程志敏，陳彥榮，王建輝，劉冬敏，方 芳，張 博，牟鳴薇，謝雨菲，易金枝

（長沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410114）

青花椒（Zanthoxylum schinifoliumSiebold & Zucc.）是蕓香科（Rutaceae）花椒屬植物，果實(shí)油腺飽滿，氣味芬芳獨(dú)特，是我國傳統(tǒng)香辛料[1-2]。在民間醫(yī)學(xué)中，花椒屬植物常被用于治療牙痛、腹瀉等疾病[3]。從青花椒果皮中提取得到的青花椒精油（Z. schinifoliumessential oils，ZSEOs）具有廣譜抑菌活性。Lei Hong等[3]報道了花椒精油對大腸桿菌（Escherichia coli）的最小抑菌質(zhì)量濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為24 mg/mL，能夠顯著抑制E. coli的生長并對其形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響。Li Ren等[4]研究發(fā)現(xiàn)毛大葉臭花椒精油中芳樟醇的相對含量高達(dá)79.00%，對E. coli、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、白色念珠菌（Candida albicans）、煙曲霉（Aspergillus funigatus）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）均具有抑菌活性。此外，ZSEOs對表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）也具明顯抑制作用，最小殺菌質(zhì)量濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）均為5 mg/mL[5]。然而，關(guān)于ZSEOs對致齲菌如變形鏈球菌（Streptococcus mutans）的體外抑菌活性鮮有報道。

齲齒是人類最常見的傳染病之一，是一種由特定細(xì)菌引起的多種微生物共同作用導(dǎo)致的疾病[6]。血鏈球菌（S. sanguinis）是最早定植于牙齒表面上的細(xì)菌之一，其定植后促進(jìn)了S. mutans和其他細(xì)菌的定植與黏附[7-8]。研究表明，S. mutans和遠(yuǎn)緣鏈球菌（S. sobrinus）與人類齲齒密切相關(guān)[9-11]。目前，由于洗必泰（chlorhexidine，CHX）[12]等抗生素存在耐藥性、毒副作用等不良影響，研究人員逐漸將目光轉(zhuǎn)向具有抗齲活性的天然產(chǎn)物，如檸檬精油[11,13]等。研究結(jié)果顯示，檸檬精油及其主要成分檸檬烯均能抑制S. mutans和S. sobrinus的增殖，檸檬精油對兩種細(xì)菌的MIC均為4.50 mg/mL[11,13]。青花椒與檸檬同屬蕓香科植物，ZSEOs可能對致齲菌也存在抑制活性，但迄今鮮見理論數(shù)據(jù)支撐。

本實(shí)驗采用水蒸氣蒸餾法提取ZSEOs，通過全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜（comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS）確定ZSEOs的化學(xué)組成，通過測定抑菌圈直徑、MIC、MBC、致齲菌生長曲線研究ZSEOs對3 種致齲菌的體外抑菌活性，并通過掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）觀察ZSEOs作用于致齲菌后菌體的形態(tài)變化，初步探討ZSEOs抑菌機(jī)制，為ZSEOs作為潛在的天然齲病抗菌劑提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

S. mutans（北納保藏中心（BeNa Culture Collection，BNCC）234186）、S. sanguinis（BNCC 134927）和S. sobrinus（BNCC 353916）購買于商城北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

實(shí)驗所用青花椒分別產(chǎn)自重慶江津、四川金陽、貴州德江以及云南昭通。

無水硫酸鈉（分析純）、95%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇（分析純）、叔丁醇（化學(xué)純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；腦心浸出液肉湯（brain heart infusion，BHI）美國BD公司；瓊脂粉、Gluta固定液（SEM專用，2.5%）北京索萊寶科技有限公司；CHX、碘硝基氯化四氮唑藍(lán)（p-iodonitrotetrazolium chloride，INT） 上海源葉生物科技有限公司；厭氧產(chǎn)氣袋C-01、厭氧指示劑C-22日本三菱瓦斯化學(xué)株式會社。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZM-80L立式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；BBS-SDC醫(yī)用潔凈工作臺 濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；Pegasus?4D GC×GC-TOFMS儀 美國LECO公司；VERSA max酶標(biāo)儀 美國分子儀器公司；JSM-IT500 SEM 日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 ZSEOs的提取

