 HAPLN3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與免疫細(xì)胞亞型浸潤(rùn)水平的相關(guān)性

HAPLN3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與B 淋巴細(xì)胞、CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)（rs=0.284、0.532、0.584、0.617、0.323 和0.620，均P=0.000），提 示HAPLN3 可能參與多種ccRCC 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)調(diào)節(jié)。見圖3。

圖3 HAPLN3 mRNA相對(duì)表達(dá)量與免疫細(xì)胞亞型浸潤(rùn)水平的相關(guān)性

2.4 HAPLN3 與免疫相關(guān)基因共表達(dá)分析及ccRCC免疫檢查點(diǎn)分析

G4組與G3 組CD274、HAVCR2、PDCD1LG2、SIGLEC15 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)Wilcoxon 檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。G4 組與G3 組CTLA4、LAG3、PDCD1、TIGIT mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），G4 組高于G3 組，提示高級(jí)別ccRCC 更易形成免疫逃逸。見圖4、5 和表1。

表1 兩組疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 [M（P25，P75）]

圖4 兩組免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

圖5 兩組免疫檢查點(diǎn)分析及免疫檢查點(diǎn)ICB治療TIDE評(píng)分

通過TIDE 算法得出G4 組、G3 組TIDE 評(píng)分分別為0.805（-0.148，1.385）分和0.260（-0.495，1.170）分，經(jīng)Wilcoxon 檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.482，P=0.013），G4 組高于G3 組，提示高級(jí)別ccRCC 患者行ICB 治療效果更差。免疫抑制基因共表達(dá)分析結(jié)果表明，幾乎所有免疫抑制基因也都與HAPLN3陽(yáng)性共表達(dá)，上述結(jié)果提示HAPLN3可能是G4 組ccRCC潛在的免疫治療靶點(diǎn)。見圖6。

圖6 HAPLN3與免疫抑制基因共表達(dá)情況

2.5 基于GSEA數(shù)據(jù)庫(kù)完善ccRCC中HAPLN3通路富集分析

HAPLN3 高表達(dá)在多個(gè)免疫相關(guān)通路富集，包括細(xì)胞因子受體相互作用，NK 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性通路、趨化因子信號(hào)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路、黏附分子Cam、T 細(xì)胞受體（T cell receptor,TCR）信號(hào)通路、B 細(xì)胞受體（B cell receptor,BCR）信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、Toll樣受體（Toll-like receptors,TLR）信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路、Wnt 信號(hào)通路等。這些信號(hào)通路的發(fā)現(xiàn)表明HAPLN3 可能參與ccRCC的免疫相關(guān)通路，而TCR 信號(hào)通路尤其值得關(guān)注。見表2。

表2 HAPLN3在ccRCC相關(guān)通路富集分析

2.6 癌組織與癌旁組織HAPLN3蛋白的表達(dá)

HAPLN3 主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色（見圖7）。癌組織、癌旁組織HAPLN3 陽(yáng)性表達(dá)率分別為58%（29/50）和36%（18/50），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.857，P=0.028），癌組織HAPLN3 陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織。

2.7 HK-2、OSRC-2、ACHN細(xì)胞 HAPLN3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

HK-2、OSRC-2、ACHN細(xì)胞HAPLN3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別 為（1.00±0.11）、（1.30±0.08）和（1.75±0.13），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=33.930，P=0.000）；OSRC-2、ACHN細(xì)胞HAPLN3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于HK-2 細(xì)胞（P＜0.05）。

HK-2、OSRC-2、ACHN 細(xì)胞HAPLN3 蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.18）、（2.84±0.11）和（4.02±0.21），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=235.3，P=0.000）；OSRC-2、ACHN 細(xì)胞HAPLN 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于HK-2 細(xì)胞（P＜0.05）。見圖8。

圖8 HK-2、OSRC-2、ACHN細(xì)胞HAPLN3蛋白的表達(dá)

2.8 沉默HAPLN3對(duì)腎透明細(xì)胞癌增殖的影響

si-NC 組、si-HAPLN3 組OS-RC-2 細(xì)胞HAPLN3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（1.00±0.12）和（0.42±0.09），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.601，P=0.002），si-HAPLN3 組低于si-NC 組，說(shuō)明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。

si-NC 組、si-HAPLN3 組ACHN細(xì)胞HAPLN3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為（1.00±0.14）和（0.44±0.08），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.847，P=0.004），si-HAPLN3 組低于si-NC 組，說(shuō)明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。

si-NC 組、si-HAPLN3 組不同時(shí)間點(diǎn)OS-RC-2、ACHN 細(xì)胞的OD 值比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)OS-RC-2、ACHN 細(xì)胞的OD 值有差異（F=481.158 和292.321，均P=0.000）；②兩組OS-RC-2、ACHN 細(xì)胞的OD 值有差異（F=27.471 和255.219，均P=0.002）；③兩組OS-RC-2、ACHN 細(xì)胞的OD 值變化趨勢(shì)有差異（F=20.799 和11.301，P=0.017 和0.040）。見表3。

