羅 濤，李 宇，汪 芳,*，翁澤斌，熊 玲，宋海昭，王鑾鳳，沈新春,*

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院?中西醫(yī)結合學院，江蘇 南京 210000）

隨著全球老齡化加劇，老年性骨質疏松逐漸成為當今國際的研究熱點。世界衛(wèi)生組織關于骨質疏松的定義為：以骨量減少、骨組織微結構破壞、骨脆性增加和易于骨折為特征的代謝性疾病，其組織病理學特點為單位體積內骨量降低而骨礦物質與骨基質比例仍正?；蚧菊！Ｔ缙谘芯孔C實骨質流失與雌激素缺乏相關。但近年來大量研究表明，增齡性骨質疏松癥與氧化應激密切相關[1]。隨年齡增長，受環(huán)境和代謝因素影響，機體內大量產生自由基，抗氧化體系（活性氧清除酶類）能力下降，導致自由基在體內積累過多，從而產生氧化應激。這不但抑制了成骨細胞（osteoblast，OB）的骨形成作用[2-3]，還會誘導OB凋亡[4]，促進破骨細胞（osteoclast，OC）分化，進一步破壞骨穩(wěn)態(tài)[5]。目前市場上治療骨質疏松的藥物多以雌激素類為主，對人體會產生不同程度的副作用，因此，開發(fā)高效、安全、副作用小的抗骨質疏松天然產物成分顯得尤為重要。麥胚作為“人類天然的營養(yǎng)寶庫”，不僅含有豐富的蛋白質、生育酚、硫胺素、核黃素和煙酸，營養(yǎng)價值很高[6]，其酶解產物也具有極高的安全性和生物活性。研究表明麥胚肽可以改善氧化應激損傷模型小鼠體內的氧化應激水平[7]，陳思遠等[8]從麥胚清蛋白中提取的肽AREGETVVPG具有較強的自由基清除能力。但有關麥胚活性肽對氧化應激引起的老年性骨質疏松的作用研究較少?；诖耍芯葵溑呋钚噪脑诠琴|疏松中的作用對麥胚資源的開發(fā)具有重大意義。

在人體骨代謝環(huán)境中，OC首先侵蝕舊骨，而后OB通過分泌膠原蛋白，吸收血液中的鈣鎂離子，逐漸形成骨組織，填補OC引起的骨凹陷，從而形成骨代謝循環(huán)。OB和OC間的功能活動并不是孤立存在的，二者之間的相互作用是骨組織代謝的直接調節(jié)因素。在骨重建過程中，OB和OC相互耦聯，然而目前相關研究大多采用單一的細胞模型，不能體現骨重建過程中的這種耦聯關系，而OB和OC共育體系更接近機體內的骨穩(wěn)態(tài)環(huán)境。在共育條件下，這兩種細胞能夠通過外泌體和旁分泌進行細胞間信號傳遞。OB-OC共育體系已被報道為研究骨穩(wěn)態(tài)的體外細胞模型，并用于篩選骨疾病的治療藥物[9]。

前期研究對小麥胚芽蛋白進行酶解、超濾、分離和鑒定，得到活性肽ADWGGPLPH，發(fā)現其具有極強的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力，并且可以通過調節(jié)PKCζ/AMPK/NOX4通路消除高糖誘導的平滑肌細胞氧化應激[10-11]。但麥胚源活性肽ADWGGPLPH在氧化應激條件下在骨環(huán)境中的作用尚未明確。本研究在OB-OC細胞共育體系中構建氧化應激模型，研究麥胚源活性肽對OB增殖、分化活性和凋亡以及OC分化的影響，以期為從麥胚蛋白中開發(fā)維持骨穩(wěn)態(tài)功能因子提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥胚源活性肽ADWGGPLPH（純度大于95%，分子質量949.03 Da） 南京金斯瑞生物科技有限公司；MC3T3-E1細胞株、小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞株上海中科院細胞庫。