參考文獻(xiàn)[14]采用水蒸氣蒸餾法從產(chǎn)于重慶江津、貴州德江、四川金陽、云南昭通的青花椒果皮（圖1）中提取ZSEOs，分別記為ZS1EO、ZS2EO、ZS3EO、ZS4EO。將ZSEOs收集于棕色螺紋瓶中，無水硫酸鈉干燥12 h，4 ℃冷藏備用。按下式計算精油得率。

圖1 4 個不同產(chǎn)地青花椒的干燥果皮Fig. 1 Dry pericarp of Zanthoxylum schinifolium from four production areas in China

1.3.2 ZSEOs組成分析

采用GC×GC-TOFMS分析ZSEOs組成：第一維柱DB×WAX（30 m×250 μm，0.25 μm），進(jìn)樣溫度250 ℃、進(jìn)樣量0.5 μL，初始溫度60 ℃保留1 min，以5 ℃/min升至260 ℃，保留4 min。以He（99.9999%，1.0 mL/min）為載氣，分流比10∶1。第二維柱DB-17MS（2 m×100 μm，0.10 μm），柱溫高于第一維柱15 ℃。調(diào)制解調(diào)器溫度始終高于第二維柱15 ℃。全二維分析時調(diào)制周期4.0 s、接口溫度270 ℃、離子源溫度230 ℃、電子轟擊離子源70 eV、檢測器電壓1 670 V、采集頻率50 張/s，質(zhì)譜掃描范圍為m/z33～550。

GC×GC-TOFMS結(jié)果經(jīng)NIST17 MS Search檢索后進(jìn)一步根據(jù)質(zhì)譜圖鑒定ZSEOs的組成。通過峰面積歸一化法確定各組分的相對含量。

1.3.3 ZSEOs抑菌活性測定

1.3.3.1 菌懸液的制備

將保藏S. mutans、S. sanguinis和S. sobrinus標(biāo)準(zhǔn)菌株的甘油管于37 ℃水浴1 min快速解凍。在無菌條件下，按照5%（體積分?jǐn)?shù)）接種量分別接種至BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h[15]（后同），然后分別劃線接種至BHI瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，挑取典型單個菌落接種至BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。充分振蕩混勻，測定630 nm波長處光密度值OD630nm，調(diào)整菌懸液濃度至1×107CFU/mL（OD630nm＝0.2）備用。

1.3.3.2 抑菌圈直徑的測定

采用牛津杯法[16]測定4 種ZSEOs對3 種致齲菌的抑菌活性。用95%乙醇溶液將受試ZSEOs稀釋至質(zhì)量濃度32 mg/mL備用。在無菌操作臺中，將20 mL高溫高壓滅菌后的BHI瓊脂培養(yǎng)基冷卻至45～50 ℃，然后注入200 μL菌懸液（1.3.3.1節(jié)制備，濃度1×107CFU/mL，下同），振蕩混勻，迅速傾入均勻放置了3 個牛津杯（直徑6 mm）的無菌培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，待培養(yǎng)基凝固后取出牛津杯，吸取4 種待測ZSEOs樣液各100 μL，分別注入相應(yīng)標(biāo)記孔中。分別以等體積95%乙醇溶液和0.5 mg/mL CHX溶液作為陰性對照和陽性對照。將培養(yǎng)皿置于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，觀察并記錄抑菌圈直徑。實(shí)驗獨(dú)立重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.3.3 MIC和MBC的測定

