李澤樺 曾宇宏 馮麗蕓 闕冬冬 顏競

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院（廣州 510280）

在全球范圍內(nèi)，心血管疾病比任何其他單一疾病造成的死亡人數(shù)更多。心肌梗死（myocardial infarction，MI）是指由冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂，形成血栓堵塞引起的局部心肌急性缺血。心梗后心肌代償性肥大導(dǎo)致左心室重塑甚至進一步惡化成心力衰竭的不可逆病變，是發(fā)病率和死亡率最高的心血管疾病之一[1-2]。MI的發(fā)病機制復(fù)雜，既往研究[3]表明其主要與炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡等密切相關(guān)。免疫系統(tǒng)的激活與MI后的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，其中，巨噬細胞是MI后的主要應(yīng)答細胞，參與MI后多個環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)[4]。巨噬細胞具有功能可塑性，可極化成M1型和M2型兩種具有不同免疫功能的活化模式。M1型巨噬細胞可產(chǎn)生促炎因子（如TNF-α、IL-6、INOS），M2型巨噬細胞可產(chǎn)生抑炎因子（如CD206、IL-10、TGF-β），M1型巨噬細胞極化促進MI后心肌細胞損傷，而M2巨噬細胞極化則可抑制MI后心肌細胞損傷，在MI的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5-6]。腸道菌群代謝產(chǎn)物氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide，TMAO）通過炎癥反應(yīng)參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[7-8]。高水平的血漿TMAO是MI患者的心血管事件死亡風(fēng)險的獨立危險因素[9]。近期有研究[10]顯示，TMAO能夠激活巨噬細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型極化，并使促炎因子分泌增多，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究通過體內(nèi)外實驗，探索TMAO對MI后心室重構(gòu)的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑戊巴比妥鈉（Sigma），TMAO（Sigma），d9-TMAO（Sigma），小鼠CK-MB Elisa試劑盒（默沙克），小鼠cTnT Elisa試劑盒（默沙克），小鼠NT-proBNP Elisa試劑盒（默沙克），小鼠TNF-α Elisa試劑盒（默沙克），小鼠IL-6 Elisa試劑盒（默沙克），WGA（Thermo Fisher Scientific），TUNEL試劑盒（Thermo Fisher Scientific），MYH6一抗（Abcam），CX43一抗（Abcam），羊抗兔IgG二抗（Bioworld），羊抗鼠IgG二抗（Bioworld）。

1.1.2 實驗動物與分組雄性6～8周齡C57BL/6（體質(zhì)量20～25 g），購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。普通飼料和高膽堿飼料（1.2%）均購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。所有小鼠均飼養(yǎng)于SPF級動物房中，飼養(yǎng)期間常規(guī)飲水，Sham組和MI組喂食普通飼料，TMAO組喂養(yǎng)高膽堿飼料，每組各25只小鼠。

1.2 方法

1.2.1 小鼠MI模型的建立參照既往動物造模方法，結(jié)扎小鼠冠狀動脈左前降支構(gòu)建MI模型[11]。腹腔注射1.5%的戊巴比妥鈉（0.5 mL/mg）將小鼠麻醉后，進行備皮、固定和氣管插管，并將呼吸機的頻率設(shè)為110 bpm。打開胸腔，在小鼠心臟左心耳下方2 mm處用8-0號線結(jié)扎冠狀動脈前降支。Sham組只打開胸腔而不進行結(jié)扎。

1.2.2 TMAO檢測采集所有小鼠的血漿，加入含有內(nèi)標d9-TMAO（1 mmol/L）的甲醇沉淀蛋白。離心（4℃，15 000g/min）15 min后取上清，采用穩(wěn)定同位素稀釋液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）進行檢測。所有TMAO色譜數(shù)據(jù)均按照峰面積由Aglient提供的化學(xué)工作站計算所得。

1.2.3 心功能檢查各組小鼠經(jīng)2%異氟烷麻醉后，仰臥位固定在VisualSonicsVevo 2100加熱板電極上，去除胸前區(qū)皮毛并在左心室短軸斷面進行左心室乳頭肌水平M型超聲心動圖檢測，記錄以下參數(shù)：左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室射血分數(shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）。

1.2.4 心肌酶譜、心衰指標和炎癥指標檢測各組小鼠經(jīng)眼眶靜脈叢取血，4℃低溫靜置2 h后，3 000 r/min離心15 min取上清。按照ELISA試劑盒說明書檢測小鼠血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白T（cTnT）、N端前腦鈉素（NT-proBNP）、白介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平。