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、α-MEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶溶液、青霉素-鏈霉素（100×）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國Gibco公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、ECL化學發(fā)光試劑盒 美國Thermo Fisher公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、2,7-二氯熒光素二乙酸酯（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）（避光保存）、L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉 美國Sigma公司；抗壞血酸（VC） 廣東西隴科學有限公司；噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT）、質量分數1%多聚甲醛溶液 北京索萊寶科技有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）-Annexin V凋亡檢測試劑盒I 美國BD公司；Hoechst 33258染料、結晶紫染料、BCA蛋白濃度測定試劑盒、細胞裂解液 碧云天生物技術（上海）有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活力檢測試劑盒、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒南京建成生物工程研究所；蛋白I型膠原（protein type I collagen，COL-I）酶聯免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、骨鈣素（osteocalcin，OCN）ELISA試劑盒 上海酶聯生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Spectra Max M2e酶標儀 美國Molecular Devices公司；HY-1漩渦混合儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；JY92-II超聲細胞粉碎儀 寧波新藝超聲設備有限公司；5200Tanon數碼凝膠圖像分析系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；Axio Vert.A1熒光倒置顯微鏡 卡爾蔡司光學（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 成骨細胞MC3T3-E1的培養(yǎng)

小鼠成骨細胞MC3T3-E1在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/L鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中，待細胞貼壁生長至80%融合后，吸棄培養(yǎng)液，用預冷PBS洗3 次，加入2 mL胰蛋白酶溶液，輕輕搖晃10 s，吸棄后將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中孵育90 s，使細胞變成球狀，拍散后加入4 mL培養(yǎng)液，用槍頭吹打細胞層使細胞從皿底脫落，并使之均勻分散，根據實驗需要進行細胞傳代或鋪板。

1.3.2 巨噬細胞RAW264.7的培養(yǎng)及誘導分化破骨細胞

小鼠巨噬細胞RAW264.7在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/L鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中。待細胞貼壁生長至80%融合后，吸棄培養(yǎng)液，預冷PBS洗3 次后用細胞培養(yǎng)液輕輕吹打細胞，使其脫落并使細胞分散均勻，根據實驗需要進行細胞傳代或鋪板。

1.3.3 OB-OC共育體系的建立

采用Transwell實驗建立共育體系。將小鼠巨噬細胞RAW264.7按4×104個/孔鋪于6 孔板內，待其貼壁后，使用OC分化因子核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor κB ligand，RANKL）和巨噬細胞集落刺激因子M-CSF誘導72 h，分化成OC。在6 孔板中放置Transwell小室，按2×105個/孔鋪板培養(yǎng)OB，于α-MEM培養(yǎng)液中共育24 h和48 h[12-13]。

1.3.4 MTT法檢測OB活力

在Transwell小室中OB-OC共育24 h和48 h后，取出上室，加入30 μL MTT，并于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸棄MTT，加入400 μL DMSO，37 ℃搖晃15 min，取200 μL上清液于96 孔板中，用酶標儀于570 nm波長處測定吸光度。以無細胞培養(yǎng)液為空白組，以單獨培養(yǎng)的OB為對照組，按式（1）計算OB-OC體系中OB相對活力。

OB-OC共育24 h后，加入100、200、300 μmol/L H2O2，用MTT法測定OB活力，確定H2O2實驗濃度。添加相應濃度H2O2、麥胚肽，OB-OC共育24 h后，使用試劑盒測定培養(yǎng)上清液中LDH活力。

1.3.5 結晶紫染色觀察OB生長狀態(tài)

在OB分別完成單獨培養(yǎng)以及共育培養(yǎng)后，吸棄6 孔板內培養(yǎng)液，PBS洗3 次，質量分數1%多聚甲醛溶液固定20 min，然后PBS浸洗3 次，結晶紫染料染色20 min，再次用PBS浸洗3 次，于空氣中干燥后拍照記錄，并使用Image J軟件記錄染色細胞數目。

1.3.6 TRAP染色檢測OC分化活性

按1.3.3節(jié)OB-OC共育24 h后，首先吸棄細胞培養(yǎng)液，每孔加入1 mL固定液于6 孔板中固定細胞10 min，用超純水洗3 次，立刻在每孔加入孵育液1 mL，避光孵育60 min。孵育結束后超純水洗3 次，在水未完全干時，用蘇木素復染5～10 min，吸棄復染液進行拍照記錄。統(tǒng)計分化后多核細胞所占面積即為OC相對陽性面積。

