黃少杰，陳宏著，鐘淳菲，朱思陽，黎 攀，杜 冰,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.花安堂生物科技集團(tuán)有限公司，廣東 廣州 511434）

衰老是人體正常、不可逆的生理現(xiàn)象，伴隨機(jī)體衰老，各種功能普遍衰退，抵抗外界環(huán)境傷害和恢復(fù)體內(nèi)平衡能力減弱，從而導(dǎo)致疾病和死亡率的增高[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，隨著年齡的增長，人體的代謝速度會(huì)變緩慢，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[2]。而當(dāng)機(jī)體內(nèi)的ROS過量時(shí)，則會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，從而對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物分子功能造成重大損傷，繼而直接或間接導(dǎo)致多種疾病的產(chǎn)生[3]。因此，天然抗氧化產(chǎn)物的研發(fā)是目前抗氧化衰老研究的熱點(diǎn)之一，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道植物多糖具有一定的抗氧化性[4]，邱現(xiàn)創(chuàng)[5]的研究表明鐵皮石斛多糖具有抗氧化活性，是一種天然的優(yōu)質(zhì)抗氧化劑；劉冰冰[6]以鐵皮石斛為原材料提取得到鐵皮石斛多糖，并以秀麗隱桿線蟲（以下簡稱線蟲）為模式生物，探討了鐵皮石斛多糖延長線蟲壽命可能的作用機(jī)制，結(jié)果表明一定劑量的鐵皮石斛多糖可以延長線蟲壽命，其作用機(jī)制可能是通過胰島素信號(hào)通路調(diào)控下游DAF-16基因完成對(duì)線蟲的耐受能力的提高實(shí)現(xiàn)的。

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科石斛屬草本植物，主產(chǎn)于安徽、浙江、福建、廣西、四川、云南等地，鐵皮石斛作為石斛中的珍貴品種，其功能性成分主要包括多糖類、黃酮類以及酚酸類等，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血糖等藥理活性[7]，是我國著名的藥食兩用中藥材。《中國藥典》規(guī)定其藥用部位為莖，葉為非藥用部位[8]，在鐵皮石斛鮮條生產(chǎn)時(shí)，非藥用部位——鐵皮石斛葉往往作為副產(chǎn)品被直接丟棄，造成一定的資源浪費(fèi)。鐵皮石斛葉中含有豐富的鐵皮石斛多糖，雖然其含量低于莖部，但在某些生物活性上具有一定優(yōu)勢[9]，有研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛葉中多糖對(duì)羥自由基的清除率比莖部的更高[10]，此外，鐵皮石斛葉生物量占鐵皮石斛總生物量比例較大，達(dá)到50%[11]。因此，對(duì)鐵皮石斛葉進(jìn)行研究開發(fā)，不僅能更充分地利用中藥珍惜資源，踐行綠色可持續(xù)發(fā)展理念，而且能進(jìn)一步擴(kuò)大鐵皮石斛的使用部位及提高其附加值。然而，目前關(guān)于鐵皮石斛葉多糖在抗衰老方面的研究甚少，且具體作用機(jī)制還不清楚。

線蟲作為一種模式生物，其結(jié)構(gòu)簡單、生命周期短、基因組與人類基因保守性較高，因此在抗氧化和延緩衰老研究領(lǐng)域具有明顯優(yōu)勢[12-13]，廣泛應(yīng)用于抗衰老、藥物篩選和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等各方面的研究[14]。而目前以線蟲為模型研究鐵皮石斛葉多糖抗衰老效果的報(bào)道較少，因此本實(shí)驗(yàn)選用鐵皮石斛葉多糖飼喂N2野生型線蟲，通過對(duì)其壽命、生殖能力、運(yùn)動(dòng)能力、應(yīng)激實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)ROS及抗氧化酶活力等方面進(jìn)行研究，探究鐵皮石斛葉多糖在其體內(nèi)的抗衰老作用及機(jī)理，以期為鐵皮石斛葉進(jìn)一步研究與開發(fā)利用提供參考，并為開發(fā)抗衰老、抗氧化的功能性食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

