宋東筱，任正楠，潘禮龍，孫 嘉,*

（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫 214122）

麩質(zhì)是小麥、大麥、黑麥和其他相關(guān)谷物中含有的一種結(jié)構(gòu)蛋白復合物，麥醇溶蛋白是麩質(zhì)的組成成分，代表了一類在麩質(zhì)相關(guān)疾病中具有最常見病因作用的蛋白質(zhì)[1-2]。部分人群對麩質(zhì)先天性過敏，當他們攝入含麩質(zhì)的食品時，麩質(zhì)會激發(fā)免疫反應，引起相關(guān)的自身免疫性疾病，其中最常見的疾病是乳糜瀉[3]。在乳糜瀉過程中，麩質(zhì)蛋白作為刺激物會激活小腸黏膜的先天性和適應性免疫反應，導致淋巴細胞和單核細胞浸潤、隱窩增生和小腸絨毛萎縮，進而導致小腸上皮層以及固有層發(fā)生變化[4]，乳糜瀉引起的黏膜損傷通常涉及小腸的近端部分（十二指腸）[5]。其中隱窩增生和絨毛萎縮使小腸黏膜的表面積大量減少，導致對營養(yǎng)物質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)吸收不良，從而進一步影響機體其他組織和器官的功能，并且還會引發(fā)貧血、骨質(zhì)疏松及皮疹等多種不同的臨床癥狀[6-7]。乳糜瀉在世界范圍內(nèi)很常見，早期的流行病學研究認為乳糜瀉是一種常見于歐洲和北美洲的高加索血統(tǒng)個體疾病[8]，但近年研究發(fā)現(xiàn)，在其他地區(qū)乳糜瀉的發(fā)病率也很高，全球的患病率約為1%[9]。乳糜瀉在中國曾被認為極為罕見，但是近幾年乳糜瀉病例報道逐漸增多，并且已有研究發(fā)現(xiàn)中國人群具有很高的乳糜瀉易感基因攜帶率[10]；此外，在中國小麥已經(jīng)成為僅次于大米的第二大消費主食，尤其是在我國的北方地區(qū)，所以中國居民患乳糜瀉的風險遠比原先預計的高，應當引起人們重視，提高對乳糜瀉及其對健康潛在影響的認識[11-12]。目前全世界范圍內(nèi)還沒有針對乳糜瀉的藥物治療方法，乳糜瀉目前公認的唯一干預方法是終生嚴格堅持無麩質(zhì)飲食[13]，即不能攝入含有小麥、黑麥或大麥及其衍生物的麩質(zhì)食物或藥物，因為即使少量的麩質(zhì)也可能會激活乳糜瀉患者的免疫反應，導致嚴重的后果。然而，小麥粉和麩質(zhì)蛋白等經(jīng)常作為配料廣泛應用于各種食品中，并且無麩質(zhì)的食品或作物在貯存、運輸和加工過程中也經(jīng)常容易受到麩質(zhì)的污染，以上情況都造成乳糜瀉患者在日常生活中很難完全避免攝入麩質(zhì)，導致乳糜瀉非常容易出現(xiàn)病癥反復，并且長期無麩質(zhì)飲食也會影響患者的社會交往活動[14]，加重患者的心理與經(jīng)濟負擔[15]。此外，與相應的含麩質(zhì)食品相比較，由無麩質(zhì)原材料制成的食品通常在營養(yǎng)、質(zhì)地和感官特性等方面都有著較大差距[16]。因此，探尋新的治療方法或藥物用于輔助或替代無麩質(zhì)飲食干預是必要的，而動物實驗驗證是新的治療方法或藥物在用于臨床之前能夠保證其有效性和安全性的必經(jīng)步驟，所以成功建立乳糜瀉動物模型是研究新的治療方法或相關(guān)功能性食品的前提和關(guān)鍵。