1.3.7 共育體系中OB的骨代謝相關蛋白表達水平測定

提取共育后OB內骨保護素（osteoclastogenesis inhibitory factor，OPG）、RANKL、核因子κB受體活化因子（receptor activator for nuclear factor κB，RANK）、腫瘤壞死因子受體相關分子6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）蛋白并測定蛋白質量濃度，將各組蛋白樣品利用細胞裂解液稀釋至相同質量濃度，然后以體積比4∶1加入5×蛋白上樣緩沖液，混勻后于95 ℃下水浴加熱5 min，置于冰上冷卻，上樣；選擇12%的分離膠，每孔進行加樣10 μg，調整電壓80 V進行電泳，當溴酚藍指示劑進入分離膠后，電壓調整至120 V，至電泳結束；電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉3～4 h，TBST溶液清洗4 次，每次15 min。然后加入一抗中低溫封閉過夜，TBST溶液清洗4 次，每次15 min，再轉移至相應二抗中室溫封閉1 h，然后用TBST溶液清洗4 次，每次15 min，完成后顯色拍照，以β-actin作為內參蛋白進行相對定量。

1.3.8 氧化應激水平測定

按1.3.3節(jié)OB-OC共育24 h后，加入200 μmol/L H2O2，同時加入終濃度分別為20、40 μmol/L的麥胚肽處理24 h，以10 μmol/L VC處理24 h為陽性對照組[14]，每個濃度設3 個平行。

處理完成后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入1 mL 10 μmol/L DCFH-DA熒光探針，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，吸棄培養(yǎng)液，用PBS清洗2 次，加入500 μL 0.25%胰蛋白酶溶液，輕輕搖晃10 s，吸棄胰蛋白酶溶液，并置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育90 s，拍打并觀察細胞消化情況。

待細胞消化完全后，每孔加入1 mL培養(yǎng)液，輕輕吹打，轉移到離心管中，1 000 r/min離心3 min，吸棄上清液，每支離心管中加入1 mL PBS，將細胞吹打均勻，置于冰上，用流式細胞儀檢測共育體系中OB內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，結果以FITC熒光強度表示。

處理完成后按照試劑盒說明書測定細胞內GSH-Px、SOD活力及MDA含量。

1.3.9 ALP活力測定

利用ALP活力測定共育體系中OB早期分化活性。按1.3.3節(jié)誘導分化處理，OB-OC按比例5∶1于α-MEM培養(yǎng)液中共育24 h，待共育環(huán)境穩(wěn)定后，在7.5% FBS、50 μg/mL VC和4 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，培養(yǎng)7 d，每3 d換一次培養(yǎng)液。然后加入200 μmol/L H2O2，同時加入終濃度分別為20、40 μmol/L的麥胚肽處理24 h，每個濃度設3 個平行。處理完成后用預冷的PBS洗3 次，加入細胞裂解液120 μL置于冰上搖晃15 min，用細胞刮刀將細胞刮下，轉移到1.5 mL離心管中，冰浴下超聲破碎（300 W、5 s/次、間隔5 s，重復5 次），并在4 ℃、12 000 r/min下離心15 min，取上清液，于-80 ℃保存待用。根據試劑盒說明書步驟測定ALP活力，單位為U/g。用BCA法檢測細胞內總蛋白質量，校正ALP活力。

1.3.10 COL-I和OCN水平測定

按1.3.3節(jié)誘導分化步驟，分化培養(yǎng)7 d后測定早期分化指標COL-I質量濃度，單位為mg/L；分化培養(yǎng)21 d后測定晚期分化指標OCN質量濃度，單位為μg/L。具體操作按照相應ELISA檢測試劑盒說明書進行。

1.3.11 OB礦化率測定

按1.3.3節(jié)誘導分化步驟，分化培養(yǎng)21 d，然后加入200 μmol/L H2O2，同時加入終濃度分別為20、40 μmol/L的麥胚肽處理24 h，每個濃度設3 個平行。處理24 h后，細胞用PBS洗滌兩次，然后用10%福爾馬林溶液固定10 min，加入1%茜素紅（pH 4.2），再孵育10 min，雙蒸水洗滌兩次，晾干，用倒置顯微鏡拍照觀察。

處理24 h后，每孔加入1 mL 100 mmol/L氯化十六烷基吡啶溶液，37 ℃恒溫振蕩20 min，在562 nm波長處測定吸光度。以不含細胞的氯化十六烷基吡啶溶液為空白組，OB礦化率按式（2）計算。