表3 兩組不同時(shí)間點(diǎn)OS-RC-2、ACHN細(xì)胞的OD值比較（）

表3 兩組不同時(shí)間點(diǎn)OS-RC-2、ACHN細(xì)胞的OD值比較（）

注：?與si-NC組比較，P＜0.05。

3 討論

HAPLN3 作為透明質(zhì)酸和蛋白多糖鏈接蛋白基因家族成員，是乳腺癌、前列腺癌及黑色素瘤等多種腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物[11-13]。盡管目前還沒有研究報(bào)道HAPLN3 表達(dá)與ccRCC 的相關(guān)性，但多項(xiàng)文獻(xiàn)證實(shí)透明質(zhì)酸和蛋白多糖在不同程度上影響ccRCC 的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后[14]，所以HAPLN3 在ccRCC 中的表達(dá)及其作用值得探究。

基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，筆者發(fā)現(xiàn)HAPLN3 在ccRCC中的表達(dá)高于正常腎臟。其結(jié)果在組織水平經(jīng)IHC染色驗(yàn)證，在細(xì)胞水平經(jīng)qRT-PCR 和Western blotting 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并通過CCK-8 法進(jìn)一步驗(yàn)證沉默HAPLN3的ccRCC 細(xì)胞增殖能力下降，提示該基因可能與ccRCC 增殖有關(guān)。隨后筆者通過TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析HAPLN3 在不同WHO 分級(jí)亞組的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)WHO 分級(jí)G4 組高于G3 組，提示HAPLN3 表達(dá)上調(diào)可能導(dǎo)致ccRCC 向更差的組織學(xué)分級(jí)進(jìn)展，遺憾的是本實(shí)驗(yàn)未收集到G4 組標(biāo)本，后期需加大病例數(shù)驗(yàn)證不同組織學(xué)分級(jí)間HAPLN3 的表達(dá)。生存分析結(jié)果表明，HAPLN3 高表達(dá)較低表達(dá)ccRCC 患者的OS低，提示HAPLN3 可能與ccRCC 患者預(yù)后不良有關(guān)。通過單因素和多因素Cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)HAPLN3、年齡、pTNM、Grade 分級(jí)是ccRCC 患者不良預(yù)后的獨(dú)立影響因素。

免疫靶向治療逐漸成為晚期腎癌新的治療方式[15]，且細(xì)胞外基質(zhì)與免疫微環(huán)境關(guān)系密切[16]，故選用TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)研究HAPLN3 表達(dá)與免疫細(xì)胞的相關(guān)性，結(jié)果表明HAPLN3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與B 淋巴細(xì)胞、CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)，提示HAPLN3 可能參與ccRCC 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)調(diào)節(jié)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)HAPLN3與多種免疫檢查點(diǎn)呈陽(yáng)性共表達(dá)，包括CTLA4、LAG3、PDCD1 和TIGIT，這些免疫檢查點(diǎn)在近年來(lái)是晚期ccRCC 的新興治療研究熱點(diǎn)[17]，故后續(xù)探究HAPLN3與明星免疫檢查點(diǎn)的關(guān)系很有意義。結(jié)合HAPLN3 在ccRCC 不同WHO 分級(jí)中的差異表達(dá)、免疫檢查點(diǎn)分析及TIDE 評(píng)分，筆者猜測(cè)HAPLN3 表達(dá)上調(diào)影響免疫抑制基因的功能，從而造成組織學(xué)分級(jí)較差的ccRCC 不能在ICB治療中獲得較好的療效，提示HAPLN3 可能成為高級(jí)別ccRCC 潛在的免疫治療靶點(diǎn)，以及成為ICB 治療的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

GSEA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，HAPLN3 在ccRCC中與TCR 信號(hào)通路、BCR 信號(hào)通路、NK 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性通路、TLR 信號(hào)通路等免疫相關(guān)信號(hào)通路富集。KRISHNA等[18]單細(xì)胞測(cè)序TCR 軌跡分析結(jié)果表明，ICB 治療在有反應(yīng)與耐藥患者之間存在不同的T 淋巴細(xì)胞分化途徑，然而暫無(wú)BCR 與腎癌進(jìn)展的相關(guān)研究。有研究表明，ccRCC 中有NK 細(xì)胞浸潤(rùn)，但是隨著腫瘤進(jìn)展，可能出現(xiàn)功能障礙[19]。TLR是連接非特異性免疫與特異性免疫的橋梁。MORIKAWA等[20]研究表明，TLR3 在ccRCC中過表達(dá)，TLR3 通路可能代表CCRCC 新的治療靶點(diǎn)。另外本研究結(jié)果表明，HAPLN3基因在細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、黏附分子Cam 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路、Wnt 信號(hào)通路等癌癥相關(guān)通路富集。

本研究結(jié)果表明，HAPLN3基因在ccRCC 細(xì)胞中高表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)，通過該基因構(gòu)建的臨床預(yù)后模型可較好地預(yù)測(cè)患者1 年、3 年和5 年總生存率。HAPLN3基因在ccRCC 中與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、免疫相關(guān)檢查點(diǎn)存在相關(guān)性，并且可能通過多種腫瘤免疫機(jī)制促進(jìn)ccRCC 的發(fā)生、發(fā)展。HAPLN3 有作為ccRCC 免疫治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值。