BALB/c小鼠易發(fā)Th2型免疫反應，目前已經(jīng)廣泛用于各種食物過敏原敏感的動物模型中[17]，故本實驗通過飼喂無麩質(zhì)飼料連續(xù)3 代以上得到麩質(zhì)不耐受的BALB/c小鼠，再通過飼喂含麩質(zhì)飼料并輔以腹腔注射和腳掌注射麥醇溶蛋白刺激構(gòu)建乳糜瀉模型，并通過檢測乳糜瀉相關(guān)的指標來評價該模型的可行性，研究該小鼠模型在病理表觀、腸道屏障和免疫反應等方面的表現(xiàn)，并與臨床乳糜瀉特征進行比較，以期為未來乳糜瀉新的潛在治療措施的研究或相關(guān)功能性食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

本實驗使用的動物為BALB/c雌性小鼠購于上海斯萊克實驗動物有限公司（生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2022-0004），飼養(yǎng)于江南大學醫(yī)學院實驗動物中心無特定病原體級屏障環(huán)境中，飼養(yǎng)環(huán)境保持12 h/12 h循環(huán)照明、室溫22～26 ℃、相對濕度40%～60%。在正式實驗開始之前，所有小鼠都維持無麩質(zhì)飼料飼養(yǎng)，選擇繁育至少3 代以上的6～8 周齡小鼠進行正式實驗。無麩質(zhì)飼料AIN-76A購于美國Research Diet公司。含麩質(zhì)飼料則是在無麩質(zhì)飼料配方的基礎(chǔ)上添加2.5 g/kg的麩質(zhì)蛋白[18]，定制于無錫市楓泊生物公司。全部動物實驗均由江南大學動物倫理委員會批準（批準號：JN.No20190630b0480830[186]），并遵循國家、國際動物實驗倫理原則開展。

醇溶蛋白、弗氏完全佐劑、麩質(zhì)蛋白 美國Sigma公司；TRIzol試劑、Super Script II逆轉(zhuǎn)錄酶 加拿大Invitrogen公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）引物、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC） 上海生工生物工程公司；SYBR Green Supermix染料 翌圣生物科技（上海）有限公司；ZO-1抗體、β-actin抗體 武漢愛博泰克生物科技有限公司；ZO-2抗體 美國Proteintech公司；Occludin抗體 美國Bimake公司；Claudin-1抗體、組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（tissue transglutaminase，tTG）活力測定試劑盒 英國Abcam公司；小鼠連蛋白試劑盒南京博研生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ST40R冷凍離心機、GO全波長酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；1150H組織石蠟包埋機、PM2245萊卡手動輪轉(zhuǎn)切片機 德國萊卡公司；Pannormic Midi切片電子掃描儀 匈牙利3Dhistech公司；Scientz-48高通量組織研磨機 寧波新芝生物科技股份有限公司；FluorChem FC3凝膠成像分析系統(tǒng) 美國ProteinSimple公司。

1.3 方法

1.3.1 構(gòu)建動物模型

將6～8 周的無麩質(zhì)飼料飼養(yǎng)至少3 代以上的BALB/c小鼠隨機分為正常組（Control組）和模型組（CeD組），每組6～8 只。所有動物均飼養(yǎng)于江南大學醫(yī)學院實驗動物中心SPF級屏障環(huán)境。實驗開始的第1天將CeD組的飼料換為麩質(zhì)含量為2.5 g/kg的含麩質(zhì)飼料，Control組則繼續(xù)飼喂無麩質(zhì)飼料；在實驗的前3 周，通過腹腔注射分別給予CeD組每只小鼠含有150 μg麥醇溶蛋白的0.2 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4），每周兩次，在第4周，給予CeD組每只小鼠后腳掌注射乳化有50 μg麥醇溶蛋白的弗氏完全佐劑50 μL兩次（第1天和第4天各注射一次）。在實驗的第31天，向小鼠體內(nèi)注射致死劑量的戊巴比妥鈉并快速收集新鮮的血液和十二指腸等。血液樣本在4 ℃、3 000×g條件下離心15 min，取上清液，得到血清樣品。血清和組織樣本均保存于-80 ℃冰箱中。

