肖亞茹，張鐘元,*，聶梅梅，李大婧，徐亞元，戴竹青，馮 蕾，張國棟

（1.江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212001；3.江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，江蘇 南京 210014；4.江蘇艾蘭得營養(yǎng)品有限公司，江蘇 靖江 214500）

類胡蘿卜素是廣泛存在于自然界中的色素，具有抗氧化、抗癌、預防心血管類疾病、預防眼部疾病等重要的生理功能[1]。其中，葉黃素和玉米黃質是存在于人眼視網膜黃斑的類胡蘿卜素，可抵抗眼部氧化、光損傷，對眼睛起重要的保護作用[2-3]。但類胡蘿卜素不易吸收，食用富含類胡蘿卜素的食物和膳食補充劑并不意味著人體就能夠吸收并利用大量的類胡蘿卜素，已有報道表明食品基質中類胡蘿卜素最終可被人體利用的比例低于5%。這是由于類胡蘿卜素的吸收過程復雜。首先，類胡蘿卜素從食物基質中釋放出來，然后在消化過程中并入腸道的混合膠束中，通過被動擴散過程被腸道上皮細胞吸收，經淋巴循環(huán)運輸至組織器官[4]。在整個吸收過程中，類胡蘿卜素種類和結構、促進和拮抗因子等諸多因素顯著影響類胡蘿卜素生物利用度[5-6]。

在日常飲食中類胡蘿卜素通常與蛋白質、脂肪等常量營養(yǎng)素及膳食纖維、礦物質、多酚等微量營養(yǎng)素一同被消化吸收，這些營養(yǎng)素與類胡蘿卜素相互作用，能夠影響后者在人體的吸收[6]?，F有研究發(fā)現多酚可以調控類胡蘿卜素腸道吸收、代謝過程。體外研究發(fā)現柑橘黃烷酮、花青素能有效地促進人結直腸腺癌細胞Caco-2細胞吸收β-胡蘿卜素、葉黃素、β-隱黃質[7-9]。研究表明小鼠經槲皮素干預后β-胡蘿卜素在小鼠肝臟中的積累增加[10]；同時喂食橙皮苷（hesperidin， HES-G）和β-胡蘿卜素顯著增加了蒙古沙鼠血漿中視黃醇的含量[11]。但現有研究主要集中在多酚對類胡蘿卜素吸收影響的宏觀調控上，鮮有多酚調控類胡蘿卜素吸收的機制研究。本團隊前期研究發(fā)現柑橘黃烷酮通過活化細胞受體蛋白B類I型清道夫受體（scavenger receptor class B type I，SR-BI）、CD36的表達促進β-胡蘿卜素細胞吸收[12]，但多酚對葉黃素的吸收機制尚不明確。并且目前對類胡蘿卜素吸收代謝的研究都是分析單一的某一個階段，鮮有對類胡蘿卜素吸收的各個階段同時進行系統(tǒng)研究的報道。

本實驗以課題組前期所進行的柑橘黃烷酮對β-胡蘿卜素腸道吸收代謝研究為基礎，對多酚在葉黃素不同消化階段的影響進行詳細研究，通過構建體外消化、細胞和小鼠模型，研究多酚對葉黃素體外消化、細胞吸收及體內吸收3 個階段的影響，多階段探究多酚對葉黃素吸收的影響，有利于全面闡明多酚對葉黃素吸收代謝的影響機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性C57BL/6小鼠（6～8 周）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（浙）2019-0001；使用許可證號：SYXK（浙）2017-0007。