N2野生型線蟲（Caenorhabditis elegans）購于美國秀麗隱桿線蟲遺傳中心。

鐵皮石斛葉 紅河群鑫石斛種植有限公司；大腸埃希氏菌OP50（以下簡稱OP50） 上海南方模式生物科技股份有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均購于廣州齊湘生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2204萬分之一天平 上海舍巖儀器有限公司；SN-HWS250B恒溫生化培養(yǎng)箱 甘易儀器設(shè)備（上海）有限公司；LD-SY96S多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；MF53-N熒光顯微鏡 上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；LC-LX-HR185C冷凍離心機(jī) 日本久保田儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鐵皮石斛葉多糖的制備及含量測定

鐵皮石斛葉切段粉碎后，參考文獻(xiàn)[15]的方法，采用水溶醇提法提取鐵皮石斛葉多糖，經(jīng)Sevag法除去蛋白后，將溶液倒入透析袋透析，透析結(jié)束后采用DEAE陰離子交換柱進(jìn)行分級(jí)層析，用去離子水洗脫。收集洗脫液采用Sephadex G-100進(jìn)行葡聚糖凝膠柱層析，用去離子水洗脫，層析結(jié)束后進(jìn)行透析、真空濃縮、冷凍干燥，得到純化的鐵皮石斛葉多糖樣品。采用苯酚硫酸法[16]測定純化后的樣品多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（90.13±4.73）%。

1.3.2 線蟲培養(yǎng)和同期化處理

采用涂布有100 μL OP50菌液（濃度為1×109CFU/mL，下同）的線蟲生長培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM）于20 ℃下培養(yǎng)線蟲。

采用高氯酸鈉漂白法對(duì)線蟲進(jìn)行同期化處理：用1 mL M9緩沖溶液將產(chǎn)卵期的線蟲成蟲洗至無菌EP管中，加1 mL裂解液（含有0.5 mol/L NaOH、0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）NaClO的M9緩沖液）裂解線蟲，反復(fù)振蕩5 min，然后3 000 r/min離心1 min，棄去上清液，再用M9緩沖液沖洗線蟲2 次，3 000 r/min離心1 min，棄去上清液后用移液槍吸取線蟲，滴于NGM的無菌區(qū)，在20 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)約48 h后，裂解的線蟲體內(nèi)受精卵基本發(fā)育成L4期幼蟲，完成同期化操作。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為5 組：將線蟲分別轉(zhuǎn)移至涂布100 μL含低（0.5 mg/mL）、中（1.0 mg/mL）、高（2.0 mg/mL）質(zhì)量濃度鐵皮石斛葉多糖OP50菌液的NGM，每天飼喂等體積相應(yīng)OP50菌液，記為低（LD）、中（MD）、高（HD）質(zhì)量濃度鐵皮石斛葉多糖組；空白對(duì)照組（CD）初期涂布或每天飼喂等體積OP50菌液；蝦青素（astaxanthin，AST）陽性對(duì)照組（YD）初期涂布或每天飼喂等體積含64 μmol/L AST的OP50菌液（準(zhǔn)確稱取0.001 91 g蝦青素，用1 mL二甲基亞砜溶解后制成3.2 mmol/L AST母液，取0.1 mL AST母液與4.9 mL OP50菌液混勻）。

1.3.4 線蟲壽命及運(yùn)動(dòng)能力測定

線蟲壽命測定參考王晉等[17]的方法并稍作修改，分別挑取30 條1.3.3節(jié)L4期線蟲幼蟲轉(zhuǎn)移至5 組涂布有100 μL不同OP50菌液的新鮮NGM，在20 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，此后每隔24 h轉(zhuǎn)移1 次，每天觀察線蟲的存活情況，計(jì)算各組線蟲存活率（觀察時(shí)存活線蟲數(shù)量占初始線蟲總數(shù)的比例，下同）、壽命中位數(shù)、平均壽命、最長壽命。