式中：A、A0和A1分別為對照組、空白組以及加樣組吸光度。

1.3.12 Annexin V-FITC/PI雙染實驗

OB-OC共育24 h后，加入200 μmol/L H2O2，同時加入終濃度分別為20、40 μmol/L的麥胚肽處理24 h，每個濃度設3 個平行。處理完成后，用PBS清洗細胞，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液1 mL進行消化處理，使用培養(yǎng)液重懸，1 000 r/min離心5 min后用預冷的PBS洗滌細胞，再次離心去除上清液，重復洗滌兩次。然后用1×結合緩沖液重懸，調整細胞濃度為1×106個/mL，轉移1×105個細胞至新的離心管中，加入5 μL Annexin VFITC和5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料，混勻后于室溫下避光處理15 min，然后加入400 μL 1×結合緩沖液并混勻，利用流式細胞儀檢測。流式細胞儀激發(fā)光波長488 nm，用波長515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，波長大于560 nm的濾器檢測PI。每組設置3 個平行，利用Flowjo軟件分析細胞凋亡率。

1.3.13 Hoechst染色實驗

OB-OC共育24 h后，加入200 μmol/L H2O2，同時加入終濃度分別為20、40 μmol/L的麥胚肽處理24 h，每個濃度設3 個平行。處理完成后，用質量分數4%多聚甲醛溶液固定Transwell小室內的OB，固定時間20 min，用PBS洗滌兩次，然后用Hoechst 33258染料染色10 min，PBS洗滌3 次，使用熒光倒置顯微鏡觀察并拍攝細胞核形態(tài)。根據凋亡細胞比例計算凋亡率。

1.4 數據處理與分析

實驗至少重復3 次，結果以平均值±標準差表示。采用Excel和Origin 8.0軟件進行t檢驗統(tǒng)計分析。P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 OB-OC共育體系下氧化應激模型的構建

如圖1A所示，隨培養(yǎng)時間延長，單獨培養(yǎng)的OB以及OB-OC共育體系中OB的生長密度均逐漸增大，但培養(yǎng)48 h后，OB-OC共育體系的OB生長密度稍小于單獨培養(yǎng)的OB，這是因為OC來源的外泌體會抑制OB的持續(xù)增殖，這可以維持骨增長處于相對平衡狀態(tài)[15]。用MTT法進一步測定OB增殖活性，如圖1B所示，共育24 h時，共育體系中OB增殖活性與單獨培養(yǎng)的OB無顯著差異（P＞0.05），但在48 h時共育體系中OB增殖活性顯著低于單獨培養(yǎng)的OB（P＜0.05）；與上述OB生長密度觀察結果相印證。因此，選取24 h作為后續(xù)實驗的OB-OC共育時間。利用TRAP染色進一步驗證共育體系中OC分化活性，如圖1C、D所示，與單獨培養(yǎng)的OC相比，共育體系中OC具有更強的分化活性，說明共育條件下，OC進一步分化使整個培養(yǎng)體系達到穩(wěn)態(tài)[9]。在人體骨代謝環(huán)境中，OC首先侵蝕舊骨，然后OB通過分泌膠原蛋白，吸收血液中的鈣鎂離子，逐漸形成骨組織，填補OC引起的骨凹陷，從而形成骨代謝循環(huán)。

圖1 OB-OC共育體系的構建Fig. 1 Establishment of an OB-OC co-culture system

如圖2所示，與單獨培養(yǎng)OB相比，共育體系中OB的OPG表達量極顯著降低（P＜0.01），RANKL表達量極顯著上升（P＜0.01），這是由于共培養(yǎng)中OB與OC接觸，OC表面的RANK作為受體與OB中的膜蛋白RANKL結合，促使RANKL表達量上升，從而促進OC分化[16]。

圖2 OB-OC共育體系中OB的OPG、RANKL蛋白表達水平Fig. 2 Expression of OPG and RANKL proteins in OB-OC co-culture system

老年性骨質疏松的發(fā)生與自由基積累導致的骨代謝失衡密切相關，因此，在共育體系中構建氧化應激模型模擬老齡群體的骨代謝內環(huán)境。H2O2是一種常見的自由基，常被用于構造氧化應激模型。采用MTT檢測不同H2O2濃度對共育體系下OB存活率的影響。如圖3所示，H2O2對共育體系中OB相對活力的影響呈明顯劑量依賴效應。在H2O2濃度為200 μmol/L時，OB相對活力較未添加H2O2時極顯著下降（P＜0.01），隨著H2O2濃度繼續(xù)上升，OB相對活力進一步下降。因此，選擇H2O2濃度為200 μmol/L建立共育體系氧化應激模型。

