黃湘湄，黃 和，秦小明，范秀萍

（廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，廣東 湛江 524088）

珍珠龍膽石斑魚（♀Epinephelus fuscoguttatus×♂Epinephelus lanceolatus）是一種生長速度快、抗病力強且養(yǎng)殖產量高的暖水性海水經濟魚類，具有膠原蛋白含量高、肉質纖維細膩等優(yōu)點[1]。傳統(tǒng)珍珠龍膽石斑魚鮮活運輸過程中常因水質惡化、缺氧、振動等不利因素產生應激反應，導致其劇烈掙扎，極易相互扎傷造成死亡[2-4]。提高存活質量已成為珍珠龍膽石斑魚?；钸\輸的核心關注點。無麻醉劑添加的低溫休眠無水保活運輸是一種低成本、高存活率、高運載量、品質變化小的綠色安全新型活體流通模式，具有廣闊的應用前景[5]。氧化應激和免疫防御失衡是生物體應對環(huán)境脅迫時的應答反應，魚類在不適環(huán)境下觸發(fā)氧化應激，引起免疫系統(tǒng)失衡，甚至造成組織損傷，進而影響?；钚Ч鸞6-8]。

氣調包裝是將一種或多種氣體充入包裝袋中以維持新鮮度與品質，進而延長食品貨架期的技術[9]，在黑鯛[10]、泥蚶[11]、鯽魚[12]、海灣扇貝[13]、黃顙魚[14]、大菱鲆[15]、凡納濱對蝦[16]、花鱸[17]等水產品?；钪幸训玫匠醪窖芯?，但氣體比例研究范圍過于寬泛，主要聚焦于純氧；而珍珠龍膽石斑魚鮮見氣調包裝相關的報道。本研究旨在探討珍珠龍膽石斑魚在純氧和氣調無水環(huán)境下?；钸\輸的存活情況以及應激水平、血清生化指標、物質代謝、抗氧化能力的響應機制，解析珍珠龍膽石斑魚氣調無水?；畲婊顧C理，為其氣調無水?；钸\輸的實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

珍珠龍膽石斑魚（1 齡，平均體質量（529.8±15.4）g，平均體長（31.65±2.89）cm，購自廣東湛江市東風水產品批發(fā)市場，加水充氧運輸至實驗室。挑選大小均勻、體表無損傷、健康無病害的石斑魚，在暫養(yǎng)池（119 cm×89 cm×32 cm）中暫養(yǎng)24 h用于后續(xù)實驗。暫養(yǎng)池條件：采用新鮮過濾海水，鹽度20‰～24‰、水溫18～20 ℃、溶解氧量6.5～8.5 mg/L、pH（7.2±0.5）、魚密度為85 g/L。

A045-3總蛋白（total protein，TP）、C013-2-1尿素氮（urea nitrogen，BUN）、C012-2-1尿酸（uric acid，UA）、C011-2-1肌酐（creatinine，CREA）、C010-2-1谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、C009-2-1谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、A110-1-1甘油三酯（triglyceride，TG）、A111-1總膽固醇（total cholestol，TC）、A043-1-1糖原、A019-2-1乳酸、A020-2乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、A060-2酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、A059-2堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、A084-1-1過氧化物酶（peroxidase，POD）、A006-2-1還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、A003-1丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、A015-2-1總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、A001-3總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；魚皮質醇酶聯免疫分析試劑盒江蘇酶免實業(yè)有限公司；葡萄糖測定試劑盒 上海榮盛生物藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設備

CK-901冷卻機組 深圳祎祎科技有限公司；GXZ-280D智能型光照培養(yǎng)箱 寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司；Cary紫外-可見分光光度計 美國安捷倫科技有限公司；Varioskan Flash全自動酶標儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ?；钚Ч麣怏w環(huán)境的確定

