朱雪麗 林照坤 王麗蕓

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染科（?？?570102）

慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是目前呈世界性流行的感染性疾病之一，而我國(guó)一般人群中CHB流行率為5%～6%，是全世界CHB流行率靠前的國(guó)家之一[1-2]。目前CHB患者早期開展核（苷）酸類似物（nucleotide analogs，NAs）治療是國(guó)內(nèi)外多個(gè)指南中共同推薦治療方式之一，這一方式對(duì)改善CHB患者預(yù)后，延長(zhǎng)生存周期有積極的意義[3-4]。但也有相關(guān)研究結(jié)果顯示，部分患者可能由于感染乙肝病毒的特殊性或自身基因作用下導(dǎo)致對(duì)NAs反應(yīng)效果欠佳，需要盡早進(jìn)行其他抗病毒治療方式避免病毒大量復(fù)制帶來的嚴(yán)重后果[5]。由于目前臨床上NAs類藥物種類繁多，如果針對(duì)所有NAs藥物進(jìn)行耐藥相關(guān)基因檢測(cè)價(jià)格高昂；而通過臨床藥物治療反應(yīng)來確定藥物療效不佳又耗時(shí)較長(zhǎng)，以上兩種方案對(duì)于制定特殊種類CHB患者治療方案參考方式可行性不高，故臨床上急需一類臨床指標(biāo)對(duì)CHB患者NAs治療效果進(jìn)行預(yù)測(cè)[6]。HBV前基因組RNA（HBV pre-genomic RNA，HBV pgRNA）是HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（Covalently closed circular DNA，cccDNA）復(fù)制啟動(dòng)的首個(gè)RNA，對(duì)于體內(nèi)cccDNA活性具有較好的反應(yīng)作用，已經(jīng)有研究指出HBV pgRNA與CHB患者體內(nèi)HBsAg及HBeAg改變情況存在相關(guān)性[7]。故本次研究將其運(yùn)用于評(píng)價(jià)HBV患者NAs治療反應(yīng)，旨在為尋找更加便捷的CHB患者治療方案評(píng)價(jià)方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2020年1月至2021年6月在我院門診確診的CHB患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》中對(duì)于CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)達(dá)到NAs治療相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[8]；（2）年齡≥ 18周歲；（3）患者及家屬簽署知情同意書，并確定不會(huì)接受其他治療方案；（4）首次接受抗CHB治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有肝硬化；（2）合并其他短期內(nèi)不可治愈的肝臟疾?。ㄈ纾鹤陨砻庖咝愿窝?、脂肪性肝病及其他類型病毒性肝炎等）；（3）合并惡性腫瘤疾病；（4）需要長(zhǎng)期口服可能造成肝腎功能損傷的藥物；（5）預(yù)計(jì)生存期限達(dá)不到治療周期；（6）依從性較差，不能完成病毒控制方案。符合上述條件并報(bào)我院倫理委員會(huì)審核通過后共計(jì)納入CHB患者237例。其中平均年齡（37.49±6.54）歲；男135例，女102例。

1.2 方法

1.2.1 NAs治療方案參考《慢性乙型肝炎臨床治愈（功能性治愈）專家共識(shí)》中相關(guān)治療標(biāo)準(zhǔn)，建議對(duì)首次開始NAs治療方案患者選擇藥物為恩替卡韋（entecavir，ETV）、富馬酸替諾福韋酯（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）及富馬酸丙酚替諾福韋（tenofovir alafenamide fumarate，TAF），并針對(duì)可能發(fā)生NAs應(yīng)答不佳方案評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，本研究治療周期為24周[9]。

1.2.2 治療期間復(fù)診方法要求患者每4周到院復(fù)查一次丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、乙型肝炎病毒DNA定量、HBsAg定性及HBeAg定性。

