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        HBV pgRNA表達(dá)水平與慢性乙型肝炎患者核(苷)酸類似物治療反應(yīng)性的相關(guān)性

        2022-11-30 04:12:14朱雪麗林照坤王麗蕓
        實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2022年20期
        關(guān)鍵詞:差異研究

        朱雪麗 林照坤 王麗蕓

        海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染科(???570102)

        慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是目前呈世界性流行的感染性疾病之一,而我國(guó)一般人群中CHB流行率為5%~6%,是全世界CHB流行率靠前的國(guó)家之一[1-2]。目前CHB患者早期開展核(苷)酸類似物(nucleotide analogs,NAs)治療是國(guó)內(nèi)外多個(gè)指南中共同推薦治療方式之一,這一方式對(duì)改善CHB患者預(yù)后,延長(zhǎng)生存周期有積極的意義[3-4]。但也有相關(guān)研究結(jié)果顯示,部分患者可能由于感染乙肝病毒的特殊性或自身基因作用下導(dǎo)致對(duì)NAs反應(yīng)效果欠佳,需要盡早進(jìn)行其他抗病毒治療方式避免病毒大量復(fù)制帶來的嚴(yán)重后果[5]。由于目前臨床上NAs類藥物種類繁多,如果針對(duì)所有NAs藥物進(jìn)行耐藥相關(guān)基因檢測(cè)價(jià)格高昂;而通過臨床藥物治療反應(yīng)來確定藥物療效不佳又耗時(shí)較長(zhǎng),以上兩種方案對(duì)于制定特殊種類CHB患者治療方案參考方式可行性不高,故臨床上急需一類臨床指標(biāo)對(duì)CHB患者NAs治療效果進(jìn)行預(yù)測(cè)[6]。HBV前基因組RNA(HBV pre-genomic RNA,HBV pgRNA)是HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circular DNA,cccDNA)復(fù)制啟動(dòng)的首個(gè)RNA,對(duì)于體內(nèi)cccDNA活性具有較好的反應(yīng)作用,已經(jīng)有研究指出HBV pgRNA與CHB患者體內(nèi)HBsAg及HBeAg改變情況存在相關(guān)性[7]。故本次研究將其運(yùn)用于評(píng)價(jià)HBV患者NAs治療反應(yīng),旨在為尋找更加便捷的CHB患者治療方案評(píng)價(jià)方法。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料選擇2020年1月至2021年6月在我院門診確診的CHB患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》中對(duì)于CHB的診斷標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)達(dá)到NAs治療相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[8];(2)年齡≥ 18周歲;(3)患者及家屬簽署知情同意書,并確定不會(huì)接受其他治療方案;(4)首次接受抗CHB治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并有肝硬化;(2)合并其他短期內(nèi)不可治愈的肝臟疾?。ㄈ纾鹤陨砻庖咝愿窝?、脂肪性肝病及其他類型病毒性肝炎等);(3)合并惡性腫瘤疾病;(4)需要長(zhǎng)期口服可能造成肝腎功能損傷的藥物;(5)預(yù)計(jì)生存期限達(dá)不到治療周期;(6)依從性較差,不能完成病毒控制方案。符合上述條件并報(bào)我院倫理委員會(huì)審核通過后共計(jì)納入CHB患者237例。其中平均年齡(37.49±6.54)歲;男135例,女102例。

        1.2 方法

        1.2.1 NAs治療方案參考《慢性乙型肝炎臨床治愈(功能性治愈)專家共識(shí)》中相關(guān)治療標(biāo)準(zhǔn),建議對(duì)首次開始NAs治療方案患者選擇藥物為恩替卡韋(entecavir,ETV)、富馬酸替諾福韋酯(tenofovir disoproxil fumarate,TDF)及富馬酸丙酚替諾福韋(tenofovir alafenamide fumarate,TAF),并針對(duì)可能發(fā)生NAs應(yīng)答不佳方案評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),本研究治療周期為24周[9]。

        1.2.2 治療期間復(fù)診方法要求患者每4周到院復(fù)查一次丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、乙型肝炎病毒DNA定量、HBsAg定性及HBeAg定性。