參照徐德峰等[16]的方法，珍珠龍膽石斑魚經停食暫養(yǎng)24 h后，采用梯度降溫模式[3]（20～15 ℃、2 ℃/h，15～10 ℃、1 ℃/h）冷馴化至休眠。將休眠狀態(tài)的20 尾珍珠龍膽石斑魚用海綿包裹保持魚體濕潤，迅速放于雙層自封袋內，向袋中分別充入純氧或85%氧氣＋15%氮氣，用橡皮筋扎緊袋口，置于15 ℃培養(yǎng)箱中靜態(tài)模擬運輸，記錄存活時長。以放入水環(huán)境可恢復至正常游動狀態(tài)為有效保活，并計算存活率。

1.3.2 實驗設計

珍珠龍膽石斑魚經停食暫養(yǎng)24 h后，挑選60 尾大小均一、行為活動正常、無機械性損傷的珍珠龍膽石斑魚模擬無水?；钸\輸，將其隨機分為10 組，每組6 尾。分別于暫養(yǎng)24 h后直接取樣，記為正常對照組（NC組）；暫養(yǎng)后按照1.3.1節(jié)進行休眠，取樣，記為休眠組（DC組）；將休眠后魚體裝入自封袋中分別充入純氧或85%氧氣＋15%氮氣，無水?；?、6、10 h，并在10 h后于室溫海水復蘇6 h，取樣，其中充入85%氧氣＋15%氮氣組記為氣調組（AC組），無水保活2、6、10 h以及復蘇6 h組分別記為AC 2 h、AC 6 h、AC 10 h、AC 10 h＋R 6 h組；以純氧組（PC組）為對照，參照AC組的分組分別記為PC 2 h、PC 6 h、PC 10 h、PC 10 h＋R 6 h組。

1.3.3 血清生化指標的測定

參照劉驍等[18]的方法，用200 mg/L MS-222快速麻醉魚體，10 mL注射器插入尾靜脈取血，全血不加抗凝劑，4 ℃靜置2 h，待血液明顯分層后以3 000 r/min、4 ℃離心20 min取血清，-80 ℃凍存待測。血清皮質醇含量通過相應試劑盒采用酶聯免疫吸附試驗法測定；TP、葡萄糖、BUN、UA、CREA、TG、TC、POD、AST、ALT、ACP、ALP水平均采用相應試劑盒進行測定。

1.3.4 肌肉和肝臟物質代謝及抗氧化指標的測定

參照李盧等[19]的方法，取背部肌肉和肝臟，用預冷至4 ℃的無菌生理鹽水洗凈表面血跡并用濾紙吸干表面水分，絞碎分裝，液氮速凍后于-80 ℃下凍存待測。糖原、乳酸、LDH、GSH、MDA、SOD、T-AOC、CAT水平測定均嚴格按照相應試劑盒說明書進行。

1.4 數據處理與分析

采用JMP Pro 14.0軟件對實驗數據進行統(tǒng)計及顯著性分析，結果以平均值±標準差表示。在單因素方差分析基礎上，結合Tukey檢驗進行Duncan多重比較，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin Pro 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 純氧與氣調環(huán)境對珍珠龍膽石斑魚無水保活過程中存活率的影響

如圖1所示，保活過程中無水環(huán)境協(xié)同低溫脅迫下珍珠龍膽石斑魚陸續(xù)死亡。氣調組生存時間（（13.88±1.00）h）顯著長于純氧組（（10.90±0.66）h）。可能由于休眠狀態(tài)的珍珠龍膽石斑魚呼吸頻率減緩，新陳代謝水平降低，且低溫環(huán)境能夠大大降低機體的耗氧量，只進行微弱呼吸作用即可滿足其生理需求；而高濃度氧氣增加了氧自由基含量[17]，造成魚體細胞損傷，因此85%氧氣環(huán)境更有利于珍珠龍膽石斑魚的無水?；睢?/p>

圖1 純氧與氣調環(huán)境對珍珠龍膽石斑魚無水?；钸^程中存活率的影響Fig. 1 Effects of pure oxygen and controlled atmosphere environment on survival rate of grouper during waterless live transportation