人結腸腺癌細胞株（Caco-2）購自中國科學院上海細胞庫。

葉黃素（純度≥80%）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、姜黃素、花青素、槲皮素（純度≥98%）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）、胰酶（250 U/mg） 上海源葉科技有限公司；橙皮素（hesperetin，HES）、HES-G、黃腐酚（純度≥98%） 美國Sigma公司；豬膽鹽北京奧博星生物技術有限責任公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.0、0.01 mol/L）、0.25%胰酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 美國Gibco Laboratories公司；T25細胞培養(yǎng)瓶、6 孔Transwell（聚碳酸酯膜）細胞培養(yǎng)板美國康寧公司；抗SR-BI抗體、抗β-actin抗體、抗尼曼-匹克C1型類蛋白（Niemann-Pick C1L1，NPC1L1）抗體、抗CD36抗體、二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G） 美國Cell Signaling Technology公司；膽固醇、油酸、甘油酯、亞油酸、正己烷、丙酮、無水乙醇、三氯甲烷均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TG16-WS臺式高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；體外消化儀 澳大利亞NI公司；FE20 pH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BS224S電子分析天平 北京賽多利斯科學儀器公司；DW-86L828型超低溫冰箱 青島海爾股份有限公司；RE52CS旋轉蒸發(fā)儀、D10氮氣吹掃儀 杭州奧盛儀器有限公司；組織研磨機、細胞培養(yǎng)箱、MZS90納米粒度測定儀 英國馬爾文儀器有限公司；XD-202倒置顯微鏡 南京江南永新光學有限公司；BHC-1300IIA/B2型生物潔凈安全柜蘇州凈化設備有限公司；TDL-80-2C低速臺式離心機上海安亭科學儀器廠；ERS-2上皮跨膜細胞電阻儀美國密理博公司；1260高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葉黃素膠束制備

葉黃素膠束的制備參考文獻[12]的方法并略作修改。取56.8 mg葉黃素用甲醇溶解并定容至50 mL，制得2 mmol/L葉黃素貯備液。取一定體積的葉黃素貯備液與不同食物組分溶解于三氯甲烷，用氮氣吹干有機溶劑后重懸于PBS中，渦旋10 min，超聲30 min，得含有不同食物組分（終濃度2.5 mmol/L單油酰甘油、2.5 mmol/L油酸、12 mmol/L?；悄懰徕c、0.5 mmol/L膽固醇、2.5 mmol/L亞油酸和1 mmol/L EGC、EGCG、黃腐酚、HES、HES-G、花青素、姜黃素、槲皮素）的葉黃素膠束，其中葉黃素的濃度為200 μmol/L。以未加入食物組分的葉黃素膠束為對照組。

1.3.2 葉黃素生物可及性測定

生物可及性是指在消化過程中從食物基質中釋放出來的有可能被機體攝取和吸收的活性物質比例。如類胡蘿卜素的生物可及性通常指攝入的類胡蘿卜素占膠束的比例[13]。葉黃素生物可及性測定參考文獻[14]的方法并略作修改。將裝有5 mL 1.3.1節(jié)葉黃素膠束消化管置于體外消化儀中，采用自動進樣器加入10 mL胃液（140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、10 mmol/L CaCl2·2H2O、3.5 mmol/L KH2PO4）和2 mL質量濃度3.2 mg/mL的胃蛋白酶溶液（用1 mol/L HCl溶液調節(jié)至pH 2），設置消化溫度37 ℃、轉速150 r/min、消化時間1 h，模擬胃消化階段。

胃消化階段結束后用1 mol/L NaHCO3溶液調節(jié)至pH 7，采用自動進樣器加入20 mL腸液（含5 mg/mL胰酶、31.13 mg/mL膽鹽的0.1 mol/L NaHCO3溶液），設置消化溫度37 ℃、轉速150 r/min、消化時間2 h，模擬腸消化階段。

體外消化液葉黃素提取參考文獻[15]并略作修改。取10 mL腸消化液，離心（8 000 r/min、10 min）取上清液，加入等體積正己烷-乙醇-丙酮溶液（體積比為2∶1∶1）萃取，輕微振蕩，靜置分層，反復萃取至下層無色，合并萃取液，用氮氣吹掃儀吹干有機溶劑后甲醇復溶，采用高效液相色譜測定葉黃素質量濃度。