采用肉湯微量稀釋法[17]測定ZSEOs對3 種致齲菌的MIC和MBC。首先，將ZSEOs用BHI液體培養(yǎng)基連續(xù)二倍稀釋至終質(zhì)量濃度分別為0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 mg/mL。吸取100 μL菌懸液和100 μL含不同質(zhì)量濃度ZSEOs的BHI液體培養(yǎng)基加入96 孔板中，每個質(zhì)量濃度6 個復(fù)孔。以等體積BHI液體培養(yǎng)基為陰性對照組，以等體積0.5 mg/mL CHX為陽性對照組?？瞻讓φ战M中不添加菌液。將96 孔板于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。然后每孔加入40 μL INT染劑（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%，下同）。在微生物存在的情況下，INT指示劑的顏色將從透明變?yōu)榉奂t色或紅色[17]。MIC為加入INT染劑后微孔中溶液不變色的最低ZSEOs劑量。然后從所有未變色的微孔中分別吸取10 μL混合培養(yǎng)物，分別對應(yīng)加入100 μL含不同質(zhì)量ZSEOs的新鮮BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后加入20 μL INT染劑進(jìn)行第二次INT染色。MBC為加入INT染劑不引起微孔中溶液變色的最低ZSEOs劑量。

1.3.3.4 致齲菌生長曲線的測定

由抑菌圈直徑及MIC、MBC結(jié)果篩選出抑菌活性最優(yōu)的青花椒精油（ZSXEO）。根據(jù)Lei Hong等[3]的方法作適當(dāng)修改，通過測定致齲菌生長曲線，初步探討ZSXEO對3 種致齲菌生長的影響。于96 孔板中，將菌懸液與新鮮BHI液體培養(yǎng)基按照體積比1∶10混合，于37 ℃厭氧培養(yǎng)。在細(xì)菌生長的延遲期和對數(shù)生長期分別向培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為MIC的ZSXEO。繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 h采用酶標(biāo)儀測定630 nm波長處的光密度值OD630nm，繪制生長曲線。陽性對照組中將ZSXEO替換為CHX（0.5 mg/mL），陰性對照組中不添加ZSXEO。

1.3.3.5 菌體微觀結(jié)構(gòu)觀察

通過觀察ZSXEO處理后3 種致齲菌的形態(tài)變化，初步探討ZSXEO的抗菌機(jī)理。參考Khaleda等[18]報道的方法并作適當(dāng)修改。將無菌細(xì)胞爬片置于24 孔板底，每孔加入1.5 mL BHI液體培養(yǎng)基和0.5 mL菌懸液，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。觀察到細(xì)菌附著生長于玻片上后，棄去上清液并用0.01 mol/L pH 7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗。用BHI液體培養(yǎng)基將ZSXEO稀釋至MIC，取2 mL稀釋液加入孔板，分別以等體積BHI培養(yǎng)基和CHX溶液（0.5 mg/mL）為陰性對照組和陽性對照組，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。用PBS洗滌載菌玻片2 次，室溫干燥后置于Gluta固定液（電子顯微鏡專用，2.5%）中固定4 h。棄上清液，PBS洗滌2 次，依次加入35%（體積分?jǐn)?shù)，后同）、50%、75%、90%乙醇溶液和無水乙醇進(jìn)行梯度脫水，而后加入叔丁醇脫去乙醇，30 min/次。最后，用陰極噴涂鍍金，在20.0 kV加速電壓下用SEM觀察菌體形態(tài)變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗設(shè)置3 個平行，數(shù)據(jù)采用Excel 2019軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Bonferroni檢驗進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。采用GraphPrism 9軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZSEOs的得率

采用水蒸氣蒸餾法對產(chǎn)自重慶江津、貴州德江、四川金陽和云南昭通的青花椒進(jìn)行精油提取，ZSEOs得率分別為（5.21±0.15）%、（7.27±0.03）%、（6.61±0.36）%和（10.21±0.22）%，均為淡黃色油狀液體。

2.2 ZSEOs的化學(xué)組成

重慶江津（ZS1EO）、貴州德江（ZS2EO）、四川金陽（ZS3EO）和云南昭通（ZS4EO）4 個產(chǎn)地的ZSEOs中相對含量在0.1%以上的化學(xué)成分分別有63、64、59 種和63 種，分別占精油總量的97.49%、97.65%、96.99%和98.05%（表1）。所有ZSEOs樣品中均富含芳樟醇（18.86%～22.00%）、檸檬烯（9.56%～14.84%）、β-月桂烯（5.79%～12.70%）、檜烯（5.49%～8.93%）和β-蒎烯（3.33%～6.41%）。其次，橙花叔醇在ZS1EO（4.80%）、ZS2EO（4.09%）、ZS3EO（3.00%）中相對含量較高而在ZS4EO中相對含量較低（0.14%），ZS4EO中β-側(cè)柏酮（6.19%）的相對含量較高。