1.3.2 小鼠十二指腸組織病理學檢測

收集一段新鮮的十二指腸組織，將其放入提前備好的質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛溶液中，避光固定24～36 h，脫水，石蠟包埋，隨后將包有組織的蠟塊切成5 μm厚的組織切片，然后采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法觀察組織形態(tài)。將組織切片放入60 ℃的烘箱中烘烤2 h，用二甲苯進行脫蠟，依次將切片放入體積分數(shù)100%、95%、90%、80%、70%乙醇溶液中進行復水。隨后用蘇木精進行染色，染色時間為30 s左右，染色結(jié)束后放于流水下進行沖洗15～20 min，沖去多余蘇木精，然后放入體積分數(shù)1%鹽酸-乙醇溶液中分化7 s左右，隨后再次將切片放入流水中沖洗，直到組織變?yōu)樗{色，最后將切片放入伊紅染液中進行復染。隨后，將染色后的切片依次置于70%、80%、95%、95%、100%乙醇溶液及二甲苯中進行透明處理。隨后用中性樹脂進行封片，置于通風處風干后，在顯微鏡下觀察小鼠十二指腸組織病理變化，根據(jù)絨毛長度和隱窩深度比值（villous length/crypt depth，V/C）對十二指腸組織的受損情況進行評價。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗

小鼠十二指腸tTG活力和連蛋白含量的測定根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒說明書進行。

1.3.4 總RNA提取與qPCR測定

采用TRIzol法來提取小鼠十二指腸中的總RNA。首先稱取適量的十二指腸組織加入1 mL TRIzol中，然后在高通量組織破碎儀中進行破碎，加入三氯甲烷進行抽提，12 000×g離心15 min后取上清液，隨后加入等體積的異丙醇沉淀RNA，12 000×g離心15 min，得到羽毛狀的固體沉淀，用體積分數(shù)75%乙醇溶液（經(jīng)RNA酶抑制劑DEPC處理并滅菌的超純水配制）清洗3 次沉淀，用DEPC水將沉淀溶解。使用Super Script II逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板，骨架蛋白β-actin為內(nèi)參，F(xiàn)ast SYBR Green Master Mix混合體系，進行qPCR實驗，反應總體系為20 μL，包括0.5 μL正向序列引物、0.5 μL反向序列引物（引物設計如表1所示）、10 μL的SYBR Green Supermix染料、2 μL cDNA和7 μL無菌水。qPCR反應設置的擴增程序為95 ℃預熱5 min；95 ℃持續(xù)15 s，60 ℃持續(xù)60 s，反應40 個循環(huán)。按照基因相對表達水平2-ΔΔCt來計算目的基因（TGM2、Tjp1、Tjp2、Ocln、Cldn1、Il15、IFNG、Il4、Il6、Il17A、Il18、Il27、Il12、CD4、CD19、CD138和CD68）以及相對管家基因（Actb）的表達水平。

表1 qPCR使用的特異性引物Table 1 Specific primers used for qPCR

1.3.5 腸道通透性的測定

通過測定熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖（fluorescein isothiocyanate-dextran，F(xiàn)ITC-Dextran）質(zhì)量濃度來表征小鼠的腸道通透性。小鼠處死前，進行禁食4 h處理，隨后每只小鼠灌胃500 mg/kgmb的FITC-Dextran，灌胃4 h后將小鼠處死，避光快速收集血液，3 000×g離心15 min得到血清。使用多功能酶標儀在激發(fā)波長492 nm、發(fā)射波長525 nm條件下測定吸光度。通過連續(xù)稀釋FITC-Dextran溶液繪制標準曲線，并根據(jù)標準曲線方程換算出血清中的FITC-Dextran質(zhì)量濃度，血清中的FITC-Dextran質(zhì)量濃度越大，說明小鼠腸道通透性越高。

1.3.6 免疫印跡實驗

將適量的十二指腸組織放入蛋白裂解液（按蛋白裂解液與抑制劑體積比100∶1分別加入磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑）中進行組織破碎，隨后在14 000×g、4 ℃條件下離心15 min，取上清液得到蛋白溶液，用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)測得的蛋白質(zhì)量濃度以確定上樣液體積（總上樣量為30 μg）。得到的蛋白樣品經(jīng)過SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用質(zhì)量分數(shù)5%脫脂乳溶液封閉后，分別用ZO-2、Claudin-1和Occludin蛋白的抗體孵育過夜。隨后用相應的辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗體室溫孵育1.5 h，顯色后置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中曝光觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。雙尾t檢驗（t-test）用于評估各組之間的顯著性差異，數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計學軟件GraphPad Prime 7進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 麩質(zhì)引起的與乳糜瀉相關(guān)的表觀指標的變化

