馬電通，呂鶴飛，常雪苗，黃二賓，杜嶸宇，田登娟，王 芳,2，鄧 佳,3,*

（1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；3.西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

砂糖橘（Citrus reticulatacv. Shatangju）又名十月橘、冰糖橘等，原產(chǎn)于廣東四會(huì)，是蕓香科柑橘屬植物，砂糖橘果實(shí)顏色橙黃、皮薄、易剝離，其果肉具有爽脆、汁多、清甜等特點(diǎn)[1]，砂糖橘果實(shí)含有多種對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、VC、可溶性固形物、礦質(zhì)元素（Ca、Mg、Na、K）和微量元素（Fe、Mn、Cu、Zn）等[2]。但柑橘屬植物果實(shí)在采后運(yùn)輸貯藏過(guò)程中容易發(fā)生青霉、綠霉病害[3]，其中以意大利青霉（Penicillium italicum）、擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）和指狀青霉（Penicillium digitatum）引起的柑橘青霉、綠霉病是柑橘類(lèi)果實(shí)貯藏運(yùn)輸過(guò)程中為最嚴(yán)重、發(fā)生率最高的病害[4]。目前，柑橘類(lèi)果實(shí)采后的貯藏保鮮方式主要為化學(xué)殺菌劑[5-6]，但化學(xué)殺菌劑具有毒性、抗藥性、危害人類(lèi)健康和污染生存環(huán)境等缺點(diǎn)[7]，因此需尋找新的防治方法來(lái)代替化學(xué)殺菌劑的使用，從而達(dá)到安全、高效和大量應(yīng)用的防治目的。拮抗酵母作為生物防治手段中的一種，因具有不產(chǎn)生毒素、安全系數(shù)高、可與化學(xué)物質(zhì)配合使用等多種優(yōu)點(diǎn)[8-9]，被應(yīng)用于采后果品貯藏病害的防治。但拮抗酵母單獨(dú)作用于果實(shí)，其拮抗效力不及化學(xué)殺菌劑[10]，研究表明，通過(guò)添加糖類(lèi)保護(hù)劑可以有效提高酵母的存活率、耐受性和抗逆性，從而保證其生防效力，如Zhao Lina等[11]研究發(fā)現(xiàn)，使用0.5%海藻糖誘導(dǎo)培養(yǎng)Pichia caribbica酵母處理采后草莓，可顯著降低草莓接種灰霉病的發(fā)病率，增強(qiáng)草莓多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）等防御酶的活力，從而表現(xiàn)出較好的生防效力；閆巖等[3]研究發(fā)現(xiàn)，1.2%幾丁質(zhì)誘導(dǎo)漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）（107CFU/mL）處理砂糖橘果實(shí)，能夠降低對(duì)砂糖橘果實(shí)接種指狀青霉（P. dititatum）的發(fā)病率和腐爛指數(shù)，還提高了果實(shí)體內(nèi)GLU活力。

羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）是纖維素的羧甲基化衍生物，是一種多糖類(lèi)物質(zhì)，呈白色或淡黃色纖維狀粉末狀，無(wú)臭、無(wú)味，在食品中具有廣泛的用途，常作為食品的添加劑和果蔬的保鮮劑[12-13]。在果實(shí)應(yīng)用方面，張方艷等[14]研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃果實(shí)經(jīng)不同濃度CMC浸泡處理后，均能降低果實(shí)的腐敗率和質(zhì)量損失率，其還能使獼猴桃果實(shí)營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量保持在較高水平；張晶琳等[15]研究發(fā)現(xiàn)，將CMC作為涂膜材料用于柑橘果實(shí)，能保持柑橘果實(shí)營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量、減少果實(shí)表面氣孔數(shù)量及開(kāi)孔率，降低果實(shí)營(yíng)養(yǎng)消耗及其質(zhì)量損失率。但CMC能否用作生防酵母菌的保護(hù)劑，其對(duì)酵母生防效力是否有誘導(dǎo)增效作用還不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)采用CMC作為糖保護(hù)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii），研究CMC誘導(dǎo)酵母對(duì)采后砂糖橘果實(shí)青霉、綠霉病害的生防效果，并探究其對(duì)果實(shí)的誘導(dǎo)抗病生理，以期為提高酵母對(duì)果品采后病害的生防效力提供新思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