表1 我國4 個產(chǎn)地青花椒精油的化學(xué)成分GC×GC-TOFMS分析結(jié)果Table 1 Chemical compositions of ZSEOs from four different production areas as determined by GC × GC-TOFMS

續(xù)表1

青花椒的精油提取率和化學(xué)組分間的差異可能與青花椒的品種、產(chǎn)地、提取與檢測方法等因素有關(guān)[19]。Li Ren等[4]采用同時蒸餾萃取法從西雙版納青花椒果皮中提取精油，精油得率為4.8%，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定出25 種化合物（98.29%），主要成分為芳樟醇（79.00%）、檸檬烯（4.97%）和β-側(cè)柏烯（4.29%）。此外，麻琳等[20]采用水蒸氣蒸餾法從江津青花椒果皮中提取精油，精油得率為2.4%，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定出34 種化合物（99.55%），其中R-樅松油烯（36.51%）和芳樟醇（21.60%）含量豐富。本研究中4 個產(chǎn)地的ZSEOs中均含有芳樟醇（18.86%～22.00%）和檸檬烯（9.56%～14.84%），但未檢出β-側(cè)柏烯和R-樅松油烯。

芳樟醇（C10H18O）是一種廣泛存在于植物精油中的單萜烯醇，對P.aeruginosa、S. aureus等多種微生物具有抑菌活性[21]。Liu Ying等[11]研究表明S. sobrinus對檸檬烯較為敏感?；衔锓肿拥碾姾擅芏扰c其抑菌活性密切相關(guān)[22]。芳樟醇中負(fù)電荷主要集中在氧原子和碳原子上，且羥基官能團(tuán)上氧原子的電荷密度（密里根常數(shù)為-0.520 8）大于其他原子，因此更容易發(fā)生親電反應(yīng)，成為活性中心與菌體結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮抑菌作用。檸檬烯（C10H16）分子結(jié)構(gòu)中有2 個C＝C，雙鍵相鄰甲基上的碳原子密里根常數(shù)分別為-0.420 4和-0.352 1，電荷密度較大，具有成為菌體結(jié)合位點(diǎn)的可能性。此外，亦有體外研究表明β-石竹烯（0.26%～0.90%）可有效抑制S. mutans的生長[23]。值得一提的是，4 個產(chǎn)地青花椒精油中鑒定得到的其他組分，如α-蒎烯[24]（1.65%～2.59%）、(Z)-芳樟醇氧化物（呋喃）[25]（0.40%～1.13%）、(-)-氧化石竹烯[26]（0.21%～0.45%）等也被報道過具有良好的抑菌效果，表明本研究中含以上活性成分的ZSEOs也可能具有良好的抑菌活性。

2.3 ZSEOs的抑菌活性

2.3.1 抑菌圈直徑

由表2和圖2可知，受試ZSEOs對S. mutans、S. sanguinis和S. sobrinus的抑菌圈直徑范圍分別為13.41～17.73、15.18～20.95 mm和11.61～15.97 mm。S. sanguinis對ZSEOs的耐受力較弱，而S. sobrinus對ZSEOs的耐受力較強(qiáng)。值得注意的是，ZS1EO處理組的抑菌圈直徑均為最大值。ZS1EO對S. mutans的抑菌圈直徑（（17.73±0.22）mm）大于其對S. sobrinus的抑菌圈直徑（（15.97±0.70）mm），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。ZS1EO對S. sanguinis的抑菌圈直徑最大，為（20.95±0.40）mm，顯著大于其他精油處理組和陽性對照組（P＜0.05）。本研究中，95%乙醇溶液處理對3 種致齲菌幾乎均無抑制作用，相應(yīng)抑菌圈直徑與各ZSEOs處理組相比具有顯著差異（P＜0.05）。抑菌圈測定結(jié)果初步表明，ZSEOs對3 種致齲菌均有一定的體外抑制效果，其中ZS1EO的抑菌活性最為突出。