2.2 氣調無水?；钸^程中珍珠龍膽石斑魚應激水平的變化

魚體發(fā)生應激反應時生命活動劇烈、新陳代謝旺盛，不僅導致血糖水平變化，還會引起各項激素水平變化。皮質醇作為反應鏈分泌的最后一種激素，其含量隨應激強度的增大而升高，因此皮質醇、血糖水平通常被用作評價魚類應激反應程度的指示性指標[4,20]。如圖2A所示，純氧組和氣調組珍珠龍膽石斑魚血清皮質醇濃度均先上升后下降，并在?；? h達到峰值，分別為（154.90±5.26）mmol/L和（147.68±9.49）mmol/L，顯著高于其余?；罱M（P＜0.05）。推測原因可能是包裝袋中氧氣的消耗以及二氧化碳的積累造成生存環(huán)境惡化，從而引起魚體應激，逐漸適應環(huán)境后皮質醇含量有所下降。但?；?0 h復蘇后珍珠龍膽石斑魚皮質醇濃度仍顯著高于NC組，表明應激反應沒有完全消除。由圖2B可知，與NC組對比，其余組血糖濃度均顯著增加（P＜0.05）。休眠過程冷應激導致魚體血糖水平急劇升高，血糖濃度達到（5.45±0.15）mmol/L。?；畛跗隰~體適應低溫及無水環(huán)境，體內糖原轉化為葡萄糖供給能量維持機體功能運作；隨后饑餓脅迫或環(huán)境應激導致魚體代謝活動增強，魚體所需能量增多，糖原分解加速使血糖濃度增加。復蘇階段魚體饑餓并不斷消耗能量，血糖不斷被分解供給機體能量，故其濃度較復蘇前顯著下降。

圖2 氣調無水?；钸^程中珍珠龍膽石斑魚應激水平的變化Fig. 2 Changes in stress levels in grouper under modified atmosphere during waterless live transportation

2.3 氣調無水保活過程中珍珠龍膽石斑魚血清生化指標的變化

如表1所示，冷脅迫休眠DC組血清BUN、UA、CREA濃度與NC組無顯著差異（P＞0.05），隨無水?；顣r間的延長三者含量均呈上升趨勢，復蘇后有所下降；且純氧組上升幅度明顯高于氣調組。冷脅迫休眠DC組AST、ALT活力均較NC組顯著上升（P＜0.05），無水保活階段AST、ALT活力均穩(wěn)步上升，PC 10 h組達到峰值，分別為（262.22±1.54）、（232.05±1.87）U/L，顯著高于AC 10 h組（P＜0.05）。無水?；钸^程中ACP活力逐漸上升，且在氣調環(huán)境中可維持于較高水平。ALP、POD活力隨無水?；顣r間的延長整體呈降低趨勢，復蘇6 h后均有所上升。TG、TC濃度在保活過程中逐漸降低，且在純氧和氣調環(huán)境中變化幅度差異不明顯。

低溫及無水環(huán)境脅迫下，魚體能量消耗增加，神經激素分泌減少，消化酶活性降低，代謝分泌系統(tǒng)受損，導致魚類代謝紊亂[21]。BUN、UA、CREA均由腎臟代謝排出，是反映腎功能的重要指標。腎臟損傷引起功能衰竭、炎癥時血液BUN水平增加[3]。腎臟功能衰退時UA、CREA水平也會升高[14]。隨著無水?；顣r間的延長，BUN、UA、CREA濃度均呈上升趨勢，可能是由于低溫及無水環(huán)境脅迫下魚體應激強烈，皮質醇分泌增多刺激血清BUN水平上升，同時魚體腎臟損傷，發(fā)生UA、CREA濾過或滲出障礙，進而造成血清中UA、CREA濃度升高。復蘇后魚體血清BUN、UA、CREA濃度升高有所緩解，但三者濃度均顯著高于NC組（P＜0.05），這可能是珍珠龍膽石斑魚無法進行長時間無水運輸的原因。此外，氣調環(huán)境下BUN、UA、CREA濃度的增加幅度明顯低于純氧環(huán)境，說明氣調環(huán)境可減緩珍珠龍膽石斑魚腎臟損傷的程度。