乳糜瀉的典型表觀指標是十二指腸絨毛長度縮短、隱窩增生以及tTG活力增加和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2（transglutaminase，TG2）含量及其抗體含量顯著增加[19]。利用HE染色法觀察小鼠十二指腸的組織形態(tài)（圖1A），與Control組比較，CeD組小鼠的絨毛長度明顯縮短。CeD組小鼠V/C值較Control組高度顯著降低（P＜0.001）（圖1B），說明小鼠的十二指腸組織形態(tài)受到破壞。TG2是一種普遍表達的蛋白質(zhì)，具有多種功能，包括酶促、細胞黏附、細胞信號傳導和G蛋白活性。TG2與多種人類疾病有關(guān)，包括幾種神經(jīng)退行性疾病、癌癥和乳糜瀉[20]。TG2表達量顯著升高也是乳糜瀉發(fā)生的標志之一，并且TG2在腸道中的激活是乳糜瀉發(fā)病機制的核心[21]，在TG2作用下，麥醇溶蛋白肽會發(fā)生脫酰胺作用。脫酰胺的麥醇溶蛋白肽與抗原呈遞細胞相結(jié)合，增加麥醇溶蛋白的免疫原性，促進抗原呈遞細胞發(fā)揮功能，加強先天免疫反應對上皮的破壞。小鼠十二指腸組織中tTG活力和TGM2mRNA相對表達量結(jié)果和預期一樣，與Control組相比，CeD組小鼠的tTG活力和TGM2mRNA相對表達量都極顯著和高度顯著增長（P＜0.01、P＜0.001）。以上結(jié)果與人類乳糜瀉臨床癥狀一致，說明該模型能夠很好地模擬人類乳糜瀉病理學的發(fā)展。

圖1 麩質(zhì)引起的與乳糜瀉相關(guān)表觀指標的變化Fig. 1 Changes in apparent indexes of celiac disease caused by gluten

2.2 麩質(zhì)引起的小鼠腸道屏障的損傷

腸道屏障在保護生物體免受病原體侵害和維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[22-23]。有研究表明，很多腸道疾病都會導致腸道屏障功能的損傷，而屏障功能的損傷會進一步加劇腸道疾病，乳糜瀉就是其中一種。臨床研究發(fā)現(xiàn)，乳糜瀉患者的腸道屏障往往都會受到一定的破壞，乳糜瀉患者會出現(xiàn)腸道通透性增加[24-25]、緊密連接蛋白表達下降[26]和連蛋白表達顯著上升[27]等癥狀。本實驗通過給小鼠灌胃FITC-Dextran，然后檢測小鼠血清中FITC-Dextran質(zhì)量濃度來評價小鼠的腸道通透性，如圖2A所示，與Control組小鼠相比，CeD組小鼠的血清FITC-Dextran質(zhì)量濃度顯著增加（P＜0.05），說明大量FITC-Dextran從腸道滲透進入血液中，小鼠的腸道通透性增加，小鼠的腸道屏障受到破壞。此外，本實驗通過Western-blot和qPCR分別檢測了緊密連接蛋白Claudin-1（Cldn1）、Occludin（Ocln）、ZO-1（Tjp1）和ZO-2（Tjp2）在蛋白水平和基因水平上的表達情況，以進一步探究CeD組小鼠的腸道屏障功能受損情況。CeD組小鼠Tjp1、Tjp2、Ocln、Cldn1mRNA相對表達量緊密連接蛋白的相對表達量在基因水平和蛋白水平上均顯著降低（P＜0.05、P＜0.001、P＜0.01）（圖2B～F），緊密連接蛋白表達水平的降低會造成細胞間通透性增加，使腸腔內(nèi)的細菌、毒素等物質(zhì)可穿透腸黏膜進入其他組織、器官或循環(huán)系統(tǒng)，發(fā)生細菌或毒素移位，導致疾病[28]。最后，連蛋白是唯一已知的細胞間緊密連接的生理調(diào)節(jié)劑，其表達量上調(diào)會導致屏障功能喪失，造成飲食和微生物抗原不受控制地流入腸道固有層[29]。如圖2G所示，CeD組的連蛋白質(zhì)量濃度高度顯著升高（P＜0.001），進一步表明了小鼠的腸道通透性受到破壞。以上指標的改變都與乳糜瀉中腸道屏障的改變相印證，表明該模型在腸道屏障受損方面可以很好地用于模擬臨床上的乳糜瀉病癥。