參考文獻(xiàn)[18]并略作修改測定線蟲運(yùn)動(dòng)能力。每組選取線蟲數(shù)量大于30 條，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，在培養(yǎng)第1、5、10、15天觀察線蟲的運(yùn)動(dòng)能力，記錄3 個(gè)等級(jí)（A、B、C）運(yùn)動(dòng)能力的線蟲數(shù)量并計(jì)算不同等級(jí)運(yùn)動(dòng)能力線蟲的比例。運(yùn)動(dòng)能力判斷標(biāo)準(zhǔn)：線蟲自主活動(dòng)自如定義為A等級(jí)，僅在挑針觸碰頭部或尾部后開始爬行定義為C等級(jí)，介于兩者之間定義為B等級(jí)。

1.3.5 線蟲生殖實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)挑取L4期線蟲置于各組培養(yǎng)皿上，每組5 個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿上放置1 條線蟲，在產(chǎn)卵高峰期（L4期的前3 d）需每日轉(zhuǎn)板，培養(yǎng)蟲卵發(fā)育至成蟲后記錄各組每個(gè)培養(yǎng)皿上的線蟲數(shù)量即為線蟲的產(chǎn)卵量。后期每隔24 h將線蟲轉(zhuǎn)移至新的平板中，轉(zhuǎn)移4～5 次，至線蟲不再產(chǎn)卵時(shí)結(jié)束，計(jì)算線蟲總產(chǎn)卵量。

1.3.6 線蟲應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

1.3.6.1 熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)操作參考文獻(xiàn)[19]并略作修改，將同期化后的線蟲培養(yǎng)至L4期后，各組分別20 ℃干預(yù)5 d，隨即挑取線蟲轉(zhuǎn)移到空白的新鮮NGM培養(yǎng)基中，并放置在35 ℃下培養(yǎng)，每2 h統(tǒng)計(jì)1 次存活情況，直至所有線蟲全部死亡，計(jì)算線蟲存活率并繪制線蟲生存曲線。

1.3.6.2 急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

在急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中，同期化后的線蟲生長到L4期后，各組分別干預(yù)2 d，之后將線蟲暴露于含30 mmol/L雙氧水的NGM培養(yǎng)基中，每板20 條，每30 min統(tǒng)計(jì)1 次存活情況，計(jì)算存活率直到線蟲全部死亡為止，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.7 線蟲體內(nèi)ROS相對(duì)水平測定

隨機(jī)挑取L4期線蟲在各組條件下分別干預(yù)4 d后，用M9緩沖溶液沖洗培養(yǎng)基3 次，轉(zhuǎn)移到離心管中，3 000 r/min離心取上清液；吸取50 μL上清液和50 μL顯色劑于96 孔板中避光混勻后，以顯色劑為對(duì)照。將96 孔板放置于酶標(biāo)儀中，在反應(yīng)溫度為25 ℃，激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長530 nm的熒光顯微鏡下每20 min進(jìn)行一次熒光強(qiáng)度測定，連續(xù)測定120 min。ROS相對(duì)水平按下式計(jì)算。

1.3.8 線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力和丙二醛含量的測定

參考文獻(xiàn)[20]的方法并略作改動(dòng)，同期化后的線蟲生長到L4期后，將各組線蟲轉(zhuǎn)移到NGM上分別干預(yù)4 d后，用M9緩沖溶液沖洗培養(yǎng)皿并收集各平板上的成蟲。冷凍研磨后離心，取上清液，使用相關(guān)試劑盒測定SOD、CAT活力和MDA含量，并以上清液蛋白濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3 次，采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 9.1軟件和GraphPad軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲壽命的影響

自然壽命是進(jìn)行抗衰老研究分析的首選指標(biāo)[21]。本實(shí)驗(yàn)以蝦青素為陽性對(duì)照，測定了不同質(zhì)量濃度條件下鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲壽命的影響，線蟲壽命中位數(shù)、平均壽命、最長壽命如圖1、表1所示。多糖處理組線蟲的平均壽命、最長壽命以及壽命中位數(shù)均高于CD組。MD與HD組線蟲的平均壽命均極顯著高于CD組（P＜0.01），LD組線蟲的平均壽命顯著高于CD組（P＜0.05），各實(shí)驗(yàn)組線蟲的最長壽命均有一定程度的延長，其中MD組線蟲最長壽命與CD組差異極顯著（P＜0.01），且高于YD組，表明其效果優(yōu)于蝦青素。以上結(jié)果說明鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲存活率有一定影響，能夠有效延長線蟲的壽命。