葉黃素的生物可及性按下式計算。

式中：ρ1為消化液中葉黃素質量濃度/（μg/mL）；V1為消化液體積/mL；ρ2為初始葉黃素膠束質量濃度/（μg/mL）；V2為初始葉黃素膠束體積/mL。

1.3.3 粒徑、ζ-電位的測定

取1.3.1節(jié)制備的膠束溶液，用PBS稀釋10 倍后利用納米粒徑測定儀于室溫條件下測定平均粒徑和ζ-電位。

1.3.4 細胞吸收葉黃素水平的測定

Caco-2細胞培養(yǎng)在含10%（體積分數）FBS的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱（5%（體積分數）CO2、37 ℃，下同）培養(yǎng)至對數生長期，用含0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液將貼壁細胞消化成單個細胞懸液后以2×105個/mL接種至含有0.5 mL完全培養(yǎng)基的Transwell的聚碳酸酯膜上，下層加入1.0 mL 高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)21 d后備用[16]。采用ERS-2上皮跨膜細胞電阻儀測定各孔細胞單層膜跨膜電阻（transepithelial electrical resistance，TEER）確定其完整性，當TEER大于500 Ω·cm2時可用于細胞吸收葉黃素水平的測定[17]。Caco-2細胞吸收葉黃素前，用PBS清洗2 遍，向細胞單層膜中分別加入SR-BI蛋白抑制劑BLT-1（block lipid transport-1）、NPC1L1蛋白抑制劑依澤替米貝（ezetimibe，EZT）、CD36蛋白抑制劑磺基-N-琥珀酰亞胺酯油酸（sulfo-N-succinimidyloleat，SSO），蛋白抑制劑濃度均為30 μmol/L，預處理30 min后，在上層加入0.5 mL葉黃素膠束，在下層加入1.0 mL高糖DMEM培養(yǎng)基，以不添加蛋白抑制劑為對照組，將Transwell置于培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)5 h[18]。本實驗選擇的培養(yǎng)時間代表正常生理狀態(tài)下通過腸道吸收時間。孵育結束后吸棄上、下層培養(yǎng)液，用含有5 mmol/L牛黃膽酸鈉PBS清洗細胞單層膜兩遍，以去除附著在表面的葉黃素，用細胞刮子小心地刮取細胞，使細胞懸浮于1 mL PBS中。

葉黃素的提取[12]：取1 mL懸有細胞的PBS，加入等體積氯仿-甲醇（體積比2∶1）萃取劑輕微振蕩，靜置分層，反復萃取至下層（水相）無色，合并萃取液，用氮氣吹掃儀吹干有機溶劑后用200 μL無水甲醇復溶，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析葉黃素質量濃度水平以表征細胞吸收葉黃素水平。

1.3.5 蛋白免疫印跡

總蛋白的提取：取1.3.4節(jié)刮取的細胞樣品，加入2 mL PBS重懸，離心（12 000 r/min、10 min）得細胞樣品[19]。加入適量蛋白裂解液，置于冰上裂解細胞1 h，離心（12 000 r/min、10 min）后棄去上清液，得到總蛋白樣品。參考二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒說明書測定樣品中蛋白質量濃度。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）與轉膜：上樣量為20 μg進行SDS-PAGE；采用濕轉法將凝膠上的蛋白轉到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。將PVDF膜置于5%（質量分數）脫脂牛奶封閉液中，于37 ℃ 培養(yǎng)箱中封閉1.5 h，采用TBST清洗3 次，每次10 min。

抗體孵育：將PVDF膜置于一抗溶液（稀釋比例均為1∶1 000）中孵育，4 ℃振蕩12 h，用TBST洗滌3 次，每次10 min，然后置于二抗溶液（稀釋比例為1∶2 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌3 次，每次10 min。