        1.2.3 HBV pgRNA檢測(cè)所有患者抽取清晨空腹靜脈血后分離血清,而后使用DP438型磁珠法病毒RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司生產(chǎn))對(duì)血清內(nèi)HBV-RNA進(jìn)行提取,而后使用K1622型cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ThermoFisher公司生產(chǎn))對(duì)其中的HBV pgRNA片段(引物序列:5'-ATTCTCAGACCGTAGCACACGACACCGAGATTGAGATCTTCTGCGCGAC-3')轉(zhuǎn)錄為cDNA,最后使用Prism 7500序列檢測(cè)系統(tǒng)(ABI公司生產(chǎn))和Taq-Man探針通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)樣本內(nèi)的HBV pgRNA濃度進(jìn)行檢測(cè)。其中,HBV pgRNA對(duì)比引物序列(F:5'-ATTCTCAGACCGTAGCACACGACACCGAGATTGAGATCTTCTGCGCGAC-3';R:5'-AYAGACCATCAAATGCCC-3');HBV pgRNA檢測(cè)引物及探針序列(F:5'-AYAGACCATCAAATGCCC-3',R:5'-ATTCTCAGACCGTAGCACACGACACCGAGATTGAGATCTTCTGCGCGAC-3',探針:5'-FAMCTTATCAACACTTCCGGARACTGTTGTTAGACBHQ1-3');PCR反應(yīng)混體系(20 μL):10 μL 預(yù)混液,1 μL cDNA,1 μL 引物,0.25 μL TaqMan探針,而后加蒸餾水配齊;反應(yīng)過程:預(yù)變性(45℃,10 min),然后以變性(95℃,15 s),退火(60℃,1 min),延伸(72℃,20 s)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

        1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

        1.3.1 NAs治療反應(yīng)性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《慢性乙型肝炎臨床治愈(功能性治愈)專家共識(shí)》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[9],結(jié)合臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)暫定NAs反應(yīng)性為病毒學(xué)完全應(yīng)答、部分應(yīng)答和應(yīng)答不佳三個(gè)標(biāo)準(zhǔn),具體如下:(1)病毒學(xué)完全應(yīng)答(以下簡(jiǎn)稱完全應(yīng)答)治療結(jié)束后血清HBV-DNA達(dá)到檢測(cè)下限;(2)病毒學(xué)部分應(yīng)答(以下簡(jiǎn)稱部分應(yīng)答)治療結(jié)束后血清HBV-DNA較基線下降幅度>2 lg IU/mL,但仍然可以檢測(cè)到;(3)病毒學(xué)應(yīng)答不佳(以下簡(jiǎn)稱應(yīng)答不佳)治療結(jié)束后血清HBV-DNA較基線下降幅度<2 lg IU/mL。

        1.3.2 臨床資料包括:年齡、性別構(gòu)成、BMI、飲酒史、NAs方案、高血壓、糖尿病。

        1.3.3 實(shí)驗(yàn)室檢查資料均為基線指標(biāo),包括:ALT、天門東氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBiL)、HBsAg定量、HBeAg定量、HBeAb定量、HBcAb定量、HBV-DNA、肝纖維化 4因子指數(shù)(FIB-4)、HBV pgRNA。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)處理采用SPSS 25.0軟件。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn),等級(jí)資料采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn);計(jì)量資料以()表示,符合正態(tài)分布的三組間比較采用方差分析,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),不符合正態(tài)分布的組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn);通過logistic回歸分析治療反應(yīng)的影響因素,預(yù)測(cè)價(jià)值通過構(gòu)建ROC曲線進(jìn)行,使用曲線下面積(Area under the curve,AUC)對(duì)預(yù)測(cè)價(jià)值進(jìn)行表示;P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 分組情況及各組患者一般資料比較截止2021年12月所有患者治療期滿,共計(jì)207例患者完成本次研究規(guī)定的治療及隨訪方案,完成率為87.34%,其中87例(42.28%)患者達(dá)到完全應(yīng)答,79例(38.16%)達(dá)到部分應(yīng)答,41例(19.81%)患者為應(yīng)答不佳,故最終分組為完全應(yīng)答(n=87)、部分應(yīng)答(n=79)及應(yīng)答不佳(n=41)。比較三組患者一般資料,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

        表1 三組患者一般資料比較Tab.1 Comparison of general data of three groups of patients 例(%)

        2.2 三組患者實(shí)驗(yàn)室檢查資料比較三組患者間HBV-DNA、HBV pgRNA、HBsAg、HBeAg及HBeAb差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);組間比較結(jié)果顯示:應(yīng)答不佳組患者HBV-DNA、HBV pgRNA、HB-sAg、HBeAg均高于其他兩組,而HBeAb低于其他兩組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);部分應(yīng)答組HBV pgRNA高于完全應(yīng)答組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而部分應(yīng)答組和完全應(yīng)答組患者HBVDNA、HBsAg、HBeAg及HBeAb比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

        表2 三組患者實(shí)驗(yàn)室檢查資料比較Tab.2 Comparison of laboratory examination data of three groups of patients±s