AST、ALT是魚類重要的轉氨酶，主要存在于肝臟和心肌細胞中，血清中含量極低；當肝細胞受損時，AST和ALT被釋放到血液中，因此血清AST和ALT活力的增加被認為是評價肝功能損傷最具特異性和廣泛使用的指標[22]。冷脅迫下，AST、ALT活力較NC組顯著上升（P＜0.05），魚體肝細胞受到一定程度損傷。隨著無水?；畹倪M行，AST、ALT活力均穩(wěn)步上升，復蘇6 h后兩者活力有所下降，但仍處于較高水平。這可能是長時間處于低溫無水環(huán)境，機體代謝逐漸以無氧呼吸為主，體內抗氧化系統(tǒng)失衡，導致珍珠龍膽石斑魚肝臟出現不可逆損傷。且PC 10 h組AST、ALT活力顯著高于AC 10 h組（P＜0.05），說明純氧環(huán)境魚體肝臟受損較嚴重，這可能是導致純氧環(huán)境無水?；顣r間較短的主要原因。

溶酶體可通過水解細菌細胞壁組分清除細菌，因此常用作指示水生生物功能防御和健康狀況的標志物。溶酶體膜通透性降低會釋放ALP、ACP等酶類，ALP和ACP可直接參與魚體中磷酸基團的轉移及鈣磷代謝，還能夠改變病原體的表面結構以增強機體對病原體的識別和吞噬能力[23-24]。POD是免疫相關酶，可將超氧自由基轉化為無毒的水和氧，以避免細胞損傷，POD水平可間接反映機體免疫水平[25]。無水?；钸^程中ACP活力逐漸升高，且在氣調環(huán)境下維持在較高水平，這是由于生存環(huán)境脅迫刺激珍珠龍膽石斑魚免疫應答，引起ACP活力增強，進而增強機體免疫防御能力。ALP、POD活力隨無水?；顣r間的延長而降低，復蘇6 h后有所上升，表明低溫無水環(huán)境脅迫下魚體機體代謝活動下降或免疫能力降低，復蘇6 h并不能使魚體恢復正常的代謝和免疫能力。

TG和TC是動物細胞儲藏脂質的主要形式，也是細胞膜的重要組成部分[26]。無水?；钸^程中，血清TG、TC濃度下降的原因有兩方面：一是未進食條件下魚體內能量物質的消耗；二是生存環(huán)境脅迫下肝臟損傷阻礙了腸-肝循環(huán)的正常運行。復蘇階段TG、TC濃度較復蘇前顯著上升（P＜0.05），可能是水體環(huán)境使魚體恢復活力狀態(tài)，TG通過腸-肝循環(huán)被肝臟重吸收導致。

表1 氣調無水?；钸^程中珍珠龍膽石斑魚血清生化指標的變化Table 1 Changes in serum biochemical indexes of grouper under modified atmosphere during waterless live transportation

2.4 氣調無水?；钸^程中珍珠龍膽石斑魚物質代謝的變化

魚體在逆境條件機體應激，能量消耗增加，導致能量代謝酶活性和代謝模式改變，從而引起機體內呼吸與能量代謝變化以維持穩(wěn)態(tài)[2]。糖原主要存在于肌肉和肝臟中，是重要的能量來源，可作為反映動物生命代謝能力的重要指標。由圖3A、B可知，冷脅迫休眠下DC組肌糖原、肝糖原含量分別較NC組顯著下降了17.65%、27.34%（P＜0.05）。推測原因是冷脅迫導致皮質醇釋放，加快糖原分解，以滿足機體快速代謝需求，導致糖原含量顯著下降。隨著無水保活時間的延長，糖原含量進一步降低，且純氧環(huán)境下降幅度大于氣調環(huán)境，這可能是饑餓或環(huán)境脅迫導致魚體代謝活動增強，促進能量消耗，使魚體糖原進一步分解，復蘇后魚體游動正常消耗能量。表明氣調環(huán)境下珍珠龍膽石斑魚對環(huán)境的適應能力明顯優(yōu)于純氧環(huán)境下，與張玉晗等[17]研究結果基本一致。