砂糖橘（Citrus reticulatacv. Shatangju）購(gòu)于昆明市白龍村菜市場(chǎng)。從中挑選出飽滿圓潤(rùn)、無(wú)機(jī)械傷、大小均一、無(wú)病蟲(chóng)害、成熟度一致的果實(shí)；用蒸餾水洗凈并用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液擦拭后放置于塑料筐，于室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

C. laurentii（ATCC18803）購(gòu)于廣東微生物研究所。用YM液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，使用濃度為1×107CFU/mL（血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)），備用。P. expansum（引起青霉?。┖蚉. digitatum（引起綠霉?。榍捌诜蛛x自采后葡萄柚發(fā)病果實(shí)，保存于實(shí)驗(yàn)室，使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）于28 ℃培養(yǎng)，使用時(shí)，將病原菌孢子濃度調(diào)至1×105CFU/mL（血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)），備用。

CMC 上海騰準(zhǔn)生物科技有限公司；蛋白胨、麥芽浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；酵母粉 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；瓊脂 上海致化化學(xué)科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸 成都市科龍化工試劑廠；苯酚西隴化工股份有限公司；酚酞、亞硫酸鈉、草酸、氫氧化鈉、甲醇、酒石酸鉀鈉 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；鹽酸 云南楊林汕滇藥業(yè)有限公司；2,6-二氯酚靛酚鈉 北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CP214電子天平 蘇州賽恩斯儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MIKRO 220R冷凍型臺(tái)式高速離心機(jī) 廣東市華粵儀器有限公司；HH-B11-BS-II恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；TS-2102C恒溫?fù)u床 上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；702型超低溫冰箱 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；70型離子交換純水器 上海南華醫(yī)療器械；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；UV6100紫外-可見(jiàn)分光亮度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；AF103商用制冰機(jī) 美國(guó)斯科茨曼公司；YS100型電子顯微鏡 日本Nikon公司；Brix手持袖珍數(shù)顯折射儀 日本Atago公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

YM液體培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g、葡萄糖10.0 g、酵母粉3.0 g、麥芽浸粉3.0 g溶于1 L去離子水，pH值自然；121 ℃滅菌21 min。自然冷卻后，備用。

PDA培養(yǎng)基：土豆200.0 g、瓊脂20.0 g、葡萄糖20.0 g溶于1 L去離子水，pH值自然；121 ℃滅菌21 min，趁熱倒于平皿中，自然冷卻后，備用。

1.3.2 CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)C. laurentii抑制砂糖橘青霉、綠霉病效果分析

參照王蕓[16]的實(shí)驗(yàn)方法略作修改，將處理好的砂糖橘置于超凈工作臺(tái)，并分為兩組。第一組：在果實(shí)赤道部位用已消毒的打孔釘?shù)染嗑鶆虻卮? 個(gè)孔（直徑4 mm、深約5 mm），每個(gè)孔打入20 μL誘導(dǎo)酵母液，分別為添加0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)24、48 h和72 h的C. laurentii菌懸液（0.5% CMC-C. laurentii，CMC誘導(dǎo)濃度選擇參照本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[17]及未發(fā)表研究結(jié)果），2 h后，分別向每個(gè)孔中，再打入20 μLP. expansum孢子懸浮液；第二組：果實(shí)回接處理同上，再接種20 μLP. digitatum孢子懸浮液。不同誘導(dǎo)時(shí)間的誘導(dǎo)酵母液處理重復(fù)3 次，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次，共36 個(gè)果實(shí)。果實(shí)接種完畢后，置于塑料筐室溫條件（25 ℃、相對(duì)濕度80%）保存，每天觀察果實(shí)病斑直徑和發(fā)病率，至果實(shí)病斑相接即停止觀察。采用十字交叉法測(cè)量果實(shí)病斑直徑/cm。發(fā)病率按下式計(jì)算。