        表2 三組患者實(shí)驗(yàn)室檢查資料比較Tab.2 Comparison of laboratory examination data of three groups of patients±s

        注:與完全應(yīng)答組比較,*P<0.05,與部分應(yīng)答組比較,#P<0.05

        項(xiàng)目ALT(U/L)AST(U/L)TBiL(μmol/L)HBV-DNA(lg UI/mL)FIB-4 HBV pgRNA(lg拷貝/mL)HBsAg(lg UI/mL)HBeAg(S/CO)HBeAb(S/CO)HBcAb(S/CO)完全應(yīng)答(n=87)77.34±12.78 34.15±7.53 22.37±5.98 6.04±1.01 0.97±0.23 4.23±0.97 2.74±0.63 1.07±0.25 4.04±0.78 0.53±0.19部分應(yīng)答(n=79)79.63±13.24 35.04±7.67 23.04±4.32 6.54±1.27 0.99±0.21 4.74±1.01*2.89±0.54 1.15±0.23 3.89±0.65 0.47±0.21應(yīng)答不佳(n=41)79.57±16.03 36.21±8.43 23.43±6.13 6.94±1.34*#0.98±0.14 5.21±1.09*#3.04±0.63*#1.24±0.27*#3.61±0.52*#0.51±0.24 F/χ2值0.698 1.022 0.619 8.710 0.193 14.045 3.947 7.313 6.997 1.746 P值0.499 0.369 0.539<0.001 0.825<0.001 0.021 0.001 0.001 0.177

        2.3 治療反應(yīng)的相關(guān)因素分析以NAs治療反應(yīng)為因變量,以單因素分析P<0.05的指標(biāo)作為自變量進(jìn)行有序logistic回歸分析,結(jié)果顯示:HBVDNA、HBV pgRNA、HBsAg、HBeAg是影響治療反應(yīng)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,而HBeAb是影響治療反應(yīng)的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05),見表3。

        表3 治療反應(yīng)的相關(guān)因素分析Tab.3 Analysis of related factors of treatment response

        2.4 各指標(biāo)對(duì)治療反應(yīng)預(yù)測(cè)價(jià)值分析將反應(yīng)為完全及部分應(yīng)答患者歸為有反應(yīng),而應(yīng)答不佳患者歸為無反應(yīng),而后以logistic回歸分析存在差異的指標(biāo)作為預(yù)測(cè)指標(biāo)建立預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的ROC曲線,結(jié)果顯示HBV pgRNA對(duì)NAs治療反應(yīng)預(yù)測(cè)的AUC明顯優(yōu)于其余四個(gè)指標(biāo)(P<0.05),見表4、圖1。

        表4 各指標(biāo)對(duì)治療反應(yīng)預(yù)測(cè)價(jià)值Tab.4 The predictive value of each index on treatment response

        3 討論

        通過人體免疫學(xué)及病毒學(xué)生物標(biāo)志物對(duì)治療起始、臨床治愈或治療失敗進(jìn)行預(yù)測(cè)是目前臨床上針對(duì)CHB患者亟待解決的問題[10]。現(xiàn)有的CHB患者生物學(xué)標(biāo)志物中,HBsAg定量、HBeAg定量、HBV-DNA、HBV-cccDNA及HBV pgRNA已經(jīng)被證實(shí)與CHB患者相關(guān)抗體-抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換、病毒載量及病情密切相關(guān)的指標(biāo),故在上述指標(biāo)中尋找預(yù)測(cè)CHB治療效果參照物的可行性較好[11-12]。

