凌麗 張菁 張宗敏 令狐熙濤 王鈺瑩

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1老年醫(yī)學(xué)科，2骨科，3細(xì)胞工程室（貴州 遵義 563003）

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率分別位于惡性腫瘤的第5位和第3位，胃癌的不同發(fā)展階段是受多個(gè)基因調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程，其關(guān)鍵的基因調(diào)控過程包括抑癌基因失活、原癌基因激活及細(xì)胞周期相關(guān)基因的異常表達(dá)[1-4]。

同源域蛋白同源盒基因（homeodomain-only protein homeobox，HOPX）位于4號染色體（4q11-4q12）上，在人類正常組織中廣泛表達(dá)[5-6]。HOPX最初被認(rèn)為是一種調(diào)節(jié)心臟生長發(fā)育、誘導(dǎo)心力衰竭的基因，HOPX的表達(dá)下調(diào)將會引起心肌肥大和心力衰竭[7-8]。近年研究表明HOPX作為一種抑癌基因在多種腫瘤中低表達(dá)，能調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但HOPX在胃癌中的生物學(xué)作用及分子機(jī)制尚不清楚，本研究旨在探討HOPX在胃癌中的調(diào)控作用及機(jī)制[9-10]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床組織及細(xì)胞系臨床組織樣本來源于中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院接受手術(shù)的胃癌患者的癌組織及癌旁組織，手術(shù)切除后的組織標(biāo)本用液氮速凍后保存于-80℃冰箱，所有患者均簽署知情同意書。人胃癌細(xì)胞系（BGC823、HGC27、SGC7901、AGS、NKM45、NKM28、MGC803）和永生化人胃上皮細(xì)胞GES1，由廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，于本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑胎牛血清、胰蛋白酶、Opti-MEM、DMEM（GIBCO）；Lipofectamine 3000（Invitrogen）；HOPX質(zhì)粒（Longbio）；HOPX抗體（santa）；p-GSK-3β（Ser9）、GSK-3β、β-catenin、α-Tubulin及P84抗體（Abcam）；CCK-8試劑盒（DOJINDO）；結(jié)晶紫染料、細(xì)胞周期試劑盒、EdU試劑盒（碧云天）；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒、RT-qPCR試劑盒（Promega）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)所有細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 RNA提取及qRT-PCR按照Trizol說明書提取細(xì)胞及組織總RNA，用HiSciptⅢcDNA Sythesis Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SYBR Green染料法進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，以GAPDH作為內(nèi)參，使用公式2-△△CT計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達(dá)參考組織、細(xì)胞蛋白試劑盒說明書提取細(xì)胞和組織蛋白，BCA法定量蛋白含量。取30 μg蛋白行SDS-PAGE電泳，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h后5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜；1×TBST洗膜10 min×3次，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，1×TBST洗膜10 min×3次。加入ECL工作液對條帶進(jìn)行顯影。以α-Tubulin或P84為內(nèi)參，測定HOPX、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin及Cyclin D1的蛋白水平。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequence for real-time fluorescence quantitative PCR

1.2.4 構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株消化收集293T細(xì)胞，以2×106個(gè)/皿接種于10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行病毒包裝。取6 μg HOPX質(zhì)粒、3 μg psPAX2和2 μg PMD2.G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集上清病毒液，0.45 μm濾器過濾后感染胃癌細(xì)胞，48 h后加入濃度1 μg/mL的嘌呤霉素，完成穩(wěn)定細(xì)胞株篩選后，收集細(xì)胞總蛋白及RNA，qRT-PCR和Western blot檢測HOPX基因的過表達(dá)情況。

1.2.5 CCK-8測定細(xì)胞活性將HGC27/HOPX、BGC823/HOPX細(xì)胞及對照組細(xì)胞以1 000個(gè)/孔鋪于96孔板中，每孔體積100 μL，待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)基，隨后每孔加入100 μL含10%CCK-8的培養(yǎng)基孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值。每隔24 h檢測一次，連續(xù)檢測6 d。

