馬建英，王煒璐，解春霞，周志強(qiáng)

[青島市中醫(yī)醫(yī)院（青島市海慈醫(yī)院）1.心血管內(nèi)科，2.功能檢查科，山東 青島266033，3.青島大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院 心血管內(nèi)科，山東 青島266071]

心力衰竭（簡稱心衰）是指因心臟無法為機(jī)體提供充足血供所致的心臟循環(huán)障礙癥候群，是諸多心血管疾病的最終轉(zhuǎn)歸[1]。心衰發(fā)生后非梗死區(qū)心肌細(xì)胞因血流動力學(xué)變化而出現(xiàn)病理性重構(gòu)，易誘發(fā)心肌收縮功能降低、左心室重構(gòu)，不及時(shí)治療可發(fā)展為泵衰竭、心律失常等不可逆性惡性事件，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[2-3]。而以心肌細(xì)胞丟失、心肌肥厚、心肌組織纖維化等為主要特征的心室重構(gòu)、心肌細(xì)胞衰亡是諸多慢性心血管疾病的主要發(fā)病機(jī)制[4]。實(shí)時(shí)三維超聲心動圖（real-time threedimensional echocardiography,RT-3DE）具有動態(tài)、操作簡便、重復(fù)性高等優(yōu)勢，可直接顯示心腔立體形態(tài)，清晰反映左房容積及功能相關(guān)狀態(tài)[5-6]。有研究證實(shí)，miRNA 參與心衰、冠心病、心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生過程[7]，但具體機(jī)制尚未完全闡明，且關(guān)于RT-3DE 聯(lián)合miRNA 用于心血管疾病診斷中的相關(guān)研究較少報(bào)道。本研究擬探討RT-3DE 聯(lián)合miR-499 水平用于心衰的診斷價(jià)值，為診治心衰、判斷預(yù)后提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年1 月—2021 年12 月就診于青島市中醫(yī)醫(yī)院的110例心衰患者作為心衰組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合心衰診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，且經(jīng)心臟彩超或胸部X射線明確病情；②美國紐約心臟病學(xué)會（New York heart association,NYHA）分級Ⅱ～Ⅳ級；③入組前6個(gè)月內(nèi)心衰病情穩(wěn)定。排除標(biāo)準(zhǔn)：①因瓣膜脫垂、心包疾病、發(fā)紺型先天性心臟病、瓣膜重度狹窄等所致的心衰；②3 個(gè)月內(nèi)曾罹患心肌炎、心絞痛、心肌梗死、嚴(yán)重心律失常；③合并血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾?。虎車?yán)重肝、腎功能不全；⑤妊娠期或哺乳期；⑥惡性腫瘤。另選同期本院健康體檢者60例作為對照組，均無心腦血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 RT-3DE 檢查采用iE33 型全數(shù)字化彩色心臟超聲診斷儀（荷蘭飛利浦公司），探頭頻率1.9～3.8 MHz，取患者左側(cè)臥位，叮囑患者屏氣，將X3-1矩陣探頭置于患者心尖四腔心全容積面，開啟全容積模式，連續(xù)獲取4 個(gè)心動周期的動態(tài)圖像，調(diào)整增益、深度等參數(shù)以確保最佳圖像。使用3DQadvanced軟件與Qlab6.0 軟件對RT-3DE 參數(shù)進(jìn)行定量分析，包括左室收縮末期容積（LVESV）、左室舒張末期容積（LVEDV）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室16 節(jié)段達(dá)到收縮末期最小容積的標(biāo)準(zhǔn)差（Tmsv16-SD%）、最大差值（Tmsv16-Dif%）。所有數(shù)據(jù)測量3 次，并取平均值。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測血清miR-499 表達(dá)采集患者治療前空腹靜脈血4 mL，置于含EDTA 抗凝劑的采血管中，室溫下靜置30 min，4℃、1 000 r/min 離心10 min，移液槍移取血清置于1.5 mL EP 管內(nèi)，置于-80℃超低溫冰箱中冷藏待測。參考TRIzol 試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）說明書提取血清中總RNA，使用紫外分光光度計(jì)（美國NanoDrop 公司）測定RNA 濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過1500 型全自動PCR 儀（美國ABI 公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為20 μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，58℃退火60 s，共12 個(gè)循環(huán)，采集熒光，用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-499 相對表達(dá)量。對照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 法；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組性別、體質(zhì)量指數(shù)、心率、收縮壓、舒張壓比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2 兩組RT-3DE參數(shù)、血清miR-499水平比較