圖1 鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲壽命的影響Fig. 1 Effects of polysaccharide from D. officinale leaves on lifespan of C. elegans

表1 鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲平均壽命和最長壽命的影響Table 1 Effects of polysaccharide from D. officinale leaves on average and maximum lifespan of C. elegans

2.2 鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲行動(dòng)能力的影響

運(yùn)動(dòng)行為是反映線蟲神經(jīng)系統(tǒng)基本功能的指標(biāo)，線蟲運(yùn)動(dòng)能力與線蟲壽命有直接關(guān)系，能夠作為評(píng)價(jià)機(jī)體的衰老速度的重要指標(biāo)[22]。

如圖2所示，隨著機(jī)體的衰老，線蟲的運(yùn)動(dòng)能力逐漸下降。在培養(yǎng)前10 d，鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)影響并不顯著（P＞0.05）；在培養(yǎng)15 d后，與CD組相比，不同質(zhì)量濃度的鐵皮石斛葉多糖均能提高線蟲的蠕動(dòng)能力，在培養(yǎng)到20 d時(shí)，CD組中線蟲運(yùn)動(dòng)狀態(tài)均為C等級(jí)，鐵皮石斛葉多糖干預(yù)組部分線蟲運(yùn)動(dòng)狀態(tài)為B等級(jí)，表明鐵皮石斛葉多糖可以顯著提高線蟲的運(yùn)動(dòng)能力（P＜0.05），且MD、HD組線蟲的運(yùn)動(dòng)能力略優(yōu)于YD組，進(jìn)一步說明鐵皮石斛葉多糖還可以提高線蟲運(yùn)動(dòng)行為能力。

圖2 不同質(zhì)量濃度鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響Fig. 2 Effects of polysaccharide from D. officinale leaves on motility of C. elegans

2.3 鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲產(chǎn)卵量的影響

有報(bào)道指出許多生物壽命的延長與生殖能力呈負(fù)相關(guān)[23]，但也有報(bào)道指出白藜蘆醇可以延長線蟲壽命的同時(shí)不影響生殖能力[24]。如圖3所示，本研究中各組總產(chǎn)卵量沒有顯著差異（P＞0.05），表明鐵皮石斛葉多糖可以延長線蟲壽命的同時(shí)不影響其生殖能力。

圖3 鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲總產(chǎn)卵量的影響Fig. 3 Effects of polysaccharide from D. officinale leaves on oviposition quantity of C. elegans

2.4 鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲應(yīng)激效應(yīng)的影響

機(jī)體在壓力環(huán)境下的抵抗能力被稱作壓力應(yīng)激能力，壽命的延長與壓力應(yīng)激能力的提高具很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性[25-26]，高溫會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)部代謝紊亂、酶失活等，使機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，引起氧化應(yīng)激[27]，因此通過熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)考察線蟲對(duì)急性氧化損傷的抵抗能力。本研究探討了35 ℃條件下不同質(zhì)量濃度鐵皮石斛葉多糖干預(yù)線蟲抵抗熱應(yīng)激的能力。由圖4A可知，與CD組相比，低、中、高劑量的鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲的抗熱應(yīng)激能力均無明顯的增強(qiáng)作用。

本實(shí)驗(yàn)選擇過氧化氫作為強(qiáng)氧化劑，構(gòu)建氧化損傷環(huán)境，將鐵皮石斛葉多糖處理后的線蟲轉(zhuǎn)移至氧化應(yīng)激環(huán)境中，通過測定線蟲存活率來檢測鐵皮石斛葉多糖是否有助于機(jī)體抵御氧化損傷。由圖4B可知，在培養(yǎng)前中期時(shí)，HD組中的線蟲存活率明顯高于CD組，說明當(dāng)鐵皮石斛葉多糖的質(zhì)量濃度達(dá)到一定水平時(shí)，鐵皮石斛葉多糖能增強(qiáng)線蟲的抵抗氧化應(yīng)激的能力；同時(shí)，與CD組相比，實(shí)驗(yàn)組線蟲生存曲線右移，表明實(shí)驗(yàn)組中線蟲抵御氧化應(yīng)激的能力普遍提高。