1.2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分別將過表達(dá)HOPX的胃癌細(xì)胞及對照組細(xì)胞（500個(gè)）接種于6孔板中，隔兩天補(bǔ)100 μL新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)克隆形狀明顯時(shí)（＞50個(gè)細(xì)胞/克?。壢ヅ囵B(yǎng)基，PBS洗2次后甲醇固定15 min，再用1%結(jié)晶紫染色2 min，PBS洗滌后拍照統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期消化收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，待貼壁后換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞，70%乙醇固定，加入含有RNase的PI避光染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.8 EdU實(shí)驗(yàn)將5×104個(gè)細(xì)胞鋪于24孔板的圓玻片上，培養(yǎng)24 h后，參考BeyoClickTM EdU-488說明書，每孔加入500 μL濃度為20 μmol/L EdU的培養(yǎng)基孵育2 h，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.3%Triton X-100的PBS通透后加入Azide 488反應(yīng)；DAPI染核10 min，PBS清洗3次，將圓玻片反扣于滴加有防淬滅劑的載玻片上，熒光顯微鏡拍照，并對EdU陽性細(xì)胞率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)加入裂解液充分裂解細(xì)胞，取20 μL裂解液加至96孔培養(yǎng)板中，并設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將（50×）螢火蟲螢光素酶底物用對應(yīng)的緩沖液稀釋至1×工作液室溫孵育30 min，隨后加入螢光素酶工作液（100 μL/孔），輕晃混勻后在酶標(biāo)儀中測量螢光素酶數(shù)值，再加入海腎螢光素酶工作液（100 μL/孔），輕晃混勻后在酶標(biāo)儀中測量海腎螢光素酶的數(shù)值，最后分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理及分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每個(gè)都數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，組間比較采用雙側(cè)Student't檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均包含3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HOPX在胃癌組織及細(xì)胞中低表達(dá)采用Real Time-PCR及Western blot檢測HOPX在胃癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平，結(jié)果見圖1A，與人永生化胃上皮細(xì)胞GES1相比，7株胃癌細(xì)胞系中的HOPX mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。進(jìn)一步檢測HOPX在6對組織中的表達(dá)，結(jié)果表明胃癌組織中HOPX的表達(dá)顯著低于癌旁組織（圖1B，P＜0.01）。

2.2 HOPX抑制胃癌細(xì)胞的增殖構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)HOPX基因的HGC27和BGC823細(xì)胞株，并檢測其mRNA及蛋白表達(dá)水平以驗(yàn)證穩(wěn)定細(xì)胞株是否構(gòu)建成功，結(jié)果如圖2A所示，與對照組相比，HGC27/HOPX及BGC823/HOPX的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.01）。培養(yǎng)HGC27/HOPX及BGC823/HOPX細(xì)胞時(shí)，觀察到與對照組細(xì)胞相比，HGC27/HOPX及BGC823/HOPX細(xì)胞的增殖速度明顯減弱，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)HOPX的胃癌細(xì)胞的增殖速度明顯慢于對照組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2B）。同時(shí)過表達(dá)HOPX顯著抑制胃癌細(xì)胞的克隆形成能力（圖2C）。

2.3 HOPX抑制胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期利用EdU摻入實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化。結(jié)果見圖3A，HGC27/HOPX細(xì)胞中EdU陽性率為對照組的45.12%，BGC823/HOPX的細(xì)胞中EdU陽性率僅為對照組的37.65%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HGC27/HOPX的細(xì)胞處于S期的比例為21.08%，而HGC27/pSin的細(xì)胞處于S期的比例為40.80%；BGC823/HOPX的細(xì)胞處于S期的比例為20.23%，而BGC823/pSin的細(xì)胞處于S期的比例為42.72%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且各組間的G2/M期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，G0/G1期與S期的分布率呈反比（圖3B）。以上結(jié)果表明過表達(dá)HOPX可使胃癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期。

2.4 HOPX抑制Wnt信號通路Wnt信號通路參與腫瘤細(xì)胞的癌變并對維持腫瘤細(xì)胞的增殖至關(guān)重要，GSK3β是Wnt/β-catenin信號通路中的核心成分，GSK3β的Ser9位點(diǎn)被磷酸化是其活性下降的重要途徑。結(jié)果顯示，過表達(dá)HOPX后，GSK3β（Ser9）的磷酸化水平、β-catenin的表達(dá)水平及細(xì)胞周期促進(jìn)因子cyclin D1的表達(dá)水平均顯著降低（圖4A）；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HOPX可顯著降低β-catenin/TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活性（圖4B；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的表達(dá)量顯著減少，β-catenin蛋白由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核即發(fā)生核轉(zhuǎn)位的量減少（圖4C）。綜上所述，本研究結(jié)果表明過表達(dá)HOPX可能通過抑制GSK3β（Ser9）的磷酸化水平從而促進(jìn)β-catenin磷酸化進(jìn)而被蛋白酶體降解，并通過減少其下游靶基因細(xì)胞周期促進(jìn)因子cyclin D1的表達(dá)，最終達(dá)到抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力。