1.3.3 CMC-C. laurentii處理對(duì)砂糖橘果實(shí)抗青霉、綠霉病效果分析

參照1.3.2節(jié)的操作方法略作修改，把已處理好的砂糖橘果實(shí)分別打孔，每個(gè)孔分別打入20 μL以下溶液，對(duì)照組（CK）：無(wú)菌水；處理組1（C. laurentii）：未添加CMC，培養(yǎng)72 h的C. laurentii菌懸液；處理組2（0.5% CMC-C. laurentii）：添加0.5% CMC，培養(yǎng)72 h的C. laurentii菌懸液。2 h后，把上述3 種處理果實(shí)分別均勻分為兩組：第一組分別再向每個(gè)孔中回接20 μLP. expansum孢子懸浮液；第二組回接20 μLP. digitatum孢子懸浮液。每個(gè)處理分別用3 個(gè)果實(shí)，每個(gè)果實(shí)打3 個(gè)孔，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次，共24 個(gè)果實(shí)。果實(shí)接種完畢后，置于塑料筐室溫條件（25 ℃、相對(duì)濕度80%）保存，每天觀察果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑，至CK組全部發(fā)病即停止觀察。發(fā)病率計(jì)算和病斑直徑測(cè)量同1.3.2節(jié)。

1.3.4 砂糖橘果實(shí)抗病酶活力和抗性物質(zhì)含量的測(cè)定

參照1.3.2節(jié)的操作方法略作修改，把已消毒處理的果實(shí)分為3 組，分別于下列溶液中浸泡3 min；CK組：無(wú)菌水；處理組1（C. laurentii）：未添加CMC培養(yǎng)72 h的C. laurentii菌懸液；處理組2（0.5% CMC-C. laurentii）：0.5% CMC培養(yǎng)72 h的C. laurentii菌懸液。每組處理5 個(gè)果實(shí)，重復(fù)3 次，共45 個(gè)果實(shí)。在處理后每隔一天對(duì)果皮、果肉分別取樣，置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)，果皮用于抗病防御酶活力和抗性物質(zhì)含量測(cè)定（第2、4、6、8天取樣），果肉用于果實(shí)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定（第0、8天取樣）。

防御酶活力測(cè)定：β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）、幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）、苯丙氨酸酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）和多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）采用相應(yīng)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，以每分鐘每克組織在每1 mL反應(yīng)體系中于相應(yīng)波長(zhǎng)下吸光度變化1為一個(gè)酶活力單位。

抗性物質(zhì)含量測(cè)定：總酚含量和類(lèi)黃酮含量參考曹建康等[18]的方法進(jìn)行測(cè)定，單位為OD280nm/g、OD325nm/g。

1.3.5 砂糖橘果實(shí)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

如1.3.4節(jié)所述，不同組（CK、C. laurentii、0.5%CMC-C. laurentii）處理果實(shí)于浸泡處理后第0、8天取果肉進(jìn)行果實(shí)營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量測(cè)定分析，參考曹建康等[18]的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定如下指標(biāo)：可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)（soluble solid content，SSC）使用Brix手持袖珍數(shù)顯折射儀進(jìn)行測(cè)定；可滴定酸（titrate acid，TA）質(zhì)量分?jǐn)?shù)使用NaOH滴定法進(jìn)行測(cè)定；抗壞血酸（ascorbic acid，ASA）質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用2,6-二氯酚靛酚滴定法進(jìn)行測(cè)定；還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)使用3,5-二硝基水楊酸法進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

以上實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定重復(fù)3 次。采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并使用Origin 2019軟件進(jìn)行圖表繪制，采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和鄧肯氏多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)C. laurentii抑制砂糖橘青霉、綠霉病效果的影響

由圖1可知，經(jīng)CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)不同時(shí)間的C. laurentii處理后，采后砂糖橘青霉、綠霉病的發(fā)病率和病斑直徑隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)均明顯降低。誘導(dǎo)培養(yǎng)72 hC. laurentii的生防效力最佳，處理后果實(shí)P. digitatum和P. expansum的發(fā)病率均為55.56%（圖1A），對(duì)應(yīng)果實(shí)病斑直徑僅為2.51 cm和2.07 cm，顯著低于其他誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間處理組（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 不同誘導(dǎo)時(shí)間0.5% CMC-C. laurentii處理對(duì)砂糖橘果實(shí)青霉、綠霉病發(fā)病率（A）和病斑直徑（B）的影響Fig. 1 Effect of different induction times of C. laurentii with 0.5%CMC on the incidence (A) and lesion diameter (B) of P. digitatum and P. expansum in ‘Shatangju’ mandarin fruit