1.2.5 心肌組織病理改變觀察取各組小鼠心臟置入4%多聚甲醛中固定24 h后行常規(guī)石蠟包埋和連續(xù)切片。所獲心臟切片分別行Masson染色觀察心肌纖維化程度；WGA熒光染色觀察心肌細胞大?。籘UNEL染色觀察心肌細胞凋亡壞死程度，最后置于顯微鏡下拍攝。

1.2.6 免疫熒光染色取各組小鼠的心臟組織進行冰凍切片，經(jīng)歷固定、抗原修復(fù)、血清封閉之后，分別加入Myh6一抗、Cx43一抗和對應(yīng)的熒光二抗，DAPI染核后封片。最后置于激光掃描共聚焦顯微鏡下拍攝。

1.2.7 RT-qPCR檢測收集各組小鼠心臟組織，用TRIzol法提取梗死周邊區(qū)心肌細胞的總RNA。采用TaKaRa試劑盒，按照試劑說明書方法將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，然后用SYBR green試劑配成20 μL的反應(yīng)體系，置入ABI7500熒光定量PCR儀上進行RT-qPCR反應(yīng)。最后，以GAPDH作為內(nèi)參基因，以△△Ct法計算M1型巨噬細胞標志物TNF-α、IL-6、INOS及M2型巨噬細胞標志物CD206、IL-10和TGF-β的mRNA表達水平。所用引物見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequence for RT-qPCR

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料用（）表示。三組間差異使用單因素方差分析，滿足方差齊性的用Tukey檢驗，不滿足方差齊性的則采用Dunnett-t3檢驗，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMAO促進MI小鼠心肌損傷構(gòu)建小鼠MI模型，并在術(shù)后喂食含有1.2%膽堿的高膽堿飲食21 d（圖1A）。LC-MS結(jié)果提示，TMAO組小鼠的血清TMAO水平顯著升高，提示高膽堿飲食干預(yù)有效（圖1B）。同時，血清心肌酶譜檢測結(jié)果表明，TMAO促進MI小鼠心肌酶CK-MB及cTnT增加（圖1C、D）。Masson染色結(jié)果表示，與MI組相比，TMAO組心肌梗死面積明顯增加（圖1E）。通過組織TUNEL染色檢測心肌組織細胞凋亡水平，如圖1F所示，MI組小鼠TUNEL陽性細胞的比例相較于Sham組有顯著增加，MI+TMAO組TUNEL陽性細胞的比例對比MI組更高，提示TMAO能顯著促進心梗后心肌細胞凋亡。以上結(jié)果表明TMAO可加重MI小鼠心肌損傷。

腸道菌群及其代謝物TMAO與動脈粥樣硬化、心力衰竭、高血壓和心律失常等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-8，19]。既往的研究也發(fā)現(xiàn)TMAO促進血管鈣化、心肌肥大的發(fā)生發(fā)展[20-23]。臨床研究表明，高水平的血漿TMAO是MI患者的心血管事件死亡風(fēng)險的獨立危險因素[9]。

2.2 TMAO促進小鼠MI后心室重構(gòu)心臟彩超結(jié)果顯示，與Sham組比較，MI組小鼠LVESD、LVEDD均顯著升高，LVEF、LVFS均顯著降低；與MI組比較，TMAO組小鼠LVESD、LVEDD升高，LVEF、LVFS降低（圖2A、B），提示TMAO促進小鼠MI后心功能障礙。WGA染色同樣證實TMAO促進MI小鼠的心肌肥大程度。見圖2C、D，與MI組比，MI+TMAO組的心肌細胞面積明顯增大。血清NT-proBNP結(jié)果表明，TMAO可加劇MI小鼠心室重構(gòu)后心衰（圖2E）。以上結(jié)果表明TMAO可加重小鼠MI心室重構(gòu)。

2.3 TMAO對MI小鼠心肌細胞縫隙連接蛋白Cx43表達的影響Cx43表達高低可以判斷細胞與細胞之間的連接完整性。Myh6蛋白特異性表達于心肌細胞，對心臟切片進行Myh6染色可以區(qū)分心肌細胞與其他細胞。見圖3，MI組和TMAO組小鼠Myh6蛋白排列紊亂，部分消失。Cx43在正常心肌組織中（Sham組）中廣泛表達，而在MI組小鼠心肌組織中表達下降，而MI+TMAO組Cx43表達比MI組顯著下降。以上結(jié)果提示TMAO使MI后Cx43的表達顯著下降，從而減少心肌細胞之間的縫隙連接，說明TMAO破壞心肌細胞間的完整性。