兩組RT-3DE 參數(shù)、血清miR-499 相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），心衰組LVEDV、LVESV、Tmsv16-Dif%、Tmsv16-SD%及血清miR-499相對表達(dá)量高于對照組，LVEF低于對照組。見表3。

表3 兩組RT-3DE參數(shù)、血清miR-499相對表達(dá)量比較（）

表3 兩組RT-3DE參數(shù)、血清miR-499相對表達(dá)量比較（）

2.3 心衰患者血清miR-499 相對表達(dá)量與RT-3DE參數(shù)的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性分析顯示，心衰患者血清miR-499 相對表達(dá)量與LVEDV、LVESV、Tmsv16-Dif%、Tmsv16-SD%均呈正相關(guān)（r=0.373、0.347、0.228 和0.395，P=0.000、0.000、0.003 和0.003），與LVEF 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.341，P=0.000）。見圖1～5。

圖1 血清miR-499相對表達(dá)量與LVEDV的相關(guān)性

2.4 血清miR-499相對表達(dá)量聯(lián)合RT-3DE參數(shù)診斷心衰的價(jià)值

ROC 曲線顯示，聯(lián)合診斷的AUC、敏感性、特異性最高，分別為0.932（95% CI：0.912，0.984）、0.855（95% CI：0.796，0.908）、0.832（95% CI：0.763，0.896）。見表5 和圖6、7。

圖6 LVEDV、LVESV、Tmsv16-Dif%、Tmsv16-SD%、miR-499及聯(lián)合檢測診斷心衰的ROC曲線

表5 血清miR-499表達(dá)聯(lián)合RT-3DE參數(shù)診斷心衰的診斷效能分析

圖2 血清miR-499相對表達(dá)量與LVEF的相關(guān)性

圖3 血清miR-499相對表達(dá)量與LVESV的相關(guān)性

圖4 血清miR-499相對表達(dá)量與Tmsv16-Dif%的相關(guān)性

圖5 血清miR-499相對表達(dá)量與Tmsv16-SD%的相關(guān)性

圖7 LVEF診斷心衰的ROC曲線

3 討論

正常情況下，心室壁實(shí)現(xiàn)心臟有效泵血的途徑在于有節(jié)律地同步性收縮、舒張。而心衰可導(dǎo)致心室壁收縮運(yùn)動不同步、左心室收縮功能降低、心臟血流動力學(xué)改變，從而進(jìn)一步對心臟攝血功能產(chǎn)生不利影響[9-10]。RT-3DE 集多普勒顯像技術(shù)、常規(guī)超聲心動圖、三維超聲等優(yōu)點(diǎn)于一體，通過實(shí)時(shí)測量心動周期中某時(shí)期的體積等參數(shù)，有助于識別左心室不同步，準(zhǔn)確評估心功能[11]。本研究中，心衰組LVEDV、LVESV、Tmsv16-Dif%、Tmsv16-SD%高于對照組，LVEF 低于對照組，與其他學(xué)者的研究結(jié)果基本一致[12]，充分證實(shí)RT-3DE 可反映心衰患者的心功能損傷情況。原因在于心衰引起的左室重構(gòu)可改變心室容積、心室形態(tài)，致使左室擴(kuò)大、容積增加、形態(tài)趨向球形，故LVESV、LVEDV 參數(shù)上升；而心肌質(zhì)量增加，收縮力減弱，可造成LVEF 降低。但值得注意的是，雖然RT-3DE 通過測量LVEF 可對收縮性心衰嚴(yán)重程度進(jìn)行定量評估，但在LVEF 正常時(shí)難以評估部分舒張性心衰患者病情[13]。