圖2 麩質(zhì)引起小鼠腸道屏障的損傷Fig. 2 Gluten caused damage to the intestinal barrier in mice

2.3 麩質(zhì)引起的小鼠炎癥因子的變化

乳糜瀉的發(fā)生除了會導致腸道屏障和腸道病理變化，麩質(zhì)也會刺激腸道內(nèi)的各種細胞釋放不同的炎癥因子，形成局部的免疫反應[19,30]。細胞因子通過對T細胞和其他免疫效應物的影響參與增強或抑制免疫反應[31]。麥醇溶蛋白通過誘導腸上皮細胞中一氧化氮合酶來驅(qū)動氧化應激，以一氧化氮的產(chǎn)生為特征，促進tTG產(chǎn)生和上皮細胞中危險信號的表達，并通過固有層樹突狀細胞刺激白細胞介素（interleukin，IL）-15的激活和分泌。IL-15作用于上皮內(nèi)淋巴細胞（intraepithelial lymphocytes，IELs），促進干擾素（interferon，IFN）γ產(chǎn)生和提高細胞毒性[32]。IL-15和IFN-γ都是乳糜瀉發(fā)生的標志性炎癥因子。如圖3A、B所示，與Control組相比，CeD組中的Il15、IFNGmRNA相對表達量高度顯著升高（P＜0.001），與對臨床患者的研究結(jié)果[33]一致。IL-18是一種促炎細胞因子，在免疫防御中具有重要作用，IL-18能夠促進輔助性T（helper T，Th）1細胞發(fā)育，在乳糜瀉患者的小腸黏膜中高表達[34]。IL-6是一種多效細胞因子，主要由固有層髓系細胞產(chǎn)生以應對腸道損傷，在炎癥反應中具有重要作用，并介導先天和適應性免疫反應[35-36]。IL-4是Th2型細胞因子，主要參與Th2免疫反應。高水平表達的IL-17A是Th17細胞的特征，而IL-27可以刺激Th17細胞的生長發(fā)育，目前已發(fā)現(xiàn)Th17免疫反應參與了乳糜瀉中炎癥的發(fā)生[37]。以上細胞因子都已被發(fā)現(xiàn)在乳糜瀉患者的十二指腸中表達量會顯著升高，并且IL-6和IL-18是乳糜瀉發(fā)生的重要因素，經(jīng)qPCR檢測得到的結(jié)果也與臨床試驗結(jié)果[33]一致，相比Control組，CeD組的Il4、Il6、Il17A、Il18以及Il27mRNA相對表達量（圖3C～G）都出現(xiàn)了極顯著或高度顯著升高（P＜0.01、P＜0.001）。如圖3H所示，CeD組的Il12mRNA相對表達量與Control組比較差異不顯著（P＞0.05），這也與臨床試驗結(jié)果一致，因為盡管IL-12在其他腸道炎癥過程中是IFN-γ的主要誘導劑，但是研究發(fā)現(xiàn)在活動性乳糜瀉中IL-12并不會高表達[38]。結(jié)果表明，該模型可以很好地用于模擬臨床乳糜瀉在炎癥發(fā)生時炎癥因子的變化。

圖3 小鼠十二指腸組織相關(guān)炎癥因子的水平Fig. 3 Levels of inflammatory factors associated with celiac disease in mouse duodenal tissue