1.2.3 HBV pgRNA檢測(cè)所有患者抽取清晨空腹靜脈血后分離血清，而后使用DP438型磁珠法病毒RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)）對(duì)血清內(nèi)HBV-RNA進(jìn)行提取，而后使用K1622型cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（ThermoFisher公司生產(chǎn)）對(duì)其中的HBV pgRNA片段（引物序列：5'-ATTCTCAGACCGTAGCACACGACACCGAGATTGAGATCTTCTGCGCGAC-3'）轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后使用Prism 7500序列檢測(cè)系統(tǒng)（ABI公司生產(chǎn)）和Taq-Man探針通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)樣本內(nèi)的HBV pgRNA濃度進(jìn)行檢測(cè)。其中，HBV pgRNA對(duì)比引物序列（F：5'-ATTCTCAGACCGTAGCACACGACACCGAGATTGAGATCTTCTGCGCGAC-3'；R：5'-AYAGACCATCAAATGCCC-3'）；HBV pgRNA檢測(cè)引物及探針序列（F：5'-AYAGACCATCAAATGCCC-3'，R：5'-ATTCTCAGACCGTAGCACACGACACCGAGATTGAGATCTTCTGCGCGAC-3'，探針：5'-FAMCTTATCAACACTTCCGGARACTGTTGTTAGACBHQ1-3'）；PCR反應(yīng)混體系（20 μL）：10 μL 預(yù)混液，1 μL cDNA，1 μL 引物，0.25 μL TaqMan探針，而后加蒸餾水配齊；反應(yīng)過程：預(yù)變性（45℃，10 min），然后以變性（95℃，15 s），退火（60℃，1 min），延伸（72℃，20 s）進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 NAs治療反應(yīng)性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《慢性乙型肝炎臨床治愈（功能性治愈）專家共識(shí)》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[9]，結(jié)合臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)暫定NAs反應(yīng)性為病毒學(xué)完全應(yīng)答、部分應(yīng)答和應(yīng)答不佳三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，具體如下：（1）病毒學(xué)完全應(yīng)答（以下簡(jiǎn)稱完全應(yīng)答）治療結(jié)束后血清HBV-DNA達(dá)到檢測(cè)下限；（2）病毒學(xué)部分應(yīng)答（以下簡(jiǎn)稱部分應(yīng)答）治療結(jié)束后血清HBV-DNA較基線下降幅度＞2 lg IU/mL，但仍然可以檢測(cè)到；（3）病毒學(xué)應(yīng)答不佳（以下簡(jiǎn)稱應(yīng)答不佳）治療結(jié)束后血清HBV-DNA較基線下降幅度＜2 lg IU/mL。

1.3.2 臨床資料包括：年齡、性別構(gòu)成、BMI、飲酒史、NAs方案、高血壓、糖尿病。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)室檢查資料均為基線指標(biāo)，包括：ALT、天門東氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TBiL）、HBsAg定量、HBeAg定量、HBeAb定量、HBcAb定量、HBV-DNA、肝纖維化 4因子指數(shù)（FIB-4）、HBV pgRNA。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)處理采用SPSS 25.0軟件。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（）表示，符合正態(tài)分布的三組間比較采用方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；通過logistic回歸分析治療反應(yīng)的影響因素，預(yù)測(cè)價(jià)值通過構(gòu)建ROC曲線進(jìn)行，使用曲線下面積（Area under the curve，AUC）對(duì)預(yù)測(cè)價(jià)值進(jìn)行表示；P＜0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分組情況及各組患者一般資料比較截止2021年12月所有患者治療期滿，共計(jì)207例患者完成本次研究規(guī)定的治療及隨訪方案，完成率為87.34%，其中87例（42.28%）患者達(dá)到完全應(yīng)答，79例（38.16%）達(dá)到部分應(yīng)答，41例（19.81%）患者為應(yīng)答不佳，故最終分組為完全應(yīng)答（n=87）、部分應(yīng)答（n=79）及應(yīng)答不佳（n=41）。比較三組患者一般資料，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組患者一般資料比較Tab.1 Comparison of general data of three groups of patients 例（%）

2.2 三組患者實(shí)驗(yàn)室檢查資料比較三組患者間HBV-DNA、HBV pgRNA、HBsAg、HBeAg及HBeAb差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；組間比較結(jié)果顯示：應(yīng)答不佳組患者HBV-DNA、HBV pgRNA、HB-sAg、HBeAg均高于其他兩組，而HBeAb低于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；部分應(yīng)答組HBV pgRNA高于完全應(yīng)答組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而部分應(yīng)答組和完全應(yīng)答組患者HBVDNA、HBsAg、HBeAg及HBeAb比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 三組患者實(shí)驗(yàn)室檢查資料比較Tab.2 Comparison of laboratory examination data of three groups of patients±s

表2 三組患者實(shí)驗(yàn)室檢查資料比較Tab.2 Comparison of laboratory examination data of three groups of patients±s