2.2 CMC-C. laurentii處理對(duì)砂糖橘果實(shí)抗青霉、綠霉病效果的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，果實(shí)接種兩種病原菌后均于第2天開(kāi)始發(fā)病，但0.5% CMC-C. laurentii處理果實(shí)第2天未發(fā)?。ū?）。處理第4天，CK組處理果實(shí)P. digitatum、P. expansum發(fā)病率均為100%，0.5% CMC-C. laurentii處理的兩種病原菌果實(shí)發(fā)病率均為55.56%，顯著低于其他處理組（P＜0.05）。0.5% CMC-C. laurentii處理對(duì)果實(shí)病斑直徑的抑制效果也很明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，貯藏時(shí)間為第5天時(shí)，0.5% CMC誘導(dǎo)C. laurentii對(duì)于砂糖橘果實(shí)的青霉、綠霉病病斑直徑的抑制效果顯著優(yōu)于未誘導(dǎo)的C. laurentii處理組，較C. laurentii處理組P. digitatum、P. expansum病斑直徑減小了52.23%和33.91%。

表1 CMC-C. laurentii處理對(duì)砂糖橘果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑的影響Table 1 Effect of CMC-induced C. laurentii culture on the incidence and lesion diameter of ‘Shatangju’ mandarin fruit

2.3 CMC-C. laurentii處理誘導(dǎo)對(duì)砂糖橘果實(shí)抗病酶活力和抗性物質(zhì)含量的影響

2.3.1 果實(shí)抗病酶活力的變化

由圖2A可知，砂糖橘果皮PPO活力在貯藏期間總體呈波動(dòng)上升趨勢(shì)。酵母處理砂糖橘果皮PPO活力呈穩(wěn)定緩慢上升情況。貯藏前期C. laurentii處理果皮PPO活力高于0.5% CMC-C. laurentii處理，于貯藏第6天差異顯著（P＜0.05）。隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，0.5% CMC-C. laurentii處理誘導(dǎo)促進(jìn)果皮PPO活力增加，貯藏第8天，0.5% CMC-C. laurentii處理組PPO活力分別是CK組C. laurentii處理組的1.53 倍和1.12 倍（P＜0.05）。

如圖2B所示，在貯藏期間，采后砂糖橘果皮PAL活力整體維持相對(duì)平穩(wěn)趨勢(shì)。C. laurentii處理果皮PAL活力在貯藏前期（2～4 d）顯著高于其他處理組（P＜0.05）。相反，0.5% CMC-C. laurentii處理砂糖橘果皮PAL活力在貯藏早期相對(duì)較低，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，0.5% CMC-C. laurentii處理對(duì)果皮PAL誘導(dǎo)作用增加，貯藏后期該處理組果皮PAL活力顯著上升，貯藏第8天顯著高于其他處理組（P＜0.05）。

由圖2C可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，砂糖橘果皮CHI活力總體呈先上升后下降的趨勢(shì)。貯藏期間（第2、4、6天）酵母誘導(dǎo)處理（C. laurentii處理）比CK組果皮CHI活力顯著提高（P＜0.05），其促進(jìn)作用在貯藏前期比后期更明顯。0.5% CMC-C. laurentii處理在貯藏前期的誘導(dǎo)促進(jìn)作用不明顯，但隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，貯藏第8天該處理組果皮的CHI活力顯著提升（P＜0.05），分別是CK組和C. laurentii處理組的1.68 倍和1.72 倍。