乳酸是反映生物體能量代謝水平的重要指標[18]，作為糖原酵解的代謝產物，短時蓄積會阻礙ATP合成，降低機體運動能力，其含量與肌糖原含量呈負相關[19,27]。低溫休眠DC組肌肉、肝臟乳酸含量顯著高于NC組（P＜0.05），表明此時機體有氧代謝水平降低，無氧代謝水平升高。隨著無水保活時間的延長，乳酸含量明顯增加，復蘇后魚體進行正常呼吸，血清乳酸含量恢復到正常水平。無水?；?0 h純氧環(huán)境乳酸積累量顯著高于氣調環(huán)境（P＜0.05），乳酸積累阻礙了ATP的合成，造成代謝紊亂，從而對魚體造成一定程度損傷，這也可能是氣調環(huán)境?；顣r長高于純氧環(huán)境的重要原因。

LDH在糖代謝中催化丙酮酸無氧代謝生成乳酸，其活性主要取決于機體細胞內氧分壓[28]。如圖3E所示，肌肉LDH活力呈波動變化，其余組與NC組對比LDH活力均有所上升，可能是細胞內氧分壓降低時，LDH合成加快，導致其活力增強。如圖3F所示，肝臟LDH活力隨?；顣r間的延長而顯著上升（P＜0.05），表明?；钸^程中氧氣充足，但魚體細胞內氧氣與血紅蛋白的結合受到影響，魚體主要以無氧代謝供能。各保活階段氣調環(huán)境中LDH活力明顯低于純氧環(huán)境，進一步驗證了氣調環(huán)境更有利于珍珠龍膽石斑魚的無水保活。

圖3 氣調無水?；钸^程中珍珠龍膽石斑魚肌肉和肝臟糖原含量（A、B）、乳酸含量（C、D）、LDH活力（E、F）的變化Fig. 3 Changes in glycogen content (A, B), lactic acid content (C, D)and LDH activity (E, F) in muscle and liver of grouper under modified atmosphere during waterless live transportation

2.5 氣調無水保活過程中珍珠龍膽石斑魚抗氧化能力的變化

低溫協(xié)同無水環(huán)境脅迫過程中魚體產生氧化應激引發(fā)體內自由基異常增多，該過程體內活性氧會不斷積累進而誘發(fā)脂質過氧化[2]。MDA是脂質過氧化的重要產物之一，其可破壞組織細胞膜的流動性、通透性和完整性，使魚體肝臟細胞膜系統(tǒng)、滲透壓調節(jié)等功能出現故障，甚至導致魚體死亡[29]。如圖4A、B所示，無水脅迫過程中，MDA含量呈上升趨勢，且各實驗組均顯著高于NC組（P＜0.05），可能是由于抗氧化酶受到抑制，清除自由基能力有限，致使MDA含量上升。肌肉、肝臟中MDA含量在純氧環(huán)境無水保活10 h時達到峰值，分別為（7.98±0.05）、（32.97±0.30）nmol/mg，顯著高于氣調組（P＜0.05），說明高氧環(huán)境下珍珠龍膽石斑魚肌肉和肝臟氧化應激損傷較為嚴重。復蘇階段MDA含量顯著下降，可能是由于抗氧化系統(tǒng)被激活，過多的MDA被清除從而維護體內氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡。