2.4 TMAO促進小鼠MI后心肌炎癥反應(yīng)ELISA檢測各組小鼠血清炎癥因子水平，相較于Sham組，MI組血清IL-6和TNF-α水平升高；相較于MI組，MI+TMAO組血清IL-6和TNF-α水平降低（圖4A、B）。與 Sham組相比，MI組TNF-α、IL-6、INOS、CD206、IL-10、TGF-β相對表達量明顯升高；與MI組比較，TMAO組M1巨噬細胞標志物TNF-α、IL-6、INOS的mRNA表達水平顯著升高，而M2巨噬細胞標志物CD206、IL-10、TGF-β相對表達量顯著降低（圖4C-H）。以上結(jié)果提示TMAO能顯著誘導(dǎo)MI小鼠M1型巨噬細胞極化，促進炎癥反應(yīng)。

3 討論

近年來，MI的發(fā)病率和致死率仍處于上升階段，是威脅國民身體健康的重要因素[11-12]。然而，即使控制MI的相關(guān)危險因素，目前對MI后心室重構(gòu)的防治尚無太多的方法，減輕心肌損傷及改善心功能一直是MI研究的重點難點。研究[13-14]表明，免疫系統(tǒng)在MI炎癥反應(yīng)始動階段到后期纖維化重塑階段起重要的調(diào)控作用。為了應(yīng)對MI后心肌細胞死亡和基質(zhì)降解，促炎階段和抗炎階段都是心肌愈合所必需的。在炎癥早期，促炎因子誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型轉(zhuǎn)化，并進一步引起各類促炎因子的大量釋放，主導(dǎo)吞噬損傷部位的凋亡和壞死心肌細胞；而在炎癥消退期間，巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化并釋放大量抗炎因子，這些抗炎因子又進一步促進M2型巨噬細胞的形成，促進心肌組織修復(fù)[15]。其中，促炎階段的持續(xù)時間和程度對梗死面積大小和心室重塑具有關(guān)鍵影響，因此，MI疾病過程中巨噬細胞M1表型早期轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型對心功能具有顯著的改善作用[16-18]。

目前的研究表明，TMAO能夠激活巨噬細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。例如，TMAO可誘導(dǎo)骨髓來源巨噬細胞中的M1極化，從而加重腎纖維化的嚴重程度[24]。同時，在動物實驗中，TMAO通過誘導(dǎo)小鼠M1型巨噬細胞極化加重同種異體移植物抗宿主疾病[10]。反之，抑制TMAO可促進巨噬細胞M2極化，從而增強了頸動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性[25]。然而，關(guān)于TMAO是否通過促進MI后巨噬細胞極化參與心肌損傷的機制研究卻鮮少報道。本研究通過高膽堿飲食誘導(dǎo)MI小鼠血漿中TMAO形成。伴隨著TMAO水平升高，MI小鼠心肌組織的損傷及心室重構(gòu)顯著惡化。然而，TMAO能否在MI過程中對M1型巨噬細胞的極化產(chǎn)生作用還不完全清楚。為了進一步驗證，從梗死區(qū)周圍組織提取mRNA進行體外實驗。經(jīng)RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，術(shù)后21 d，小鼠心肌梗死周邊區(qū)組織的M1型巨噬細胞標志物IL-6、TNF-α和INOS和M2型巨噬細胞標志物CD206、IL-10和TGF-β的mRNA表達水平均高于Sham組，提示MI小鼠心肌存在明顯的巨噬細胞浸潤；TMAO組小鼠梗死區(qū)周圍組織M1型巨噬細胞標志物IL-6、TNF-α和INOS的mRNA水平顯著高于MI組，反之，M2型巨噬細胞標志物CD206、IL-10和TGF-β的mRNA水平顯著降低，提示TMAO的干預(yù)可能對心肌梗死區(qū)浸潤的巨噬細胞向M1型轉(zhuǎn)化起促進作用，令心肌梗死后的炎癥反應(yīng)加劇。

隨著巨噬細胞極化和心肌梗死相關(guān)研究的深入，基于巨噬細胞調(diào)控炎癥防治急性心肌梗死的策略越來越受到廣泛的重視。本研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群代謝產(chǎn)物TMAO通過調(diào)節(jié)M1型巨噬細胞極化可加重心肌組織炎癥反應(yīng)及MI后心室重構(gòu)，具有一定的臨床意義，但TMAO調(diào)控巨噬細胞極化的多效性及其在MI轉(zhuǎn)歸和預(yù)后的具體作用機制尚未明確，仍需進行更深入的探究。

綜上所述，TMAO通過誘導(dǎo)M1巨噬細胞極化，加重炎癥反應(yīng)，促進MI后心肌損傷及心室重構(gòu)。減少高膽堿飲食攝入，以及靶向抑制體內(nèi)TMAO生成，可能對提升MI患者的預(yù)后提供新的思路。