如圖2D所示，在貯藏期間，酵母誘導(dǎo)處理果皮的GLU活力呈持續(xù)上升趨勢(shì)。C. laurentii處理果皮貯藏第6、8天時(shí)GLU活力顯著高于CK組（P＜0.05）。0.5%CMC-C. laurentii浸泡處理果皮的GLU活力貯藏期間始終顯著高于CK組果實(shí)，貯藏第8天時(shí)，該處理組果皮GLU活力是CK組的5.18 倍。從圖中可看出，酵母處理均促進(jìn)果皮GLU活力上升，相對(duì)未經(jīng)CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)的酵母處理果皮，其酶活力緩慢上升，0.5% CMC-C. laurentii處理果皮的GLU活力在貯藏第8天時(shí)急劇增加，是C. laurentiii處理的1.35 倍（P＜0.05）。

圖2 CMC-C. laurentii處理對(duì)砂糖橘果皮PPO（A）、PAL（B）、CHI（C）和GLU（D）活力的影響Fig. 2 Effect of CMC-induced C. laurentii culture on the activities of PPO (A), PAL (B), CHI (C) and GLU (D) in the peel of ‘Shatangju’mandarin fruit

2.3.2 果實(shí)抗性物質(zhì)含量變化

如圖3所示，在貯藏過(guò)程中，添加/未添加CMC培養(yǎng)C. laurentii誘導(dǎo)處理果皮總酚含量變化與類(lèi)黃酮含量變化趨勢(shì)相似。如圖3A所示，C. laurentii誘導(dǎo)處理果皮的總酚含量在第6、8天時(shí)與CK組處理無(wú)顯著差異（P＞0.05）。0.5% CMC培養(yǎng)C. laurentii誘導(dǎo)處理果皮類(lèi)黃酮含量呈上升趨勢(shì)（圖3B），在貯藏第4、6、8天時(shí)顯著高于其他處理組（P＜0.05）。

圖3 CMC-C. laurentii不同處理對(duì)砂糖橘果皮總酚含量（A）和類(lèi)黃酮含量（B）的影響Fig. 3 Effect of CMC-induced C. laurentii culture on the contents of total phenols (A) and flavonoids (B) in the peel of ‘Shatangju’ mandarin fruit

2.4 CMC-C. laurentii處理對(duì)砂糖橘果實(shí)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

CMC-C. laurentii處理對(duì)砂糖橘果實(shí)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響如表2所示，在貯藏第8天，0.5% CMC-C. laurentii處理一定程度抑制果實(shí)體內(nèi)ASA質(zhì)量分?jǐn)?shù)和TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降，其中對(duì)TA的作用效果較其他組顯著（P＜0.05）。此外，C. laurentii不同處理能顯著抑制果實(shí)組織中SSC的升高（P＜0.05），另外，0.5%CMC-C. laurentii處理能維持果實(shí)在貯藏期間的還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但與CK組差異不顯著（P＞0.05）。因此，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，經(jīng)0.5% CMC-C.laurentii處理的砂糖橘果實(shí)在貯藏期間能夠保持較好品質(zhì)，無(wú)負(fù)面影響。

表2 CMC-C. laurentii不同處理對(duì)砂糖橘果實(shí)品質(zhì)的影響Table 2 Effect of CMC-induced C. laurentii culture on fruit quality of‘Shatangju’ mandarin after storage