圖3 H2O2濃度對共育體系中OB相對活力的影響Fig. 3 Effect of H2O2 on viability of OB in co-culture system

2.2 麥胚活性肽對共育體系中H2O2誘導的OB氧化應激水平的影響

通過流式細胞儀檢測麥胚肽對OB內ROS的影響，如圖4A所示，H2O2使OB內ROS水平極顯著上升（P＜0.01），當20 μmol/L和40 μmol/L麥胚肽干預后，OB內ROS水平極顯著降低（P＜0.01），且呈劑量依賴性，說明麥胚肽可以有效降低共育體系中OB的氧化應激水平，且40 μmol/L麥胚肽與陽性對照VC的作用效果未見顯著差異（P＞0.05）。GSH-Px可特異催化還原型GSH對H2O2的還原反應[17]。如圖4B所示，與空白組相比，H2O2使OB內GSH-Px活力極顯著下降（P＜0.01），麥胚肽能夠有效提高GSH-Px活力（P＜0.01），從而催化GSH對H2O2的還原反應，降低細胞內自由基含量，且40 μmol/L麥胚肽與陽性對照VC的作用效果未見顯著差異（P＞0.05）。

SOD是機體內清除氧自由基的重要抗氧化酶，能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷；SOD活力間接反映了機體清除氧自由基的能力。如圖4C所示，與空白組相比，H2O2組SOD活力極顯著下降（P＜0.01），說明H2O2使OB清除自由基的能力變弱。20 μmol/L和40 μmol/L麥胚肽干預后，SOD活力極顯著上升（P＜0.01），且呈劑量依賴性，但稍弱于VC組。說明麥胚肽可以改善共育體系下OB清除自由基的能力。

MDA是氧自由基攻擊生物膜中不飽和脂肪酸而形成的過氧化物，其含量可反映機體內脂質過氧化和機體細胞受自由基攻擊的損傷程度[18]。如圖4D所示，與空白組相比，H2O2組MDA含量極顯著上升（P＜0.01），說明H2O2組OB受自由基攻擊的程度比較嚴重。20 μmol/L和40 μmol/L麥胚肽干預后，MDA含量極顯著下降（P＜0.01），且呈劑量依賴性，但效果稍差于VC組。說明麥胚肽可以使OB在一定程度上抵御自由基的攻擊。

圖4 麥胚活性肽對共育體系中OB氧化應激的影響Fig. 4 Effect of wheat germ-derived peptide on oxidative stress indexes of OB in co-culture system

2.3 麥胚活性肽對H2O2誘導下共育體系中OB活性的影響

采用MTT法測定麥胚肽對氧化應激共育體系中OB活力的影響。如圖5A所示，共育體系下，H2O2極顯著降低了OB相對活力（P＜0.01），而麥胚肽能夠有效改善H2O2造成的OB相對活力降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性，40 μmol/L麥胚肽干預后OB相對活力由H2O2組的60.4%提高至92.8%。LDH是穩(wěn)定的胞漿酶，存在于所有細胞中，當細胞膜損傷時會快速釋放到細胞培養(yǎng)液中，檢測細胞培養(yǎng)上清液中LDH活力能夠反映細胞膜受損程度。如圖5B所示，共育體系中，與空白組相比，H2O2極顯著增加了培養(yǎng)上清液中LDH活力（P＜0.01），說明H2O2使共育體系中OB膜嚴重受損，麥胚肽可以有效緩解OB膜損傷（P＜0.01）。

圖5 麥胚活性肽對氧化應激共育體系中OB活性的影響Fig. 5 Effect of wheat germ-derived peptide on OB viability in co-culture system under oxidative stress

2.4 麥胚活性肽對氧化應激共育體系中OB凋亡的影響

氧化應激通常會引起OB凋亡，而OB凋亡是骨質疏松的特征之一。如圖6A、B所示，共育體系中，與空白組相比，H2O2導致OB凋亡率極顯著上升（P＜0.01），40 μmol/L麥胚肽干預后，OB凋亡率由12.4%下降至5.3%（P＜0.01）。此外，如圖6C、D所示，通過Hoechst染色實驗也發(fā)現，在共育體系中，H2O2可以誘導OB凋亡率極顯著上升（P＜0.01），40 μmol/L麥胚肽干預后，OB凋亡率由15.1%下降至7.1%（P＜0.01），進一步佐證了FITC-PI雙染結果。