顯色：加入1 mL增強型化學發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色液，避光孵育4 min，置于化學發(fā)光成像儀曝光。采用Image J軟件分析目標條帶的灰度值，以目的蛋白和內參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.3.6 動物實驗及分組

將小鼠適應性飼喂7 d后隨機分為10 組，每組10 只。各組小鼠按照100 μL/d分別灌胃1.3.1節(jié)不同葉黃素膠束，灌胃7 d后，最后1 次灌胃4 h后眼球取血并用抗凝管收集，然后立即處死小鼠并取肝臟組織[20]，將盛有小鼠血液的抗凝管于冰上靜置4 h，然后1 500 r/min離心15 min，取上清液得到血漿樣品。取80 mg肝臟組織于離心管，加入0.8 mL生理鹽水勻漿。向勻漿后的混合物中加入2 mL三氯甲烷-甲醇溶液（體積比2∶1），混勻后再加入1 mL正己烷溶液，渦旋混勻后3 000 r/min離心5 min，移取上層清液。取下層混合物重復上述提取步驟，合并兩次上層清液，用N2吹干后加入150 μL無水甲醇復溶，待HPLC分析葉黃素水平。在裝有200 μL血漿樣品的離心管中加入1 mL的正己烷溶液，渦旋混勻后3 000 r/min離心5 min，移取上層清液。取下層混合物重復上述步驟，合并兩次上層清液，N2吹干后加入150 μL無水甲醇復溶，待HPLC分析葉黃素質量濃度。

1.3.7 HPLC分析葉黃素水平

參考本實驗室已建立的方法[21]測定葉黃素水平。色譜柱為YMC-C30色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；DAD檢測器；檢測波長450 nm；流速0.6 mL/min；進樣量20 μL；柱溫25 ℃。流動相A：水-甲基叔丁基醚-甲醇（體積比5∶25∶70）；流動相B：水-甲基叔丁基醚-甲醇（體積比5∶85∶10）；梯度洗脫程序：0～4.5 min（95%～80% A）；4.5～12.5 min（80%～50% A）；12.5～18 min（50%～25% A）；18～24 min（25%～5% A）；24～30 min（5% A）。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

所有實驗重復3 次，結果以平均值±標準差表示，采用Origin軟件作圖。采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan’s多重比較檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 多酚對葉黃素生物可及性的影響

類胡蘿卜素生物可及性是指類胡蘿卜素攝入混合膠束中可被小腸吸收的類胡蘿卜素比例[22]。本實驗以亞油酸為陽性對照，首先研究了多酚對葉黃素生物可及性的影響。如圖1所示，多酚處理對葉黃素生物可及性起到顯著的提高作用，與單獨葉黃素（CK）組相比，葉黃素生物可及性提高了3.3～7.0 倍（P＜0.05），其中EGCG處理組效果最為顯著，葉黃素生物可及性高達24.3%，較單獨葉黃素組提高了7.0 倍（P＜0.05），較亞油酸組提高了2.0 倍。

圖1 多酚對葉黃素生物可及性的影響Fig. 1 Effects of polyphenols on the bioaccessibility of lutein

2.2 多酚對葉黃素膠束性能的影響

為了進一步研究上述體外消化形成的膠束性能，對形成的膠束的平均粒徑、ζ-電位進行測定。平均粒徑反映膠束顆粒尺寸，ζ-電位反映粒子表面電荷。本實驗探究了多酚對葉黃素膠束性能的影響，結果如表1所示。與單一的葉黃素膠束相比，多酚的加入可使葉黃素膠束的平均粒徑顯著降低。此外，多酚的加入可使葉黃素膠束溶液ζ-電位絕對值增加。ζ-電位絕對值越高，表明液滴中同種電荷含量較高，可防止液滴中大分子物質聚集。因此，多酚處理組葉黃素膠束溶液較其他組穩(wěn)定。