3 討 論

采后青霉、綠霉病是柑橘類(lèi)果實(shí)貯藏運(yùn)輸中最容易發(fā)生的病害[19]。果實(shí)抗病效果最直觀的外在表現(xiàn)形式為果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑的變化[20]。目前，有研究證實(shí)，添加外源多糖誘導(dǎo)培養(yǎng)可以顯著提高拮抗酵母的生防效力，如葡聚糖、海藻糖、殼聚糖、幾丁質(zhì)等[11]。另外，添加幾丁質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)Rhodosporidium paludigenum可提高酵母在梨、蘋(píng)果、櫻桃、西紅柿和柑橘果實(shí)采后對(duì)病害的生防效力，促進(jìn)R. paludigenum酵母抗氧化能力，促進(jìn)CHI等胞外水解酶分泌[21]。顧寧[22]研究發(fā)現(xiàn)，添加0.5%殼聚糖誘導(dǎo)培養(yǎng)酵母處理對(duì)采后草莓灰霉病的發(fā)生具有明顯抑制作用，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)分析，推測(cè)殼聚糖誘導(dǎo)培養(yǎng)促進(jìn)酵母生長(zhǎng)繁殖、菌株活力及其在果實(shí)表面定植能力，從而提高酵母生防效果。本課題組利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)和生物信息學(xué)對(duì)0.5% CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h的C. laurentii的差異基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明，0.5% CMC誘導(dǎo)后酵母生長(zhǎng)繁殖、能量供應(yīng)等相關(guān)基因的表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)酵母快速繁殖[17]。另外，Zhao Lina等[11]研究發(fā)現(xiàn)，使用0.5%海藻糖誘導(dǎo)培養(yǎng)Pichia carribbica處理采后草莓，防御酶（PPO、POD和GLU）活力得以升高，且對(duì)草莓灰霉病的發(fā)生有顯著的抑制作用，從而表現(xiàn)出一定的生防效力。在本實(shí)驗(yàn)中，0.5% CMC-C. laurentii處理的砂糖橘果實(shí)接種P. expansum、P. digitatum病原菌后，果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑顯著小于CK組和C. laurentii組（P＜0.05）。結(jié)果表明，添加CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)C. laurentii，增加酵母的繁殖速率，便于其在傷口表面快速增殖，從而增強(qiáng)酵母的生防效力。

植物苯丙烷代謝是植物抗病防御體系形成的關(guān)鍵途徑之一。PAL作為植物苯丙烷代謝途徑中許多次生代謝物質(zhì)，如黃酮類(lèi)物質(zhì)、酚類(lèi)物質(zhì)、木質(zhì)素和水楊酸等合成途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，其活力的強(qiáng)弱直接與植物的抗病性能相關(guān)[23]。因此，在植物受到病原菌侵染后，其體內(nèi)的PAL活力會(huì)升高，以此加強(qiáng)植物抵御對(duì)外界不良環(huán)境的影響。研究表明，PPO活力的提高能夠調(diào)控木質(zhì)素的合成，木質(zhì)素含量的上升能夠增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗病能力，另外，PPO活力的提高還能夠促進(jìn)酚類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為對(duì)病原菌更具毒性的醌類(lèi)物質(zhì)[24]，進(jìn)而減弱病原菌對(duì)植物的毒害作用，提高其抗病能力。蔡亞文等[25]研究發(fā)現(xiàn)，Pichia galeiformis處理能夠一定程度控制李果實(shí)采后褐腐病，提高李果實(shí)抗病性，顯示出該菌株具有較強(qiáng)的生物防治潛力，其生防效力與誘導(dǎo)果實(shí)提高PAL、POD、C4H、4CL抗性酶活力、木質(zhì)素、總酚、類(lèi)黃酮等抗性物質(zhì)含量呈正相關(guān)。Sun Cuicui等[26]將Meyerozyma guilliermondiiY-1和褪黑素復(fù)合接種于蘋(píng)果果實(shí)后，發(fā)現(xiàn)宿主的苯丙烷代謝相關(guān)酶（PAL、PPO）被啟動(dòng)，促進(jìn)抗性物質(zhì)（木質(zhì)素、總酚）積累，誘發(fā)宿主的防御系統(tǒng)，增強(qiáng)蘋(píng)果對(duì)灰霉病的抗性。本研究中，0.5% CMC-C. laurentii處理砂糖橘果實(shí)維持較高PAL、PPO活力及較高的總酚、類(lèi)黃酮等抗性物質(zhì)含量，從而增強(qiáng)砂糖橘對(duì)青霉、綠霉菌的抗病性。