圖4 鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲應(yīng)激能力的影響Fig. 4 Effects of polysaccharide from D. officinale leaves on stress resistance in C. elegans

2.5 鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲活性氧相對(duì)水平的影響

自由基是衰老的重要引發(fā)因素之一，隨著機(jī)體的衰老，其自由基調(diào)節(jié)能力下降，導(dǎo)致機(jī)體中的ROS的過量堆積，過量的ROS會(huì)引起機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或凋亡，從而引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、心腦血管病癥等多種疾病[28-29]。由圖5可知，線蟲體內(nèi)的ROS相對(duì)水平隨反應(yīng)時(shí)間的延長而增加，處理120 min時(shí)，與CD組相比，鐵皮石斛葉多糖干預(yù)后的線蟲體內(nèi)ROS相對(duì)水平都明顯降低，LD、MD、HD組ROS相對(duì)水平分別降低了40.0、79.1、85.0 個(gè)百分點(diǎn)，具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。以上結(jié)果表明，鐵皮石斛葉多糖能有效清除線蟲體內(nèi)的ROS，且HD組對(duì)ROS清除效果最為明顯。

圖5 鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲ROS相對(duì)水平的影響Fig. 5 Effects of polysaccharide from D. officinale leaves on ROS levels in C. elegans

2.6 鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力和丙二醛含量的影響

CAT、SOD是線蟲體內(nèi)主要的抗氧化酶，提高抗氧化酶活力可以清除線蟲體內(nèi)多余的自由基，從而促進(jìn)體內(nèi)氧化平衡[30]，相似研究指出提高線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力（SOD、CAT）是延長線蟲壽命的作用機(jī)制之一[31]；MDA是生物體內(nèi)脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，被廣泛用于脂質(zhì)氧化水平評(píng)價(jià)[32]。SOD-1、SOD-3是SOD家族的組成成員，有研究發(fā)現(xiàn)SOD-1、SOD-3表達(dá)水平升高能減少線蟲體內(nèi)ROS的含量，從而延長線蟲壽命[33-34]，因此推測鐵皮石斛葉多糖抗氧化衰老的作用機(jī)制與其提高機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活力、降低ROS相對(duì)水平有關(guān)。

由圖6A、B可知，在本實(shí)驗(yàn)考察質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與CD組相比，鐵皮石斛葉多糖均可以提高線蟲體內(nèi)SOD和CAT活力，其中，SOD活力由（53.92±1.24）U/mg極顯著提高到HD組的（90.02±3.35）U/mg（P＜0.01），且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系；同時(shí)，與CD組相比，不同質(zhì)量濃度的鐵皮石斛葉多糖均能提高CAT活力，且HD組的提升效果顯著（P＜0.05）；由圖6C可知，鐵皮石斛葉多糖干預(yù)組具有更低的MDA含量，與CD組相比，LD、MD、HD組中的MDA含量分別降低了25.24%、26.42%、31.86%，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。以上結(jié)果表明鐵皮石斛葉多糖可在一定程度上能夠提高線蟲體內(nèi)抗氧化能力，緩解氧化損傷及線蟲衰老，具有激活線蟲體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的潛力。

圖6 鐵皮石斛葉多糖對(duì)線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力和MDA含量的影響Fig. 6 Effects of polysaccharide from D. officinale leaves on antioxidant enzyme activities and MDA levels in C. elegans

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)引入模式生物線蟲，評(píng)價(jià)了鐵皮石斛葉多糖延緩線蟲衰老的作用，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了初步的探索。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組線蟲相比，鐵皮石斛葉多糖能提高線蟲的平均壽命和最大壽命，并且不以損害生殖能力為代價(jià)，能有效清除自由基和提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力，同時(shí)降低ROS相對(duì)水平。與空白對(duì)照組線蟲相比，鐵皮石斛葉多糖能有效提高線蟲體內(nèi)SOD和CAT活力，顯著降低MDA含量（P＜0.05），且應(yīng)激條件下線蟲的生存率增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鐵皮石斛葉多糖具有抗氧化活性，可為以后鐵皮石斛葉多糖的進(jìn)一步研究提供參考，但其產(chǎn)生抗氧化作用的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。