2.4 麩質(zhì)引起的小鼠免疫細胞的變化

麩質(zhì)蛋白進入腸道后，在十二指腸的固有層中，TG2選擇性地使麩質(zhì)蛋白脫酰胺，激活CD4＋T細胞，這種識別麩質(zhì)肽的CD4＋T細胞在乳糜瀉發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用，在臨床乳糜瀉病人的十二指腸中，麩質(zhì)特異性的CD4＋T細胞數(shù)量顯著增加并且會長期存在[39]。CeD組小鼠的CD4mRNA相對表達量高度顯著高于Control組（P＜0.001）（圖4A），說明小鼠十二指腸中CD4＋T細胞顯著增加。B細胞和漿細胞可以作為乳糜瀉腸壁中谷蛋白肽的呈遞細胞，同時漿細胞可以產(chǎn)生抗TG2和抗麥醇溶蛋白的抗體[40]，并且漿細胞有助于將免疫細胞聚集到腸道的炎癥部位[41]，研究表明，這兩種細胞在乳糜瀉病人的十二指腸中都顯著增加，在乳糜瀉中最主要的B細胞和漿細胞的標記物主要是CD19和CD138[41-42]。如圖4B、C，與Control組相比，CeD組的小鼠十二指腸組織中CD19mRNA相對表達量顯著增加（P＜0.05），CD138mRNA相對表達量極顯著增加（P＜0.01），說明小鼠十二指腸中的B細胞和漿細胞數(shù)量都顯著增加。巨噬細胞是免疫反應的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑和效應器，可以抵御病原體或有毒的內(nèi)源性成分，并充當其他免疫細胞的抗原呈遞細胞[43]，巨噬細胞數(shù)量在活動性乳糜瀉中出現(xiàn)顯著增加[44]。與Control組相比，CeD組的小鼠十二指腸組織中的CD68mRNA相對表達量高度顯著增加（P＜0.001）（圖4D），這說明小鼠十二指腸中巨噬細胞數(shù)量顯著增加。以上免疫細胞在乳糜瀉中都發(fā)揮著重要作用，是乳糜瀉發(fā)生不可缺少的因素，這些細胞標記物的變化都與臨床上的乳糜瀉病人病理變化相同，說明該實驗模型在免疫方面也可以很好地用于模擬乳糜瀉。

圖4 小鼠十二指腸組織相關(guān)免疫細胞標記物的相對表達水平Fig. 4 Relative expression levels of inflammatory factors associated with celiac disease in mouse duodenal tissue

3 討 論

動物實驗是驗證新的治療方法或藥物有效性及安全性的必經(jīng)步驟，因此開發(fā)能夠模擬臨床上乳糜瀉病人的癥狀的動物模型也是目前乳糜瀉的研究熱點。目前還沒有能夠完全模擬臨床上乳糜瀉癥狀的動物模型，各種動物模型都只能模擬乳糜瀉發(fā)病過程中的一部分癥狀。BALB/c小鼠是一種傾向主導Th2型免疫反應的品系，目前已被廣泛用于構(gòu)建多種食物過敏動物模型。通過流行病學的研究和觀察發(fā)現(xiàn)，當堅持無麩質(zhì)飲食時，乳糜瀉患者的病情進入緩解期，而當乳糜瀉患者開始重新攝入麩質(zhì)食物時，病情又會復發(fā)，這確定了麩質(zhì)在乳糜瀉發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用。同時有研究證明，將低麩質(zhì)飲食改為富含麩質(zhì)的飲食之后，人們患乳糜瀉的概率會增加[45]。本實驗先以無麩質(zhì)飼料飼喂BABL/c小鼠，從小鼠的飲食中消除麩質(zhì)，使小鼠對麩質(zhì)產(chǎn)生不耐受，從而加劇小鼠對攝入麩質(zhì)的免疫反應，引發(fā)腸病，并且為了使這種不耐受更加敏感，采用了連續(xù)無麩質(zhì)飼養(yǎng)3 代以上的小鼠。