表1 多酚對葉黃素膠束性能的影響Table 1 Effects of polyphenols on properties of lutein micelles

2.3 多酚對細胞吸收葉黃素的影響

不同多酚對細胞吸收葉黃素的影響如表2所示，結果表明多酚可使細胞吸收的葉黃素水平提高3.2%～30.4%，其中EGC和EGCG等提高效果較為明顯。細胞膜蛋白NPC1L1、SR-BI、CD36是參與類胡蘿卜素細胞吸收的轉運蛋白[23]，本實驗研究了NPC1L1、SR-BI、CD36蛋白抑制劑對細胞吸收葉黃素水平的影響，結果表明，加入NPC1L1、SR-BI、CD36蛋白抑制劑降低了細胞吸收葉黃素水平。與對照組相比，加入BLT-1可使細胞吸收葉黃素水平降低3.4%～24.6%；加入EZT使細胞吸收葉黃素水平降低2.7%～28.5%；加入SSO使細胞吸收葉黃素水平降低2.8%～23.7%。這表明3 種蛋白均參與多酚促進細胞吸收葉黃素過程，3 種蛋白的抑制劑使相應蛋白表達水平降低，進而使葉黃素轉運通路受到影響。

表2 多酚對細胞吸收葉黃素水平的影響Table 2 Effects of polyphenols on the cellular absorption of lutein μg/L

2.4 多酚對葉黃素轉運蛋白表達的影響

進一步研究了多酚對細胞膜蛋白NPC1L1、SR-BI、CD36蛋白表達的影響，結果如圖2所示。SR-BI是細胞吸收葉黃素的主要轉運蛋白。與對照組相比，多酚處理組顯著提高了NPC1L1、SR-BI、CD36 3 種轉運蛋白的表達，這進一步表明3 種蛋白均參與多酚促進細胞吸收葉黃素過程，與2.3節(jié)3 種蛋白抑制劑作用下細胞吸收葉黃素的結果相互印證。其中CD36蛋白表達水平增加最多，較對照組提高4.12～7.64 倍（P＜0.05），SR-BI蛋白次之，較對照組提高10.4%～139.6%，NPC1L1蛋白最次，較對照組提高1.2%～79.6%。不同種類多酚對于3 種轉運蛋白的表達影響不同，姜黃素最利于促進NPC1L1蛋白、SR-BI蛋白的表達。

圖2 多酚對葉黃素轉運蛋白表達的影響Fig. 2 Effects of polyphenols on the expression of lutein transporter proteins

2.5 多酚對葉黃素小鼠體內代謝的影響

利用體外消化獲得的葉黃素膠束溶液灌胃小鼠，研究不同多酚對葉黃素體內吸收的影響。如圖3所示，加入不同種類多酚均可使小鼠肝臟、血漿中葉黃素水平顯著增加（P＜0.05）。與對照組相比，多酚處理組對葉黃素肝臟吸收的作用效果顯著，與對照組相比提高2.36～7.27 倍，黃腐酚促進作用最為顯著。與對照組相比，多酚處理組對血漿中葉黃素質量濃度的影響顯著，與對照組相比提高11.1%～66.7%，其中黃腐酚的作用效果最明顯，與亞油酸組相比提高54.5%（P＜0.05）。

圖3 多酚對葉黃素小鼠體內吸收的影響Fig. 3 Effect of polyphenols on the absorption of lutein in mice