        本次研究結(jié)果中,三組患者間HBV-DNA、HBV pgRNA、HBsAg、HBeAg及HBeAb存在顯著差異,但是組間比較分析顯示,僅HBV pgRNA在完全應(yīng)答與部分應(yīng)答組患者間存在差異。主要原因可能是由于HBV pgRNA是反應(yīng)HBV病毒載量及活動(dòng)性效果最佳的指標(biāo)。在本次研究中,所采用的基線HBV抗原、抗體指標(biāo)在治療前對(duì)完全應(yīng)答及部分應(yīng)答的CHB患者比較上并無顯著差異,說明在治療前血清抗原、抗體指標(biāo)對(duì)于療效的評(píng)價(jià)作用有限。同時(shí)過長(zhǎng)期臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn),CHB相關(guān)抗原-抗體在經(jīng)過治療后發(fā)生轉(zhuǎn)換的概率較低,在AGARWAL等[13]的研究中,經(jīng)過48周單藥NAs治療后,僅有1%的患者發(fā)生HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換,HBeAg轉(zhuǎn)換率也僅在10%,故通過抗原-抗體相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行療效評(píng)價(jià)有著花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、效率低的特點(diǎn),對(duì)于NAs反應(yīng)的預(yù)測(cè)效果可能不佳。而對(duì)于三組患者基線HBV-DNA的研究結(jié)果也提示,此指標(biāo)在完全應(yīng)答組與部分應(yīng)答組比較無顯著差異。既往研究中指出,HBV-DNA雖然是反應(yīng)CHB患者HBV病毒載量的主要指標(biāo),絕大部分患者在HBV-DNA持續(xù)轉(zhuǎn)陰較長(zhǎng)時(shí)間后,并不會(huì)出現(xiàn)HBsAg轉(zhuǎn)陰達(dá)到臨床治愈的情況,這充分說明HBV-DNA指標(biāo)對(duì)于CHB患者病情的反應(yīng)存在缺陷[14-15]。通過研究發(fā)現(xiàn),HBV病毒進(jìn)入肝細(xì)胞后會(huì)形成HBV-cccDNA,而HBV-cccDNA是誘導(dǎo)HBV病毒復(fù)制的核心因素[16]。目前臨床常用的NAs對(duì)于HBV-cccDNA的作用幾乎不存在,其含量升高會(huì)導(dǎo)致HBV病毒大量復(fù)制,從而降低NAs對(duì)HBV病毒殺傷效果[17]。由此可見雖然目前臨床上將HBV-DNA作為病毒學(xué)療效的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),但此指標(biāo)的基線值對(duì)于CHB患者病毒量反應(yīng)的效能會(huì)因?yàn)镠BV-cccDNA存在而發(fā)生偏倚,這也是目前臨床CHB治療過程中病毒學(xué)復(fù)發(fā)、臨床復(fù)發(fā)率居高不下的重要原因。

        在多因素分析中,HBV-DNA、HBV pgRNA、HBsAg、HBeAg及HBeAb均是影響NAs治療反應(yīng)情況的獨(dú)立影響因素,但在ROC曲線結(jié)果顯示,HBV pgRNA預(yù)測(cè)的AUC明顯高于其他4個(gè)指標(biāo)。HBV-DNA及其他3個(gè)抗原、抗體指標(biāo)對(duì)CHB患者療效分析的局限性在前一段已經(jīng)敘述,故在此不再贅述。而分析HBV pgRNA對(duì)CHB患者預(yù)測(cè)的優(yōu)勢(shì)主要有以下幾個(gè)方面:首先,HBV pgRNA是HBV-cccDNA啟動(dòng)時(shí)復(fù)制的第一個(gè)片段,對(duì)于之后的HBV-DNA含量存在著明顯的影響,其對(duì)與HBV的特異性較好[18-19];其次,HBV-cccDNA作為共存于人體的基因片段,其本身活性對(duì)于HBV-DNA含量存在影響,而HBV pgRNA由于其位置、特異性等因素,是HBV-cccDNA活性反應(yīng)較好的指標(biāo)之一,故其基線水平對(duì)于疾病發(fā)展過程中HBV-DNA復(fù)制情況也具有較好的反應(yīng)[20-21]。通過以上研究不難發(fā)現(xiàn)HBV pgRNA由于其特異性及對(duì)HBV-cccDNA活性的區(qū)分作用,可以避免NAs治療過程中未激活HBV-cccDNA及NAs敏感HBV-DNA對(duì)療效的影響從而更好的判斷NAs對(duì)CHB患者的治療效果。

        本次研究由于經(jīng)費(fèi)及時(shí)間限制,為單中心、小樣本量研究,同時(shí)未將HBV-cccDNA指標(biāo)納入本次研究,故結(jié)果分析尚存在一定偏倚;再者為避免肝纖維化導(dǎo)致NAs治療效果不明顯的可能性,將合并肝纖維化及硬化患者排除了本次研究,導(dǎo)致對(duì)于所有CHB患者NAs反應(yīng)預(yù)測(cè)存在一定局限性;最后由于目前臨床研究對(duì)于HBV pgRNA檢測(cè)方法尚未有統(tǒng)一性指導(dǎo)文件,故本次研究參考NCBI中Gene后采用的最原始的HBV pgRNA檢測(cè)方式,導(dǎo)致推廣到臨床應(yīng)用上存在實(shí)際困難。以上不足在今后的研究中會(huì)進(jìn)一步改進(jìn),但不妨礙通過本次研究得出HBV pgRNA與CHB患者NAs治療后反應(yīng)顯著相關(guān)的結(jié)論。

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