GLU和CHI是植物體內(nèi)兩種最重要的病程相關(guān)蛋白[27]，可分別降解病原真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖破壞病原菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而抑制病原菌的侵染、生長(zhǎng)和繁殖[28-29]。酵母菌也能夠分泌胞外水解酶（GLU、CHI），完成對(duì)病原菌細(xì)胞壁的水解作用，進(jìn)而提高拮抗酵母對(duì)病原菌的生防效力[21]。Lu Huangping等[30]研究發(fā)現(xiàn)，使用幾丁質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)R. paludigenum，能夠有效抑制采后蘋(píng)果青霉病害的發(fā)生，這與提高蘋(píng)果中GLU、CHI活力相關(guān)。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，采用C. laurentii、CMC殼聚糖復(fù)合處理有效降低葡萄柚果實(shí)綠霉病害發(fā)生，這與拮抗酵母、外源多糖協(xié)同誘導(dǎo)提高果實(shí)GLU、CHI活力有關(guān)[31]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，0.5% CMC-C. laurentii處理的果實(shí)GLU、CHI活力增強(qiáng)，有效抑制青霉、綠霉菌繁殖侵染。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加/未添加CMC培養(yǎng)C. laurentii處理，其影響采后果實(shí)防御酶活力、抗性物質(zhì)含量的效果有所差異。未添加CMC培養(yǎng)C. laurentii在貯藏初期對(duì)果皮PPO、PAL、CHI活力及總酚、類(lèi)黃酮含量的誘導(dǎo)作用明顯，之后整體呈下降趨勢(shì)，而添加CMC培養(yǎng)C. laurentii對(duì)果皮總酚、類(lèi)黃酮含量的誘導(dǎo)效果變化趨勢(shì)則相反，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，果皮PPO、PAL、CHI活力及總酚、類(lèi)黃酮含量逐漸增加，貯藏第8天顯著高于C. laurentii組（P＜0.05）。上述現(xiàn)象的出現(xiàn)，推測(cè)可能是添加CMC培養(yǎng)對(duì)C. laurentii造成一定程度的誘導(dǎo)脅迫，使菌體處于緩沖適應(yīng)期，期間菌體各種抗性能力較低，待適應(yīng)脅迫條件后，菌體抗逆性增強(qiáng)，其生防效力也有所提升。本實(shí)驗(yàn)中，C. laurentii在CMC誘導(dǎo)適應(yīng)期間，仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的生防效力，推測(cè)是CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)提高C. laurentii繁殖速率，搶占營(yíng)養(yǎng)和生存空間，抑制病原菌生長(zhǎng)，從而有效控制病害發(fā)生，這與本課題組前期轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果[17]一致，即0.5% CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)使C. laurentii細(xì)胞能量代謝和生長(zhǎng)、繁殖相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)。

果實(shí)在采后仍進(jìn)行著一系列復(fù)雜的代謝過(guò)程，果實(shí)中SSC以及TA、ASA、還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以用來(lái)有效衡量果實(shí)采后營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[32]。大量研究表明，采用拮抗酵母有效控制采后果實(shí)貯藏病害發(fā)生的同時(shí)不會(huì)對(duì)果實(shí)的貯藏品質(zhì)造成影響（如羅倫隱球酵母防治葡萄柚綠霉病[33]、季也蒙畢赤酵母防治枇杷炭疽病[34]、葡萄汁有孢漢遜酵母防治草莓灰霉病等[35]）。本研究表明，0.5% CMC-C. laurentii處理在貯藏期間能夠有效維持砂糖橘果實(shí)中TA、ASA和還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，抑制了SSC減小。推測(cè)可能是0.5% CMC誘導(dǎo)C. laurentii處理使砂糖橘果皮表面形成多糖-酵母復(fù)合膜，抑制水分損失，減緩果實(shí)呼吸作用，從而降低果實(shí)內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，維持采后果實(shí)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.5% CMC-C. laurentii處理能夠增強(qiáng)采后砂糖橘抗青霉、綠霉病效果，果實(shí)抗病防御酶PAL、PPO、GLU、CHI活力及抗性物質(zhì)總酚、類(lèi)黃酮含量得以提高，能強(qiáng)化果實(shí)自身抗病防御系統(tǒng)，抵御病原菌的入侵，進(jìn)而增強(qiáng)果實(shí)采后抗病性。同時(shí)本研究表明，0.5% CMC-C. laurentii處理對(duì)砂糖橘果實(shí)貯藏品質(zhì)無(wú)不利影響。綜上所述，添加CMC培養(yǎng)誘導(dǎo)能夠提高C. laurentii生防效力，增強(qiáng)C. laurentii處理砂糖橘果實(shí)抗青霉、綠霉病的能力，本研究對(duì)提高C. laurentii在果品采后生物防治的商業(yè)化應(yīng)用方面具有一定的理論指導(dǎo)意義。