環(huán)境脅迫下魚類產生大量氧自由基造成氧化脅迫，機體內抗氧化酶基因轉錄水平隨之升高，抗氧化酶活力增強，以清除氧自由基，保護機體免受脅迫損傷[2]。CAT、SOD活力、T-AOC和GSH含量均可反映機體的氧化防御機能[17,30]。如圖4C～J所示，肌肉CAT活力隨保活時間的延長顯著增加（P＜0.05），肌肉SOD活力、T-AOC、GSH含量有所上升，復蘇后均顯著下降。冷脅迫休眠下肝臟CAT、T-AOC、SOD水平均與NC組無顯著差異（P＞0.05），GSH含量顯著高于NC組（P＜0.05）。隨著低溫無水環(huán)境脅迫時間的延長，肝臟CAT、SOD、T-AOC、GSH水平均呈逐步上升趨勢，且純氧環(huán)境中上升幅度明顯高于氣調環(huán)境，PC 10 h組4 項指標均達到最大值。這可能是低溫脅迫無水?；顟ご碳~體產生氧自由基，導致機體抗氧化系統(tǒng)激活，抗氧化酶活性增強以減輕運輸應激對機體的損傷；高氧導致魚體產生過多的氧自由基，抗氧化酶處于抗逆性較強的水平，具體機制有待后續(xù)研究。復蘇6 h后，由于魚體通過自身調節(jié)抗氧化系統(tǒng)基本恢復至正常水平，提示珍珠龍膽石斑魚可通過提升體內抗氧化酶活性以抵抗氧化損傷。過高的氧氣濃度會導致魚體出現過多的氧自由基，細胞內自由基不能被及時清除，攻擊生物細胞中蛋白質、脂肪和核酸等，為抵御攻擊機體抗氧化防御體系受到激發(fā)，引起抗氧化酶活力的變化[17]。

圖4 氣調無水?；钸^程中珍珠龍膽石斑魚肌肉和肝臟MDA含量（A、B）、CAT活力（C、D）、SOD活力（E、F）、T-AOC（G、H）、GSH含量（I、J）的變化Fig. 4 Changes in levels of MDA (A, B), CAT (C, D), SOD (E, F),T-AOC (G, H) and GSH (I, J) in muscle and liver of grouper under modified atmosphere during waterless live transportation

3 結 論

氣調環(huán)境下珍珠龍膽石斑魚無水?；顣r間為（13.88±1.00）h，顯著長于純氧環(huán)境。血清皮質醇濃度均呈先上升后下降的趨勢。與NC組對比，保活過程中其余各組血糖濃度均顯著增加（P＜0.05）。BUN、UA、CREA濃度在冷脅迫休眠下與NC組無顯著差異（P＞0.05），隨無水保活時間的延長，三者濃度均呈上升趨勢，復蘇6 h后有所下降；且純氧環(huán)境上升幅度明顯高于氣調環(huán)境。無水?；铍A段AST、ALT、ACP活力均穩(wěn)步上升，ALP、POD活力隨脅迫時間的延長降低，復水6 h后均有所上升。TG、TC含濃度在?；钸^程中逐步降低，且在純氧和氣調環(huán)境中變化趨勢無明顯差異。隨著無水保活時間的延長，肌糖原、肝糖原含量逐步減少，且純氧環(huán)境下降幅度高于氣調環(huán)境。肌肉、肝臟乳酸含量隨著無水?；顣r間的延長而明顯增加，復蘇后恢復至正常水平。各?；铍A段氣調環(huán)境中肝臟LDH活力均顯著低于純氧環(huán)境（P＜0.05）。無水脅迫過程中肌肉和肝臟MDA含量呈上升趨勢，均顯著高于NC組（P＜0.05）。肌肉中CAT活力隨?；顣r間的延長顯著增加（P＜0.05），SOD、T-AOC、GSH水平有所上升，復蘇后均顯著下降。冷脅迫休眠下肝臟CAT、SOD活力、T-AOC均隨低溫無水環(huán)境脅迫時間的延長呈逐步上升趨勢，且純氧環(huán)境中上升幅度明顯高于氣調環(huán)境。綜上，低溫無水脅迫下珍珠龍膽石斑魚觸發(fā)應激反應，造成氧化應激和免疫系統(tǒng)失衡，組織器官出現不可逆損傷；相比較于純氧環(huán)境，氣調環(huán)境可有效減輕無水?；钸^程中珍珠龍膽石斑魚腎臟、肝臟的氧化應激損傷程度，機體能量物質代謝、抗氧化系統(tǒng)及免疫防御系統(tǒng)調控能力較強，可在低溫無水脅迫環(huán)境下較好地維持機體正常生理代謝，更有利于珍珠龍膽石斑魚的無水保活。