注：與完全應(yīng)答組比較，*P＜0.05，與部分應(yīng)答組比較，#P＜0.05

項(xiàng)目ALT（U/L）AST（U/L）TBiL（μmol/L）HBV-DNA（lg UI/mL）FIB-4 HBV pgRNA（lg拷貝/mL）HBsAg（lg UI/mL）HBeAg（S/CO）HBeAb（S/CO）HBcAb（S/CO）完全應(yīng)答（n=87）77.34±12.78 34.15±7.53 22.37±5.98 6.04±1.01 0.97±0.23 4.23±0.97 2.74±0.63 1.07±0.25 4.04±0.78 0.53±0.19部分應(yīng)答（n=79）79.63±13.24 35.04±7.67 23.04±4.32 6.54±1.27 0.99±0.21 4.74±1.01*2.89±0.54 1.15±0.23 3.89±0.65 0.47±0.21應(yīng)答不佳（n=41）79.57±16.03 36.21±8.43 23.43±6.13 6.94±1.34*#0.98±0.14 5.21±1.09*#3.04±0.63*#1.24±0.27*#3.61±0.52*#0.51±0.24 F/χ2值0.698 1.022 0.619 8.710 0.193 14.045 3.947 7.313 6.997 1.746 P值0.499 0.369 0.539＜0.001 0.825＜0.001 0.021 0.001 0.001 0.177

2.3 治療反應(yīng)的相關(guān)因素分析以NAs治療反應(yīng)為因變量，以單因素分析P＜0.05的指標(biāo)作為自變量進(jìn)行有序logistic回歸分析，結(jié)果顯示：HBVDNA、HBV pgRNA、HBsAg、HBeAg是影響治療反應(yīng)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而HBeAb是影響治療反應(yīng)的獨(dú)立保護(hù)因素（P＜0.05），見表3。

表3 治療反應(yīng)的相關(guān)因素分析Tab.3 Analysis of related factors of treatment response

2.4 各指標(biāo)對(duì)治療反應(yīng)預(yù)測(cè)價(jià)值分析將反應(yīng)為完全及部分應(yīng)答患者歸為有反應(yīng)，而應(yīng)答不佳患者歸為無反應(yīng)，而后以logistic回歸分析存在差異的指標(biāo)作為預(yù)測(cè)指標(biāo)建立預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的ROC曲線，結(jié)果顯示HBV pgRNA對(duì)NAs治療反應(yīng)預(yù)測(cè)的AUC明顯優(yōu)于其余四個(gè)指標(biāo)（P＜0.05），見表4、圖1。

表4 各指標(biāo)對(duì)治療反應(yīng)預(yù)測(cè)價(jià)值Tab.4 The predictive value of each index on treatment response

3 討論

通過人體免疫學(xué)及病毒學(xué)生物標(biāo)志物對(duì)治療起始、臨床治愈或治療失敗進(jìn)行預(yù)測(cè)是目前臨床上針對(duì)CHB患者亟待解決的問題[10]。現(xiàn)有的CHB患者生物學(xué)標(biāo)志物中，HBsAg定量、HBeAg定量、HBV-DNA、HBV-cccDNA及HBV pgRNA已經(jīng)被證實(shí)與CHB患者相關(guān)抗體-抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換、病毒載量及病情密切相關(guān)的指標(biāo)，故在上述指標(biāo)中尋找預(yù)測(cè)CHB治療效果參照物的可行性較好[11-12]。