圖6 麥胚活性肽肽對氧化應激共育體系中OB凋亡的影響Fig. 6 Effect of germ-derived peptide on OB apoptosis in co-culture system under oxidative stress

2.5 麥胚活性肽對H2O2誘導下共育體系中OB分化活性的影響

ALP的主要功能是在OB分化過程中水解磷酸酯，為羥基磷灰石的沉積提供必要的磷酸，同時水解焦磷酸鹽，解除焦磷酸鹽對骨鹽形成的抑制作用，從而促進OB分化。在骨組織中，ALP在分化過程的早期階段表達，可在基質囊泡中的細胞表面觀察到。在分化過程后期，ALP表達下降[19]。如圖7A所示，共育體系中，與空白組相比，H2O2極顯著抑制了OB中ALP活力（P＜0.01），麥胚肽能夠有效改善OB內ALP活力的下降（P＜0.01），且呈劑量依賴性。

COL-I常作為OB早期分化的一項檢測指標[20-21]。COL-I對骨組織結構的完整及維持其生物力學特性具有重要作用。如圖7B所示，共育體系下，與空白組相比，H2O2極顯著降低OB早期分化過程中COL-I水平（P＜0.01），麥胚肽能夠有效提高OB中COL-I水平（P＜0.01），并呈劑量依賴性。

礦化結節(jié)是OB分化成熟的標志，同時也是OB行使成骨功能的主要形態(tài)學表現。研究表明，H2O2能顯著降低OB的礦化能力[22]。如圖7C、D所示，共育體系下，誘導分化21 d的OB出現大面積礦化結節(jié)染色，H2O2導致礦化結節(jié)面積顯著下降，40 μmol/L麥胚肽干預后，礦化率從H2O2組的21.3%提高至84.3%（P＜0.01）。

OCN是由OB特異性分泌的小分子非膠原蛋白質，在OB分化末期出現，具有維持骨正常礦化速率的作用，礦化過程受OCN表達水平的影響[23]。OCN可以調節(jié)鈣離子穩(wěn)態(tài)和骨礦物沉積，促進OB分化成熟及骨細胞形成[24]。如圖7E所示，與空白組相比，H2O2導致OB晚期分化標志物OCN水平極顯著下降（P＜0.01），麥胚肽干預后，OCN水平極顯著上升（P＜0.01）。

圖7 麥胚活性肽對氧化應激共育體系中OB分化活性的影響Fig. 7 Effect of wheat germ-derived peptide on the differentiation of OB in co-culture system under oxidative stress

2.6 麥胚活性肽對氧化應激共育體系中OC分化的影響

通過TRAP染色檢測麥胚肽對共育體系內OC分化的影響。如圖8所示，和空白組相比，H2O2顯著促進OC的分化活性，從而造成OC過度分化（P＜0.01），40 μmol/L麥胚肽干預后，OC相對陽性面積從H2O2組的376.4%減小至128.1%（P＜0.01），抑制了由H2O2引起的OC分化活性異常。

圖8 麥胚活性肽對氧化應激共育體系中OC分化的影響Fig. 8 Effect of wheat germ-derived peptide on OC differentiation in co-culture system under oxidative stress

OPG、RANK和RANKL通路的三聯體成分是TNF-α受體超家族成員[25-26]。當OB釋放的RANKL與OC表面RANK結合后，TRAF6會與RANK快速結合，激活下游信號通路，最終達到促進OC分化、成熟的作用[27-28]。OPG可競爭性抑制并有效阻斷RANKL與OC表面RANK結合，延緩前體OC的活化，抑制骨吸收，達到維持骨代謝平衡的目的[29-30]。通過Western blot檢測麥胚肽對共育體系下OB內OPG、RANKL、RANK、TRAF6的表達情況。如圖9A、B所示，H2O2極顯著抑制了OB內OPG的表達（P＜0.01），麥胚肽干預后極顯著提高了OPG的表達量（P＜0.01）。如圖9C～E所示，H2O2極顯著提高了OB內RANKL、RANK和TRAF6的表達量（P＜0.01），麥胚肽可以極顯著抑制OB內RANKL、RANK和TRAF6表達（P＜0.01），且呈劑量依賴性。綜上，共育體系中，H2O2促進RANKL表達，RANK表達量也隨之增加，誘餌受體OPG結合力變弱，導致表達量下降，而RANK下游蛋白TRAF6表達量也上升，從而促進OC細胞分化，而麥胚肽可以通過調節(jié)OPG/RANKL/RANK通路，降低OC分化誘導因子TRAF6表達量，從而降低OC的分化活性。