miR-499 的編碼基因位于人類20 號染色體Myh7b基因內(nèi)，miR-499、Myh7b 可協(xié)同表達(dá)于心肌纖維、骨骼纖維中[14]。研究證實(shí)，miR-499 可通過活化PI3K/Akt 等諸多信號通路參與調(diào)控心肌細(xì)胞的增殖、凋亡等生理功能中[15]。SHIEH等[16]在1 項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)中報(bào)道，miR-499 可通過鈍化心臟應(yīng)激反應(yīng)來調(diào)節(jié)心臟早期應(yīng)答基因（如Fos、Egr2等）表達(dá)，miR-499 高表達(dá)可增加心臟壓力負(fù)荷，從而導(dǎo)致心功能障礙。以上研究提示，miR-499 表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡、心室重構(gòu)等有關(guān)。本研究中，心衰組血清miR-499 表達(dá)高于對照組，推測血清miR-499 表達(dá)上調(diào)可能參與心衰的發(fā)生過程，推測其原因?yàn)?，?dāng)心肌細(xì)胞因缺氧缺血損傷或衰亡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)miR-499 會過度釋放進(jìn)入血液中，故血清miR-499 表達(dá)上升。

本研究發(fā)現(xiàn)，心衰患者血清miR-499 表達(dá)與LVEDV、LVESV、Tmsv16-Dif%、Tmsv16-SD%呈正相關(guān)，與LVEF 呈負(fù)相關(guān)，表明血清miR-499 表達(dá)與心衰患者心功能相關(guān)，推測原因?yàn)樾乃ゼ又匦募∪毖?，減弱心室心肌收縮能力與左室順應(yīng)性，增加左室僵硬度，導(dǎo)致心肌細(xì)胞衰亡，進(jìn)而造成血清miR-499 表達(dá)呈高表達(dá)。筆者認(rèn)為，當(dāng)檢測到患者LVEF正常，而血清miR-499 呈高表達(dá)時(shí)，可能表示患者主要存在舒張功能不全，而LVEF 降低或（和）miR-499升高，說明患者可能存在收縮功能不全或伴有舒張功能不全。ROC 曲線結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RT-3DE 參數(shù)聯(lián)合miR-499 診斷心衰的AUC 為0.932，敏感性為0.855，特異性為0.832，可見聯(lián)合診斷心衰中具有較高的特異性、敏感性與準(zhǔn)確率，miR-499 不受血脂等心血管危險(xiǎn)因素與性別、血壓、年齡、白細(xì)胞等臨床基礎(chǔ)特征影響，且體外穩(wěn)定性較高，與RT-3DE 參數(shù)聯(lián)合診斷時(shí)可有效彌補(bǔ)RT-3DE 檢查收縮功能正常時(shí)難以判斷有無心衰的缺陷。

綜上所述，心衰患者血清miR-499 呈高表達(dá)，與RT-3DE 參數(shù)密切相關(guān)，且兩者聯(lián)合對心衰有良好的診斷價(jià)值。但本研究為單中心前瞻性研究，仍存在一定不足，如樣本量少、未分析不同心功能等級心衰患者的RT-3DE 參數(shù)、血清miR-499 表達(dá)情況，且針對miR-499 參與心衰的確切機(jī)制與信號途徑尚未完全闡明，故后期需展開進(jìn)一步的體內(nèi)、體外或動物實(shí)驗(yàn)，從蛋白、基因等不同分子水平探索miR-499 與心衰的相關(guān)性。