在建造乳糜瀉模型時，還需要考慮麩質(zhì)的攝入方式。常見的攝入外源物質(zhì)的方式有口服、灌胃、腹腔注射和皮下注射等，其中口服和灌胃與人類攝入麩質(zhì)的途徑是最相似的，但是這兩種方法容易使小鼠產(chǎn)生口服耐受，影響造模效果；腹腔注射、肌肉注射和皮下注射等雖然可以避免口服耐受，但是與人類攝入麩質(zhì)的方式有一定差異；因此，在本研究中選擇了口服麩質(zhì)（添加在小鼠飼料中）并輔以腹腔和肌肉（腳掌）注射的致敏方式，以期在避免口服耐受的同時，保證攝入的方式與人類攝入麩質(zhì)的途徑相似。此外，為增強抗原的免疫原性，加強免疫效果，縮短造模時間，本實驗采用了弗氏完全佐劑作為免疫佐劑來加強小鼠的免疫反應。

十二指腸的絨毛長度縮短、隱窩增生是診斷乳糜瀉發(fā)生的金標準。研究發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，CeD組小鼠的小腸絨毛長度明顯縮短，V/C值也高度顯著降低（P＜0.001），TGM2mRNA相對表達量高度顯著升高（P＜0.001），tTG活力極顯著增大（P＜0.01），在表觀層面上可以判定模型構(gòu)建成功。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，麥醇溶蛋白會刺激小鼠的腸細胞釋放連蛋白，而連蛋白會調(diào)節(jié)小鼠緊密連接蛋白之間的連接和排布，影響小鼠的腸道通透性，所以連蛋白質(zhì)量濃度的增加和腸道通透性的升高也可以看做是乳糜瀉發(fā)生的一個重要指標。通過測定腸道通透性、緊密連接蛋白相對表達量和連蛋白質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)CeD組小鼠的腸道屏障受到了明顯的破壞。進一步確定模型構(gòu)建成功。

乳糜瀉是一種自身免疫性疾病，所以模型構(gòu)建是否成功，小鼠體內(nèi)炎癥因子和免疫細胞的變化情況也是非常重要的判定指標。用qPCR檢測相關(guān)的炎癥因子和免疫細胞的表面標記物的基因表達情況，與Control組相比，CeD組中小鼠體內(nèi)的多種促炎性因子的基因相對表達量均極顯著或高度顯著升高（P＜0.01、P＜0.001），同時在乳糜瀉免疫過程中起著重要作用的CD4＋T細胞、巨噬細胞、漿細胞和B細胞的表面標志物水平也都顯著增長，從而能夠確定該模型在免疫方面也可以用于模擬人類臨床上的乳糜瀉。

4 結(jié) 論

本研究通過無麩質(zhì)飲食飼養(yǎng)小鼠3 代以上，飼喂含麩質(zhì)的飼料30 d，輔以腹腔和肌肉注射麥醇溶蛋白進行刺激，可以使小鼠的十二指腸絨毛長度明顯縮短、V/C值顯著減小，同時會破壞小鼠的腸道屏障，增加小鼠腸道通透性。此外，TG2、IL-15和IFN-γ這3 種乳糜瀉發(fā)生的標志性產(chǎn)物對應mRNA（TGM2、Il15和IFNG）的相對表達量都高度顯著增加（P＜0.001）。十二指腸中與乳糜瀉發(fā)病機制有關(guān)的免疫因子以及產(chǎn)生免疫因子的細胞數(shù)量均顯著增加，與乳糜瀉臨床病人的病理特征一致。結(jié)果表明，該小鼠模型可以用于模擬乳糜瀉疾病在臨床上的組織病理學特征和常見生物標志物的表達，可應用于未來乳糜瀉潛在的治療措施（如改善腸道環(huán)境、阻斷炎癥反應等方法）研究中或與之相關(guān)的功能性食品的開發(fā)中。

目前乳糜瀉的研究進展還比較緩慢，主要原因之一是當前關(guān)于乳糜瀉的研究模型較少，并且已有的動物模型都還不能完全模擬人體內(nèi)乳糜瀉的發(fā)病過程，現(xiàn)有的模型都只能模擬部分癥狀，這些模型可以對乳糜瀉的相關(guān)特征進行分離，有助于幫助理解每個特定因素在乳糜瀉的病理機制中的作用，并且可以為開發(fā)乳糜瀉新的治療方法提供思路，但是這也是目前乳糜瀉動物模型依然存在的缺陷，所以如何構(gòu)建出更全面的乳糜瀉動物模型仍是未來乳糜瀉研究關(guān)注的重點之一。