圖9 麥胚活性肽對氧化應激共育體系中骨代謝相關蛋白表達的影響Fig. 9 Effect of wheat germ-derived peptide on the expression of bone metabolism-related proteins in co-culture system under oxidative stress

3 討 論

小麥胚芽肽是以麥胚蛋白為原料，經微生物發(fā)酵或酶水解得到的小分子生物活性肽[31]。前期研究表明，麥胚源活性肽ADWGGPLPH能夠有效抑制高糖誘導的平滑肌細胞氧化應激[9-10]。本研究選用麥胚源活性肽ADWGGPLPH，利用OB-OC共育模型探究其在氧化應激環(huán)境中對OB和OC間穩(wěn)態(tài)的調節(jié)能力。

氧化應激被認為是誘發(fā)衰老相關疾病的重要因素。骨質疏松作為常見的老年性疾病也已被證實其發(fā)病與氧化應激有著密切關系[32]。為評價麥胚源活性肽對共育體系中OB氧化應激水平的影響，通過檢測ROS、GSH-Px、SOD、MDA水平發(fā)現，麥胚源活性肽能夠有效改善H2O2誘導的OB氧化?；诖?，假設ADWGGPLPH可能會改善氧化應激引起的OB和OC活性異常，維持共育體系穩(wěn)態(tài)。為驗證麥胚源活性肽是否對OB的增殖和分化具有積極作用，本研究采用結晶紫染色和ELISA等方法檢測發(fā)現，ADWGGPLPH能夠有效促進氧化應激環(huán)境下共育體系中OB的增殖和分化活性，因此，可以初步得出結論：麥胚源活性肽能夠通過促進OB的增殖和分化活性，緩解氧化應激對共育體系中OB活性的影響。進一步研究發(fā)現，麥胚源活性肽還可以抑制氧化應激共育體系中OB的凋亡。

OPG是位于OB內部的TNF-α受體超家族的成員蛋白，它可以與同樣位于OB內部的RANKL特異性結合，繼而影響位于OC表面的RANK，從而抑制OC的分化。因此，OPG又被稱作OC形成抑制因子[33]。OPG/RANKL/RANK是調控骨代謝的重要通路之一，也是參與影響OC分化、發(fā)育和功能的唯一途徑，而OPG/RANKL/RANK信號通路在誘導OC分化成熟、促進骨吸收的同時，OB分泌的OPG使OPG/RANKL比例保持在適當水平[32]，以防止骨吸收過度，從而維持骨代謝平衡。本研究通過Western blot以及TRAP染色發(fā)現，麥胚源活性肽可以通過調節(jié)OPG/RANKL/RANK通路抑制OC的分化活性，從而改善氧化應激引起的OB和OC活性異常。

已有許多研究發(fā)現，抗氧化物質干預氧化應激造成的骨代謝異常，從而延緩骨質疏松的發(fā)展。白藜蘆醇能夠通過MAPK磷酸化等抑制OC的分化以及ROS的產生，進而達到促進骨形成的目的[34]；褪黑素可以促進抗氧化酶的表達發(fā)揮抗氧化活性，延緩骨質疏松的發(fā)病進程[35]。此外，茶多酚、藍莓中的多酚等多種抗氧化物質都被證實具有緩解骨質疏松能力[36-38]?；谏鲜鲅芯拷Y果，后續(xù)本課題組將使用自然衰老大鼠為模型，對麥胚源活性肽ADWGGPLPH維持與氧化應激相關的老年性骨穩(wěn)態(tài)的營養(yǎng)干預進行研究。

4 結 論

麥胚源活性肽可以有效降低共育體系中H2O2誘導的OB氧化應激以及緩解氧化應激造成的OB損傷和凋亡，并促進OB的增殖活性。此外，麥胚源活性肽可以改善氧化應激共育體系中OB分化活性的下降，并通過調節(jié)OPG/RANKL/RANK通路抑制OC的過度分化，從而改善共育體系中氧化應激引起的OB和OC活性異常，維持良好的細胞穩(wěn)態(tài)。研究結果可為從麥胚蛋白中開發(fā)維持骨穩(wěn)態(tài)的功能因子提供科學依據。