3 討 論

本研究發(fā)現多酚可以提高葉黃素的生物可及性，這與前期研究中柑橘黃烷酮可通過促進β-胡蘿卜素樣品脂滴水解來提高β-胡蘿卜素生物可及性的結果[22]相一致。葉黃素生物可及性的提高可能與多酚促進脂滴水解有關。研究發(fā)現多酚可以作為液體中穩(wěn)定脂滴的密集層，防止液滴收縮和合并[24]，尺寸較小的脂滴比表面積大，使胰脂肪酶更容易附著，促進脂滴水解[12]。本研究中多酚通過吸附在脂滴表面，降低脂滴粒徑，促進脂滴水解，進而有利于葉黃素摻入混合膠束。同時，本研究發(fā)現多酚可以減小葉黃素膠束的粒徑和電位，使其更加穩(wěn)定，避免其在胃腸環(huán)境中發(fā)生氧化降解，從而增加其在體外的生物可及性[25]。除此之外，消化液中的蛋白質可以和多酚形成共價復合物，這種共價復合物可以作為β-胡蘿卜素的乳化劑來提高β-胡蘿卜素乳化效果[26]，促進膠束的形成。因此，含有酚羥基較多的EGC、EGCG、黃腐酚和HES在胃腸消化環(huán)境中更易與蛋白發(fā)生共價復合作用，進而增強了葉黃素的乳化效果，提高了葉黃素的生物可及性[27]。

本研究發(fā)現多酚可以顯著提高細胞吸收葉黃素水平（表2），其中EGCG的作用效果較為明顯，此結果與多酚誘導的葉黃素生物可及性的變化結果相一致（圖1），這可能是由于多酚可以降低葉黃素膠束平均粒徑（表1），這樣也有利于葉黃素透過細胞。此外，多酚與細胞膜上的蛋白及脂質相互作用，激活靶蛋白調控細胞膜蛋白參與的信號通路[28]。通過本實驗進一步研究發(fā)現，多酚可以促進NPC1L1、SR-BI、CD36葉黃素轉運蛋白的表達，不同種類多酚對蛋白表達的影響不同，這可能是多酚結構的差異所導致。前期研究發(fā)現糖苷結構利于活化SR-BI蛋白[23]。本研究中EGCG、HES-G中具有糖苷鍵，這兩種多酚對SR-BI的表達促進作用顯著，與前期研究結果一致。本研究還發(fā)現黃腐酚和HES對SR-BI表達促進作用顯著，可能是因為這兩種多酚具有獨特的甲氧基基團，有利于活化SR-BI蛋白。另外，多酚促進細胞吸收葉黃素還可能與多酚的抗氧化性有關，抗氧化性強可以抑制葉黃素的氧化變性，從而有利于細胞吸收葉黃素，而多酚的抗氧化性與酚羥基的數量呈正相關[29]，本研究中EGCG的酚羥基數量最多，加入EGCG后葉黃素在細胞吸收過程氧化降解最少（圖1），所以EGCG對葉黃素生物可及性影響最大。

最后，通過小鼠體內實驗進行驗證，結果表明多酚可以顯著提高葉黃素體內吸收，黃腐酚對葉黃素體內吸收的作用效果提升最為顯著。這可能是由于黃腐酚屬于查耳酮類，在血漿中會被快速吸收，2 h左右達到最大血漿濃度，可以更快的發(fā)揮生理功能[30-31]，促進小鼠吸收代謝葉黃素。本研究發(fā)現多酚促進葉黃素在小鼠體內吸收的結果與多酚促進葉黃素膠束化、細胞吸收的結果相一致，說明在多酚存在下，葉黃素乳化和腸道吸收都是調控葉黃素體內累積的重要環(huán)節(jié)，但是不同種類多酚之間的作用有所差異。

4 結 論

多酚可在消化的不同階段促進葉黃素的吸收。在形成膠束階段，多酚可以降低葉黃素溶液的平均粒徑并提高ζ-電位絕對值，從而提高葉黃素的乳化效果和生物可及性；在腸道細胞吸收階段，多酚可以提高SR-BI、NPC1L1和CD36蛋白的相對表達量，并促進Caco-2細胞對葉黃素的吸收；小鼠體內吸收代謝實驗結果表明，多酚的加入可以使小鼠肝臟和血漿中葉黃素含量顯著增加。本研究結果可為科學補充葉黃素提供一種新思路，亦可為開發(fā)葉黃素復配營養(yǎng)劑提供理論參考。