表2 青花椒精油對3 種致齲菌的抑菌圈直徑Table 2 Diameters of inhibition zones of ZSEOs against three cariogenic bacteria mm

圖2 青花椒精油對3 種致齲菌的抑菌圈Fig. 2 Inhibition zones of ZSEOs against three cariogenic bacteria

2.3.2 4 種ZSEOs的MIC和MBC

如表3所示，4 種ZSEOs對S. mutans、S. sanguinis和S. sobrinus的MIC范圍分別為1～2、0.5～2 mg/mL和1～4 mg/mL，MBC的范圍分別為1～4、1～4 mg/mL和2～8 mg/mL。ZSEOs對3 種鏈球菌有不同程度的抑制作用，其中ZS1EO的抑菌效果最優(yōu)，此結(jié)果與抑菌圈實(shí)驗結(jié)果基本一致。ZS1EO對S. sanguinis的MIC（0.5 mg/mL）最小，對S. mutans和S. sobrinus的MIC均為1 mg/mL。此外，S. sobrinus對ZSEOs的耐受力相對較強(qiáng)，ZS1EO對S. sobrinus的MBC為2 mg/mL。抑菌圈實(shí)驗結(jié)果、MIC和MBC實(shí)驗結(jié)果表明，4 種精油中ZS1EO對3 種致齲菌的抑菌活性最為突出。

表3 ZSEOs對3 種致齲菌的MIC和MBCTable 3 MIC and MBC of ZSEOs against three cariogenic bacteria

植物精油對致齲菌的抑菌活性可分為3 個程度：強(qiáng)（MIC＜0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同））、中等（MIC≤1.0%）和弱（MIC＞1.0%）[27]。基于此標(biāo)準(zhǔn)，在本研究中，ZS1EO（密度為0.83 g/mL）對S. sanguinis（MIC＝0.5 mg/mL）具有較強(qiáng)的抑制作用，對S. mutans（MIC＝1 mg/mL）和S. sobrinus（MIC＝1 mg/mL）具有中等的抑菌活性。Lemes等[28]評估了來檬（Citrus aurantifolia）果皮精油對6 種致齲菌的抑制作用，結(jié)果顯示來檬果皮精油對S. sanguinis和S. sobrinus的MIC分別為100 μg/mL和200 μg/mL，抑菌活性中等；對S. mutans的MIC為20 μg/mL，抑菌活性最強(qiáng)。不同精油對同種鏈球菌MIC與MBC的不同基本歸因于精油化學(xué)組成間的差異。同種精油對不同鏈球菌抑菌活性的差異可能和細(xì)菌應(yīng)激后的反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制以及精油發(fā)揮抑菌作用的機(jī)制差異有關(guān)。綜上，由于ZS1EO的抑菌活性最為明顯，因此選擇ZS1EO進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

2.3.3 致齲菌的生長曲線

ZS1EO對S. mutans、S. sanguinis和S. sobrinus生長曲線的影響如圖3所示。致齲菌生長經(jīng)歷了3 個明顯的階段，即延遲期、對數(shù)生長期和穩(wěn)定期。S. mutans和S. sanguinis的對數(shù)生長期在4 h出現(xiàn)，持續(xù)8 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。S. sobrinus的對數(shù)生長期在2 h出現(xiàn)，8 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。在延遲期將MIC ZS1EO與細(xì)菌共同孵育，隨著時間的延長，3 種致齲菌的OD值均與各自初始OD值持平，表明菌體停止增殖。于對數(shù)生長期初始階段加入MIC ZS1EO，3 種鏈球菌的OD值均呈下降趨勢。隨著ZS1EO作用時間的延長，S. mutans和S. sanguinis的生長幾乎完全被抑制。

圖3 MIC ZS1EO對3 種致齲菌生長曲線的影響Fig. 3 Effect of MIC ZS1EO on the growth curves of three cariogenic bacteria