3 討論

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，近年來我國胃癌患者的發(fā)病年齡趨于年輕化，19～35歲的年輕胃癌患者明顯增多，總體發(fā)病率和病死率約超過全球平均水平的2倍[11-13]。雖然胃癌的治療效果隨早期診斷和綜合治療方案的改善得到一定程度提高，早期患者存活率經(jīng)治療后可提高至90%以上，但晚期胃癌患者的治療后存活率仍不超過30%[14-15]。大部分研究表明胃癌的進(jìn)展可能與基因突變、環(huán)境及生活飲食習(xí)慣改變等有關(guān)，然而，胃癌的主要發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明[16-18]。因此，尋找胃癌的早期診斷標(biāo)志物以達(dá)到盡早防治胃癌的發(fā)生發(fā)展，對于提高胃癌患者的預(yù)后至關(guān)重要。

HOPX基因在人類正常組織中廣泛表達(dá)，主要是由HOPX啟動(dòng)子高甲基化誘導(dǎo)形成，最初的研究發(fā)現(xiàn)HOPX基因是心臟生長發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因[7]，隨著研究深入，目前的研究表明HOPX在鼻咽癌、結(jié)腸癌及肺癌等腫瘤中呈低表達(dá)狀態(tài)[19-21]。鐘玉斌等[22]發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中HOPX的表達(dá)水平較正常支氣管組織顯著降低，且HOPX與患者臨床分期及TNM分期顯著相關(guān)，推測HOPX起著抑制非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的作用，有望成為非小細(xì)胞肺癌早期診斷及判定預(yù)后的一個(gè)新指標(biāo)。另外，任先越等[22]發(fā)現(xiàn)，HOPX啟動(dòng)子區(qū)在鼻咽癌細(xì)胞中呈高甲基化導(dǎo)致HOPX表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)HOPX后可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移能力并增強(qiáng)化療敏感性。由此推測HOPX在多種腫瘤中發(fā)揮著抑制腫瘤進(jìn)發(fā)展的作用。本研究通過Real time-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與永生化人胃上皮細(xì)胞GES1相比，HOPX在胃癌細(xì)胞中的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著減少，且HOPX在胃癌組織中的mRNA及蛋白表達(dá)水平較癌旁組織顯著減少。進(jìn)一步在體外構(gòu)建了過表達(dá)HOPX的穩(wěn)定胃癌細(xì)胞HGC27和BGC823株，隨后通過一系列生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)HOPX對胃癌細(xì)胞的增殖能力的影響，結(jié)果顯示過表達(dá)HOPX可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力，并可抑制胃癌細(xì)胞的周期運(yùn)行。

Wnt/β-catenin是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)關(guān)鍵信號通路，主要包括 Wnt、GSK-3β、β-catenin和TCF/LEF等細(xì)胞外轉(zhuǎn)錄因子[24-25]。在正常細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路通過GSK-3β磷酸化修飾后被降解，而在腫瘤細(xì)胞中，由于部分通路分子的缺失如GSK-3β的Ser9位點(diǎn)被磷酸化后活性下降，最終使β-catenin免于被降解[26]。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)HOPX后GSK3β（Ser9）的磷酸化水平及β-catenin的表達(dá)均顯著降低，胃癌細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的含量減少。表明HOPX可通過抑制GSK3β（Ser9）的磷酸化水平使β-catenin被泛素化酶降解，同時(shí)抑制β-catenin從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核而無法激活下游基因CyclinD1的轉(zhuǎn)錄，最終抑制胃癌細(xì)胞的增殖。

綜上所述，HOPX在胃癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，其機(jī)制是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖，因此，HOPX是一個(gè)評估胃癌進(jìn)展的潛在生物標(biāo)志物。