本次研究結(jié)果中，三組患者間HBV-DNA、HBV pgRNA、HBsAg、HBeAg及HBeAb存在顯著差異，但是組間比較分析顯示，僅HBV pgRNA在完全應(yīng)答與部分應(yīng)答組患者間存在差異。主要原因可能是由于HBV pgRNA是反應(yīng)HBV病毒載量及活動(dòng)性效果最佳的指標(biāo)。在本次研究中，所采用的基線HBV抗原、抗體指標(biāo)在治療前對(duì)完全應(yīng)答及部分應(yīng)答的CHB患者比較上并無顯著差異，說明在治療前血清抗原、抗體指標(biāo)對(duì)于療效的評(píng)價(jià)作用有限。同時(shí)過長(zhǎng)期臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，CHB相關(guān)抗原-抗體在經(jīng)過治療后發(fā)生轉(zhuǎn)換的概率較低，在AGARWAL等[13]的研究中，經(jīng)過48周單藥NAs治療后，僅有1%的患者發(fā)生HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，HBeAg轉(zhuǎn)換率也僅在10%，故通過抗原-抗體相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行療效評(píng)價(jià)有著花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、效率低的特點(diǎn)，對(duì)于NAs反應(yīng)的預(yù)測(cè)效果可能不佳。而對(duì)于三組患者基線HBV-DNA的研究結(jié)果也提示，此指標(biāo)在完全應(yīng)答組與部分應(yīng)答組比較無顯著差異。既往研究中指出，HBV-DNA雖然是反應(yīng)CHB患者HBV病毒載量的主要指標(biāo)，絕大部分患者在HBV-DNA持續(xù)轉(zhuǎn)陰較長(zhǎng)時(shí)間后，并不會(huì)出現(xiàn)HBsAg轉(zhuǎn)陰達(dá)到臨床治愈的情況，這充分說明HBV-DNA指標(biāo)對(duì)于CHB患者病情的反應(yīng)存在缺陷[14-15]。通過研究發(fā)現(xiàn)，HBV病毒進(jìn)入肝細(xì)胞后會(huì)形成HBV-cccDNA，而HBV-cccDNA是誘導(dǎo)HBV病毒復(fù)制的核心因素[16]。目前臨床常用的NAs對(duì)于HBV-cccDNA的作用幾乎不存在，其含量升高會(huì)導(dǎo)致HBV病毒大量復(fù)制，從而降低NAs對(duì)HBV病毒殺傷效果[17]。由此可見雖然目前臨床上將HBV-DNA作為病毒學(xué)療效的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，但此指標(biāo)的基線值對(duì)于CHB患者病毒量反應(yīng)的效能會(huì)因?yàn)镠BV-cccDNA存在而發(fā)生偏倚，這也是目前臨床CHB治療過程中病毒學(xué)復(fù)發(fā)、臨床復(fù)發(fā)率居高不下的重要原因。

在多因素分析中，HBV-DNA、HBV pgRNA、HBsAg、HBeAg及HBeAb均是影響NAs治療反應(yīng)情況的獨(dú)立影響因素，但在ROC曲線結(jié)果顯示，HBV pgRNA預(yù)測(cè)的AUC明顯高于其他4個(gè)指標(biāo)。HBV-DNA及其他3個(gè)抗原、抗體指標(biāo)對(duì)CHB患者療效分析的局限性在前一段已經(jīng)敘述，故在此不再贅述。而分析HBV pgRNA對(duì)CHB患者預(yù)測(cè)的優(yōu)勢(shì)主要有以下幾個(gè)方面：首先，HBV pgRNA是HBV-cccDNA啟動(dòng)時(shí)復(fù)制的第一個(gè)片段，對(duì)于之后的HBV-DNA含量存在著明顯的影響，其對(duì)與HBV的特異性較好[18-19]；其次，HBV-cccDNA作為共存于人體的基因片段，其本身活性對(duì)于HBV-DNA含量存在影響，而HBV pgRNA由于其位置、特異性等因素，是HBV-cccDNA活性反應(yīng)較好的指標(biāo)之一，故其基線水平對(duì)于疾病發(fā)展過程中HBV-DNA復(fù)制情況也具有較好的反應(yīng)[20-21]。通過以上研究不難發(fā)現(xiàn)HBV pgRNA由于其特異性及對(duì)HBV-cccDNA活性的區(qū)分作用，可以避免NAs治療過程中未激活HBV-cccDNA及NAs敏感HBV-DNA對(duì)療效的影響從而更好的判斷NAs對(duì)CHB患者的治療效果。

本次研究由于經(jīng)費(fèi)及時(shí)間限制，為單中心、小樣本量研究，同時(shí)未將HBV-cccDNA指標(biāo)納入本次研究，故結(jié)果分析尚存在一定偏倚；再者為避免肝纖維化導(dǎo)致NAs治療效果不明顯的可能性，將合并肝纖維化及硬化患者排除了本次研究，導(dǎo)致對(duì)于所有CHB患者NAs反應(yīng)預(yù)測(cè)存在一定局限性；最后由于目前臨床研究對(duì)于HBV pgRNA檢測(cè)方法尚未有統(tǒng)一性指導(dǎo)文件，故本次研究參考NCBI中Gene后采用的最原始的HBV pgRNA檢測(cè)方式，導(dǎo)致推廣到臨床應(yīng)用上存在實(shí)際困難。以上不足在今后的研究中會(huì)進(jìn)一步改進(jìn)，但不妨礙通過本次研究得出HBV pgRNA與CHB患者NAs治療后反應(yīng)顯著相關(guān)的結(jié)論。