生長曲線可以部分反映細(xì)菌在一定環(huán)境下的生長和增殖情況[21]。本實(shí)驗結(jié)果表明，在細(xì)菌生長的延遲期和對數(shù)生長期初始階段添加MIC ZS1EO均可導(dǎo)致3 種致齲菌停止增殖，ZS1EO對3 種致齲菌的抑菌活性較強(qiáng)。此結(jié)果與Lei Hong等[3]報道的花椒精油對E. coli生長的抑制效果類似，在延遲期和對數(shù)生長期加入0.5×MIC（12 mg/mL）精油，E. coli的生長均會受到影響。

2.3.4 致齲菌微觀結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

通過SEM觀察3 株致齲菌經(jīng)MIC ZS1EO處理24 h后的形態(tài)變化，初步探討ZS1EO的抑菌機(jī)制，結(jié)果如圖4所示。與陰性對照組相比，處理后的細(xì)菌菌體發(fā)生了明顯的形態(tài)學(xué)改變。陰性對照組鏈球菌細(xì)胞膜表面整齊、光滑、致密，鏈狀結(jié)構(gòu)完整。然而，經(jīng)ZS1EO處理后的3 種致齲菌斷鏈現(xiàn)象明顯；菌體細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞膜形狀異常，細(xì)胞膜出現(xiàn)凹陷、破裂和皺縮；菌體相互黏附。此結(jié)果與陽性對照組的結(jié)果相似。值得注意的是，與其他菌株相比，S. sanguinis菌株對ZS1EO的耐受力最弱，菌體破壞程度更明顯，與抑菌圈實(shí)驗和MIC、MBC實(shí)驗結(jié)果相吻合。以上結(jié)果表明，ZS1EO對3 株致齲菌抑制作用由強(qiáng)到弱依次為S. sanguinis、S. mutans、S. sobrinus。

圖4 3 種致齲菌的SEM圖像（×20 000）Fig. 4 SEM micrographs of three cariogenic bacteria (× 20 000)

植物精油的親脂性使精油能夠穿過細(xì)菌的細(xì)胞膜和線粒體膜，破壞細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)，使膜通透性增強(qiáng)，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物外泄，從而導(dǎo)致菌體形態(tài)的改變[29]。陳夢玲等[30]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)2×MIC（0.5%）牛至精油處理后，腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）表面破裂、外膜剝落，最終導(dǎo)致菌體死亡。SEM觀察結(jié)果表明，ZS1EO可以通過破壞3 種致齲菌的鏈狀結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜完整性，使菌體產(chǎn)生不可逆損傷，從而發(fā)揮其抑菌作用。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗利用GC×GC-TOFMS技術(shù)分析了4 個產(chǎn)地ZSEOs的化學(xué)組成，并評估了ZSEOs對3 種常見致齲菌的體外抑菌活性。研究結(jié)果表明，受試ZSEOs的主要成分為芳樟醇（18.86%～22.00%）、檸檬烯（9.56%～14.84%）、β-月桂烯（5.79%～12.70%）、檜烯（5.49%～8.93%）和β-蒎烯（3.33%～6.41%）。4 個產(chǎn)地的ZSEOs對S. mutans、S. sanguinis和S. sobrinus生長均有不同程度的抑制效果，其中ZS1EO的抑菌活性最強(qiáng)。ZS1EO對3 種致齲菌的抑菌活性強(qiáng)度：S. sanguinis＞S. mutans＞S. sobrinus。此外，精油處理后3 種致齲菌鏈狀結(jié)構(gòu)的破壞以及細(xì)胞膜凹陷、破損所致菌體的不可逆損傷可以初步解釋ZS1EO發(fā)揮其抑菌活性的機(jī)制。鑒于此，作為我國傳統(tǒng)香辛料使用的青花椒可能是一種潛在的齲病抗菌劑的來源。本研究僅評價了ZSEOs對3 種致齲菌的體外抑菌活性，ZSEOs的抑菌成分及其抑菌機(jī)制有待進(jìn)一步研究。